兔窦房结切片制作方法的探究和形态学特点的观察

袁慧杰,潘昭良,袁广明,冯炼强,陈大堤,秦丽娜

中山大学 中山医学院,广州 510080

窦房结(SAN)是心脏传导系统的重要组成部分,位于上腔静脉口与右心房交界处,在界沟上端的心外膜下,是心脏最高级的起搏组织[1-2]。窦房结由起搏细胞(P细胞)、过度细胞(T 细胞)、心肌细胞、心脏成纤维细胞等实质以及窦房结动脉、神经、血管和胶原、网状、弹性纤维等间质共同组成[3]。由于窦房结组织不规则,形态不典型,不同种属动物SAN位置变异多等因素,该类标本的取材和制作是难点。而标准、规范的组织学切片不仅是保证实验教学质量的前提,对科研及临床都是必不可少的[4]。本研究采用连续切片的方法获得兔SAN 石蜡切片,并采用不同的染色方法对窦房结切片进行染色,经过多次实验获得了较满意的染色效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康新西兰大白兔10只,雌雄不拘,3月龄,体质量2.5～3.0 kg,SPF级,由中山大学中山医学院实验动物中心提供。生产许可证号:SCXK(粤)2011-0029。饲养条件:实验动物随意进食、自由饮水,室内环境温度在20～25 ℃,相对湿度35%～75%。动物实验方案由中山大学伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂

组织包埋机(Thermo HISTOSTAR),石蜡切片机(LEICA RM2235,德国Leica公司),光学显微镜(Motic BA210Digital)。戊巴比妥钠溶液(w=3%),多聚甲醛溶液(φ=4%),盐酸酒精分化液(φ=1%),伊红水溶液(w=0.5%),磷钼酸溶液(w=1%),醋酸苯胺蓝液(φ=2%),冰醋酸水溶液(φ=1%)。Harris苏木素液,Bouin氏固定液,天青石蓝液,Mayer苏木精液,丽春红酸性品红溶液(以上溶液均为自备)[5]。

1.3 兔SAN组织取材和切片

取健康新西兰大白兔,戊巴比妥钠溶液(w=3%)以1 mL/kg的剂量进行静脉注射麻醉,之后固定于兔台上,从耳缘静脉注入空气栓塞致死,于胸前进行脱毛、消毒,后迅速剖开心腔,剪开心包,找到右上腔静脉,用白色缝合线标记,取出完整心脏。然后将心室横向剪去一半,用生理盐水冲出心腔积液,剪开上、下腔静脉,取上腔静脉与右心房交界处的界沟组织,下至下腔静脉口区域(即包括界沟组织与上、下腔静脉根部)。将切取的兔SAN 组织标本迅速用多聚甲醛溶液(φ=4%)固定48 h,之后进行实验室修块。大小视组织形状,按2 cm×2 cm×0.5 cm的原则置于包埋盒内,铅笔写上标志。多聚甲醛溶液(φ=4%)再固定一定时间后,用φ=70%、80%、90%、95%的乙醇及无水乙醇依次进行梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,用LEICA RM2235切片机进行连续切片,切片厚度5 μm。

1.4 SAN组织染色

每10张取1张切片进行HE染色,光学显微镜下观察是否含有SAN 组织;取含有SAN 组织的阳性切片,每相邻的2张切片为一组;一张进行常规HE染色,一张进行改良Masson三色染色;中性树胶封固后,在光学显微镜下观察。

1.4.1 兔SAN 组织HE染色

石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡脱蜡各10 min,再经过无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ和φ=95%、90%的乙醇各浸泡5 min,φ=80%、70%的乙醇和蒸馏水各浸泡2 min水化;Harris苏木素染色10 min使细胞核着色,自来水流水洗5 min蓝化;盐酸酒精分化液(φ=1%)分化数秒,分化后的切片再流水洗30

min反蓝;之后将切片放入伊红水溶液(w=0.5%)中染色5 min,蒸馏水稍洗;再经φ=70%、80%、90%的乙醇及无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ浸泡各2 min,进行上行梯度脱水;最后切片入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明处理各10 min,中性树胶封片,光学显微镜下观察[6-7]。

1.4.2 兔SAN 组织改良Masson三色染色

石蜡切片经二甲苯、酒精等常规脱蜡至水化(参照HE染色);置入Bouin氏固定液室温作用一晚进行媒染,然后流水冲洗至切片上的黄色消失;天青石蓝液滴染2 min,蒸馏水稍洗1 min;Mayer苏木精液滴染5 min,蒸馏水稍洗;盐酸酒精分化液(φ=1%)分化3 s,流水冲洗10～20 min;丽春红酸性品红溶液滴染5 min,蒸馏水稍洗;磷钼酸溶液(w=1%)处理5 min——根据需要可适当延长时间;甩去磷钼酸溶液不洗,滴醋酸苯胺蓝液(φ=2%)复染5 min;冰醋酸水溶液(φ=1%)处理2 min,去除上液;切片经φ=70%、80%、90%、95%的乙醇溶液脱水各5 s,再经无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水各10 s,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各2 min,中性树胶固封,光学显微镜下观察。

2 结果

2.1 兔SAN的位置及形态

根据兔SAN 的解剖学结构来定位取材,观察连续切片。结果表明,兔SAN 主要位于上腔静脉与右心房界沟的静脉窦侧,结的长轴与界沟平行。光学显微镜下观察,兔心脏SAN 区域组织结构较为疏松,染色也比较浅淡,与周围的心房肌等界限清晰、易于区分,且SAN 靠近心外膜,与心内膜之间隔以右心房的心肌而不直接相邻(见图1)。

图1 兔SAN组织连续切片结果(改良Masson三色染色)

2.2 兔SAN动脉的形态学特点

窦房结中心有一条较粗的窦房结动脉,围绕该动脉周围的细小的肌纤维构成窦房结的主体。本实验中的10例大白兔SAN 区均观察到了SAN 动脉,为1～3条不等,动脉壁外膜含有丰富的胶原纤维,这使得SAN动脉壁显著增厚,动脉壁胶原纤维与结内胶原纤维网相互连接,外围常见P细胞、T细胞围绕(见图2)。

图2 兔SAN内动脉和胶原纤维

2.3 兔SAN内的细胞类型和形态学特点

SAN内部主要由起搏细胞(P 细胞)、移行细胞(T 细胞)和少量心房肌细胞构成。P 细胞多位于SAN的中央,外形呈圆形、椭圆形或多边形,散在或成群分布;细胞核大,约占细胞直径的二分之一,多呈圆形或椭圆形,可见1～2各核仁;核周有空泡状,胞浆透亮,染色浅淡,无肌纹。T 细胞又称过渡细胞,数量较少,主要位于窦房结的外周,结的中央亦会有少量散在分布,其大小、形态、位置等均介于 P细胞与心房肌细胞之间,有中间过渡性质;T细胞多呈不规则长圆柱形,比一般心房肌细胞短,界限不清晰,核长形或椭圆形;细胞内含肌原纤维,偶见横纹,染色也介于 P 细胞与心房肌细胞之间。普通心房肌细胞,主要位于心内膜侧,为长柱形或长梭形,有明显横纹,胞核较长且位于细胞中央,胞浆染色较深(见图3)。

图3 兔SAN内的P细胞、T细胞、心肌细胞(HE染色)

2.4 兔SAN间质的形态学特点

兔心脏SAN组织中还含有大量的胶原纤维和纤维细胞,胶原纤维与肌纤维的鉴别染色是病理特殊染色中的重要方法。Masson三色法染色结果显示:兔SAN内部以蓝色的胶原纤维为支架,交错成网,各种细胞成分就散布于网状支架的间隙中,胞核呈黑蓝色。SAN动脉管壁也含有丰富的胶原纤维,使管壁增厚,这些胶原纤维与周围组织中的胶原纤维网相互连接,将结细胞分隔成许多细胞群。在HE染色中除了细胞核蓝染以外,所有组织均红色,胶原纤维等成分不易观察。而Masson三色染色中胶原纤维被苯胺蓝染成蓝色,肌纤维被酸性品红染成红色,胞核呈黑蓝色,SAN中各结构分层、分类显示,清晰明了(见图2A)。

3 讨论

兔心脏SAN 由于位置隐蔽,通过肉眼难以观察,根据目前的文献报道,不同种属动物SAN 位置虽然有差异[8],但都位于心脏上腔静脉和右心房的交界区域[9-12]。本实验通过在体打结的方法标记右上腔静脉,取兔心脏上腔静脉与右心房交界处的界沟组织进行连续切片,成功获得兔SAN 切片。说明上腔静脉在体打结法能够保证心脏离体后SAN定位的准确性,缩短取材的时间,而SAN 组织包埋于心肌组织中的特点也决定了只能通过连续切片才能获得SAN切片。

本实验通过HE染色和改良Masson三色染色法对兔SAN进行了形态学观察。传统HE染色能很好地显示SAN各细胞结构,但是在HE染色中除了细胞核蓝染以外,所有组织均红色,胶原纤维等成分不易观察。而改良Masson三色染色中,胶原纤维被苯胺蓝染成蓝色,肌纤维被酸性品红染成红色,胞核呈黑蓝色,对于成分结构复杂的结缔组织分层、分类显示,红蓝相间,清晰明了,更好的显示了SAN结构。两种方法可相互补充,相互支持,对于兔SAN区的鉴定均具有重要的作用。

在改良Masson三色染色法中,采用天青石蓝液和Mayer苏木精液代替原本方法中的Weigert铁苏木精染液进行细胞核染色,该两液稳定性好,染色效果佳,染液保存时间也更长。原法采用比布列西猩红和伊红混合液进行肌纤维染色,由于比布列西猩红比较难购得,且用前需要过滤,本法用丽春红酸性品红溶液代替。磷钼酸水溶液(w=1%)的作用一方面使染上红色的胶原纤维分化成无色或淡红色,而肌纤维、纤维素仍保持鲜红,另一方面对胶原纤维又起媒染作用,使胶原纤维与大分子染料的苯胺蓝液较易结合。苯胺蓝液染色后用冰醋酸(φ=1%)处理,目的是除去附于原浆内的蓝色,使染色鲜艳和清晰。用低浓度梯度酒精,代替三缸φ=95%的酒精,分色清悦,预防了因溶液交替更换所产生的破片龟裂、雾化之现象。

在兔SAN 形态学结构方面,与其他哺乳动物SAN成分的报道也基本一致[13-15]。主要由SAN 动脉、P细胞、T细胞、少量心房肌细胞以及包裹在动脉和细胞周围的结缔组织等构成。找到SAN 动脉是SAN定位的关键因素,结内的各种细胞成分形态也有明显区分,P细胞最小、核大,胞浆透亮且染色最浅;心肌细胞细长,有横纹,染色最深;T细胞主要位于结的外围区,形态,染色深浅均介于P细胞和心肌细胞之间。

综上所述,本方法能够准确的得到兔SAN 切片并且很好观察兔SAN 的不同结构,填补了教学标本空白,适用于病理学、组织胚胎学等学科的教学,同时为研究多种因素对 SAN 的损伤奠定了可靠的技术保障,具有一定的推广应用价值。