凝结芽孢杆菌生物量及产芽孢发酵条件优化

刘其酉，张巧毅，林元山

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128）

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种同型乳酸发酵菌（Payot 等，1999）；在营养缺失和环境恶劣的条件下可以形成芽孢，具有很强的抗逆性和长时间的商品货架期（Hyronimus 等，2000），在畜牧业中广泛应用，常作为饲料添加剂，可以改善畜禽肠道健康（朱明明等，2022 ；牛自康等，2019）。凝结芽孢杆菌的芽孢具有高度抗逆性，不仅能顺利通过动物的胃肠道，还能耐受加工过程中的高温、高压、高机械剪切力等环境，减少生产和保存期间的菌体损失（Bagkar 等，2021 ；Haldar 等，2020）。因此，在工业生产中，生产的主要目标是其芽孢体。目前凝结芽孢杆菌工业化发酵水平芽孢数为3.0×109CFU/mL（涂家霖等，2021），无法满足现在日益增长的对凝结芽孢杆菌的需求，限制了该菌种适用面。本试验通过三步法逐步进行优化，平衡培养条件，提高凝结芽孢杆菌的生物量和芽孢数，缩短整个产芽孢周期，为后续的工业化生产提供技术和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 菌种：湖南农业大学农业生物工程研究所筛选保藏的凝结芽孢杆菌（Lys 274）。

种子培养基：玉米淀粉10 g/L，葡萄糖2 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L（固体培养基，添加琼脂20 g/L）。

基础培养基：玉米淀粉20 g/L，酵母膏20 g/L。

发酵培养基：在基础培养基中添加需要的碳源、氮源和无机盐。

1.2 仪器与设备 电子分析天平（CAV812），高压蒸汽灭菌锅（ES-315），振荡培养箱（ZQLY-180N），三用电热恒温水箱（HHW21.420A Ⅱ），722 型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 培养方法 初始培养条件：pH=7.0、装液量100 mL、棉球塞封口、接种量为2%（v/v ：体积比）、35℃，200 r/m 培养44 h。

1.3.2 计数方法 活菌数测定：参照周德庆（1986）的方法，以十倍稀释法进行涂布计数。芽孢数测定：80℃水浴加热10 min，再以10 倍稀释法进行涂布计数。

1.3.3 发酵条件单因素优化 分别将基础培养基的初始pH 设置为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，8.0（1 M HCl 和NaOH 调pH）；培养温度设置为28、30、32、35、37、40℃，其余按初始条件培养。

1.3.4 培养基碳氮源优化 选取葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油和糊精替代基础培养基的碳源（5 g/L）培养；选取酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、黄豆粉、玉米蛋白粉、硫酸铵、硝酸铵替代基础培养基氮源（10 g/L）培养；选取结果较优秀的碳源和氮源进行混合正交试验。

1.3.5 培养基金属离子优化 在优化的复合培养基中分别加入CaCl22 g/L，MgCl22 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO42 g/L，MnSO4·H2O 0.2 g/L，FeCl3·6H2O 0.2 g/L，FeCl2·4H2O 0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，以优化的发酵条件进行培养。选择能促进产芽孢的金属离子进行正交试验优化，并对优化结果进行验证。

2 结果与分析

2.1 生长曲线绘制 每2 h 测定发酵液的OD600数值，绘制凝结芽孢杆菌Lys 274 的生长曲线。由图1 可知，Lys 274 在0 ～8 h 为生长停滞期；10 ～18 h 为生长对数期；20 ～40 h 为菌体生长的相对稳定期，并于22 h 达到第一个高峰，32 h后Lys 274 由于营养不足，显微镜观察菌体开始转向芽孢化，导致OD600的吸光值再次升高，直至42 h 达到最高峰，然后开始呈下降趋势，进入衰亡期。确定凝结芽孢杆菌Lys 274 的种子液培养基培养时间为20 h，培养44 h 进行生物量和芽孢涂布计数为适宜。

图1 凝结芽孢杆菌Lys 274 生长曲线

2.2 发酵条件单因素优化 由图2 可知，在初始条件下，培养的凝结芽孢杆菌生物量为2.70×108CFU/mL 和芽孢数为6.15×107CFU/mL，芽孢率达22.78%。确定最适培养条件为初始pH=6.0、37 ℃培养44 h。优化后得到5.15×108CFU/mL 的生物量和1.15×108CFU/mL 的芽孢数，芽孢率达22.33%。

图2 发酵条件对凝结芽孢杆菌Lys 274 菌体数和芽孢数的影响

2.3 培养基碳源、氮源优化 由图3 可知，确定最适碳氮源质量百分比为1% ：2%，选择玉米淀粉、葡萄糖、乳糖为培养基的混合碳源；选择酵母膏、牛肉膏、蛋白胨（具有加快菌株生长速率效果）为培养基的复合氮源。

图3 碳源、氮源单因素对凝结芽孢杆菌Lys 274 菌体数和芽孢数的影响

将11 因素2 水平[L12（211）] 正交试验进行变形设计混合正交试验表[L12（22×44）] 设计培养基，具体试验设计和试验结果见表1。综合分析，选择最优方案：A1D2E3C3B2F2进行验证，得到4.2×109CFU/mL 的生物量和4.7×108CFU/mL的芽孢数，芽孢率11.19%。

表1 混合正交试验设计及试验结果

2.4 金属离子对菌体数和芽孢数的影响 由图4 可知，选择MnSO4、FeCl2、KH2PO4进行[L9（34）] 正交试验设计培养基，试验设计和试验结果见表2。综合考虑选择芽孢数的最优方案为B2A3C3作为最终优化，经试验验证最终得到5.60×109CFU/mL 的生物量和4.47×109CFU/mL 的芽孢数，芽孢率达79.21%。

表2 金属离子正交试验设计及试验结果

图4 金属离子对凝结芽孢杆菌Lys 274 菌体数和芽孢数的影响

3 结论

本试验通过三步法依次确定凝结芽孢杆菌Lys 274 最适的生长条件，碳氮源组成及比例和金属离子的种类及数量，阶段性提高Lys 274 的生物量和芽孢数。优化后的培养基配方为：玉米淀粉10 g/L、葡萄糖2 g/L、乳糖5 g/L、酵母膏20 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉膏5 g/L、磷酸二氢钾4 g/L，硫酸锰0.2 g/L、氯化亚铁0.4 g/L，培养条件为：装液量50 mL、pH 6.0、八层纱布封口、37℃培养44 h。摇瓶发酵可得到5.60×109CFU/mL的生物量和4.47×109CFU/mL 的芽孢数，芽孢率达79.21%，对比初始条件培养的凝结芽孢杆菌，生物量提高20.74 倍，芽孢数提高72.68 倍。