杜仲雄花粉总黄酮抗衰老作用

高梦珂,代俊俊,许世伟,李钦

河南大学 药学院,河南 开封 475000

随着人体年龄的增长,机体会逐渐发生功能及代谢方面的变化,抗氧化物酶和抗氧化物质合成速度和活力减弱,代谢产物丙二醛增多,体内产生和清除自由基的平衡被打破,造成自由基堆积,衰老加速。如果同时伴有病理性的改变,则称为衰老。衰老相关疾病如阿尔兹海默症、帕金森等,严重影响到老年人的生存及生活质量。随着科学技术的进步及生活条件的改善,人们在追求长寿的同时也越来越把目光聚焦在对自身健康的保障上[1-2]。黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中,是植物的次生代谢产物,具有抗氧化、预防癌症、调节免疫、预防心血管疾病、抗炎等作用。黄酮类化合物发挥抗氧化作用主要通过减少自由基的产生和清除自由基两种途径[3]。

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)为杜仲科杜仲属植物,是我国特有的名贵滋补药材,具有补肝肾、强筋骨,安胎的功能。现代研究表明杜仲主要含有黄酮类、环烯醚萜类、苯丙素类、多糖类、多酚类、木质素类活性成分,具有抗氧化、抗衰老、降血糖、调节血压、抗菌抗病毒等作用。黄酮类化合物为杜仲的主要活性成分之一,具有抗氧化、消除自由基、抑菌、抗过敏等作用[4-7]。目前对杜仲的研究主要聚焦于杜仲皮、叶、雄花,但对杜仲花粉的研究较少。查阅文献可知,杜仲雄花粉含有总黄酮、蛋白质、维生素等有效成分,在药用方面及保健品方面具有较高的利用价值[8]。为了更好地开发利用这一资源,本实验利用D-半乳糖建立衰老模型,探讨杜仲雄花粉总黄酮的抗衰老作用,旨在为杜仲雄花粉的开发利用及作用机制的研究提供一定的参考。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

杜仲雄花粉,河南芳捷农业发展有限公司。

D-半乳糖,北京索莱宝科技有限公司;维生素C,东北制药集团沈阳第一制药有限公司(5230205);冰醋酸,天津市富宇精细化工有限公司;丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA 法,A003-1-2),SOD试剂盒(A001-1-2),总抗氧化能力(T-AOC)检测试盒(ABTS法,A015-2-1),总蛋白定量测定试盒(BCA法,A045-4-2),南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物

雄性昆明小鼠,体质量14～16 g,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供,动物使用许可证编号为SCXK(京)2019-0010.

1.3 仪器与设备

电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;全波长酶标仪(Powerwave XS),美国ThermoScientific公司;ZS-001Morris 水迷宫,北京众实迪创科技有限公司;低温高速离心机,美国Thermo公司。

2 实验方法

2.1 杜仲雄花粉总黄酮提取物的制备

称取取杜仲雄花粉200 g加20倍70%乙醇,浸泡1 h;超声处理40 min后,60 ℃水浴加热30 min,过滤保留滤液。重复以上操作3次,合并滤液[9]。减压浓缩至浓度为0.2 g/mL(生药)作为上样溶液。采用NKA-9大孔树脂进行纯化,上样量1 BV,吸附6 h后,用5 BV蒸馏水以2 mL/min冲洗至洗脱液呈无色,然后用6 BV 70%乙醇以2 mL/min速度洗脱,保留洗脱液。减压浓缩后,采用聚酰胺(100～200目)进行二次纯化。采用蒸馏水、25%乙醇、50%乙醇进行梯度洗脱,保留50%乙醇洗脱液。回收溶剂,所得浸膏即为杜仲雄花粉总黄酮(FEF)提取物。采用紫外分光光度法测得黄酮含量为70.61%。

2.2 小鼠分组

雄性昆明小鼠60只,实验前适应性饲养1周,随机分成6组,每组10只,分别为正常组、模型组、杜仲雄花粉总黄酮低剂量组、杜仲雄花粉总黄酮中剂量组、杜仲雄花粉总黄酮高剂量组和阳性药组。

2.3 小鼠处理

每个供试实验组除正常组外,其余各组每日1次以D-半乳糖生理盐水溶液颈背部皮下注射,给药量400 (mg/kg)/d[10-13],正常组注射等体积的生理盐水,连续9周。自第5周开始杜仲雄花粉总黄酮低、中、高剂量组分别灌胃给予80、160、320(mg/kg)/d杜仲雄花粉总黄酮提取物(FEF)溶液[14-17],阳性药组灌胃维生素C 溶液100 (mg/kg)/d,正常组与模型组灌胃等体积的蒸馏水。各组实验小鼠自由饮食,室温(20±2)℃。总实验周期共9周。

2.4 Morris 水迷宫实验

于实验结束前6 d进行行为学试验。行为学共分为两部分:定位航行试验,空间探索试验。该实验期间继续给药。

1) 定位航行试验。将小鼠从测试象限中央面向池壁放入水中,并开始计时,小鼠找到平台并在平台上停留5 s记为试验结束,从小鼠入水到寻找到平台记为潜伏期。若小鼠60 s内不能寻找到平台,则将小鼠引导至平台上并停留15 s,潜伏期记为60 s。平台位于第一象限,每天依次将小鼠从二、三、四象限放入水中,连续训练5 d。

在施工中的桩体材料中加入一定量的高黏度刚性桩体，这种方法进行加固施工效果非常好，可以适用的范围也比较大，且不会受到气候条件的影响，加固之后就能够具备较强的承载性能[4]。

2) 空间探索试验。于行为学试验的第6天将平台从第一象限撤去,将小鼠从第四象限放入水中,记录60 s内小鼠的运动轨迹并进行分析[18]。

2.4 样品采集及器官处理

末次给药后禁食12 h,摘眼球取血,在4 ℃环境下静置,待血清析出后采用离心机3 500 r/min离心15 min,取血清待测。

采血后小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏、肾脏、肝脏、脑和心脏,用生理盐水清洗干净。肝脏、心脏、肾、脾称重,肝脏与脑组织-80 ℃冷冻保存。

2.5 小鼠脏器指数的测定

根据公式分别计算肾脏指数、肝脏指数和脾脏指数。

脏器指数(g/g)=组织质量(g)/小鼠体质量(g)。

2.6 生化指标测定

按照试剂盒说明书上的方法测定MDA 含量、SOD活力、总抗氧化能力。

2.7 数据处理与显著性分析

采用IBM SPSS Statisticsa 26数据分析软件进行统计分析,实验结果用表示,用LSD法进行显著性分析。

3 结果与分析

3.1 杜仲雄花粉总黄酮提取物对小鼠学习记忆能力的影响

Morris 水迷宫定位航行试验结果如图1～图4所示。

图1 定位航行试验中小鼠潜伏期

图2 第5天潜伏期

图3 空间探索实验中小鼠小鼠游泳轨迹图

图4 小鼠穿越原平台次数(次)

分析各组小鼠水迷宫实验数据可以发现,在定位航行试验中随着训练天数的增加,各组小鼠找到平台的时间均逐渐缩短,其中FEF低剂量组下降幅度最大,为69.14%,模型组最小,下降幅度为40.98%;分析第5天潜伏期数据可以发现,模型组小鼠潜伏期显著大于正常组(P＜0.001),表明模型组小鼠的空间学习记忆能力严重衰退。与模型组相比,阳性药组及杜仲雄花粉总黄酮低剂量组小鼠潜伏期显著缩短(P＜0.01),说明维生素C和杜仲雄花粉总黄酮可以改善D-半乳糖导致的学习记忆能力的衰退。

定位航行试验结束后,于次日进行空间探索试验,分析各组小鼠的游泳轨迹、原平台位置穿越次数,考察各组小鼠对原平台位置的记忆能力。

从运动路径可以看出,除模型组外其余各组入水后,经过一段时间的搜寻均能到达原平台所在位置,且多在平台所在象限区域活动,而模型组入水后,多沿池壁运动,不能准确到达原平台位置。通过对穿越原平台次数的分析,可以看出正常组与模型组有极显著性差异(P＜0.001),说明模型组小鼠的记忆能力严重下降,D-半乳糖可以对小鼠的记忆能力产生负面影响。

与模型组相比,阳性药组小鼠入水后,多在平台所在象限及邻近区域运动,且穿越平台的次数显著多于模型组(P＜0.01),说明阳性药组小鼠对原平台位置记忆较模型组准确,维生素C对小鼠记忆能力的下降有保护作用。杜仲雄花粉总黄酮高、中、低剂量组均穿越平台次数均与模型组有显著性差异,且中、低剂量组小鼠入水后能主动在原平台位置附近探索,很少在目标象限对侧象限搜索,表明杜仲雄花粉总黄酮提取物对D-半乳糖造成的小鼠记忆能力下降有一定的改善作用。

3.2 杜仲雄花粉总黄酮提取物对小鼠器官的影响

如图5所示,与正常组相比,模型组小鼠的肝脏指数极显著降低(P＜0.001),说明模型小鼠肝脏受到严重损伤。与模型组相比,阳性药组小鼠的肝脏指数极显著增加(P＜0.01),说明维生素C对D-半乳糖导致的小鼠肝损伤有很好的保护作用;与模型组相比,杜仲雄花粉总黄酮提取物中、低剂量组小鼠的肝脏指数显著增加,说明杜仲雄花粉总黄酮提取物对D-半乳糖导致的小鼠肝损伤有一定的保护作用。杜仲雄花粉总黄酮提取物高剂量组小鼠的肝脏指数虽有上升趋势,但无显著性差异。阳性药组及杜仲雄花粉总黄酮提取物组的肾脏和肝脏指数与模型组相比虽然有所上升但无显著性差异。

图5 各组小鼠脏器指数

3.3 杜仲雄花粉总黄酮提取物对小鼠生化指标的影响

3.3.1 小鼠组织和血清总抗氧化能力(T-AOC)测试结果

由表1可知,模型组小鼠脑、肝脏和血清中总抗氧化能力最弱,并且与正常组有显著性差异(P＜0.05),说明造模方法正确且衰老小鼠模型构建正确。杜仲雄花粉总黄酮高、中、低剂量组器官与血清中总抗氧化能力均与模型组形成显著性差异,其中总黄酮中剂量组的脑组织,肝脏,血清的总抗氧化能力均与模型组有极显著性差异。阳性药组脑组织和血清中总抗氧化能力与模型组形成显著性差异,但肝脏中总抗氧化能力与模型组相比没有统计学意义。以上实验结果表明杜仲雄花粉总黄酮提取物有助于D-半乳糖诱导衰老小鼠提高总抗氧化能力,对肝脏的作用最强且优于阳性对照药维生素C。

表1 小鼠组织和血清中T-AOC水平

3.3.2 小鼠组织和血清中SOD活力测试结果

由表2可知,模型组小鼠器官和血清中SOD活力均与正常组形成显著性差异(P＜0.05)。除杜仲雄花粉总黄酮高剂量组外,中、低剂量组小鼠器官及血清中SOD活力均与模型组形成显著性差异,杜仲雄花粉总黄酮低剂量组的脑、肝脏、血清中S0D 活力比模型组分别提高了79.18%、61.31%、12.96%,在脑组织中SOD活力提高最大。表明杜仲雄花粉总黄酮提取物有助于提高D-半乳糖致衰老小鼠的SOD 活力,对D-半乳糖造成的小鼠脑组织中SOD活力下降有较好的延缓效果。

表2 小鼠组织和血清中SOD水平

3.3.3 小鼠组织和血清中MDA含量测定结果

由表3可知模型组小鼠脑、肝脏、血清中MDA的含量均与正常组形成显著性差异,说明采用皮下注射D-半乳糖的方法可以加速小鼠的衰老。杜仲雄花粉总黄酮高、中、低剂量组小鼠脑及肝脏中MDA含量均低于模型组,且具有统计学意义(P＜0.05),表明杜仲雄花粉总黄酮有助于D-半乳糖致衰老小鼠清除脂质过氧化物,具有一定的抗氧化能力。

表3 小鼠组织和血清中MDA含量

以上结果表明,杜仲雄花粉总黄酮具有提高D-半乳糖诱导衰老小鼠血清、肝脏、脑组织中SOD活力、总抗氧化能力和清除肝脏、脑组织中脂质过氧化物的能力,有效防止或缓解氧化应激损伤,从而起到抗氧化衰老的作用。

4 结论

D-半乳糖在正常情况下可以代谢葡萄糖,但在体内大量存在时,则会导致机体产生氧化应激、线粒体功能障碍、免疫炎症、端粒缩短、代谢功能障碍等功能性变化,促进机体衰老[19]。近年来科研工作者对于黄酮类化合物抗衰老作用的研究逐渐深入,对于其抗衰老作用机制有了进一步的认识。黄酮类化合物是一种较好的抗氧化剂,其发挥抗衰老作用与机体自由基的清除和抑制脂质过氧化密切相关。研究证明黄芩[20]、草豆蔻[21]、红景天[22]植物中的黄酮类化合物能够通过其自身的酚羟基阻断自由基链式反应,进而减少自由基的产生,还可以通过增强机体内抗氧化物酶的活性,清除体内过多的自由基,并且抑制脂质过氧化作用,减少脂质过氧化产物如MDA等对机体的伤害,进一步发挥抗衰老作用。与黄酮类化合物发挥抗衰老作用相关的信号通路主要有MAPK 信号通路、NF-kB 信号通路、PI3K/AKT信号通路、SIRT1信号通路、mTOR信号通路等。黄酮类化合物通过调控衰老相关信号通路,参与机体的免疫反应、炎症反应的过程,保护细胞,发挥抗衰老作用[23]。

本实验评价了杜仲雄花粉总黄酮提取物对D-半乳糖致衰老小鼠的影响。结果显示杜仲雄花粉总黄酮提取物可以缩短小鼠潜伏期、提高小鼠对原平台位置的记忆能力,改善衰老导致的学习记忆能力衰退,延缓模型小鼠大脑衰老;给予衰老小鼠杜仲雄花粉总黄酮提取物可以显著提高小鼠肝脏的脏器指数,缓解衰老所致的肝组织损伤。以上结果证明了杜仲雄花粉总黄酮提取物具有一定的抗衰老作用。进一步测定各组小鼠血清及脑、肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性、总抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)的含量,结果显示杜仲雄花粉总黄酮提取物可以提高供试实验小鼠主要器官和血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性及总抗氧化能力,减少脂质过氧化物的产生。T-AOC、SOD活性及MDA 含量在小鼠肝脏、脑主要器官和血清中表现出不同水平,表明杜仲雄花粉总黄酮提取物对小鼠各主要器官和血清的作用能力不同。杜仲雄花粉总黄酮提取物通过提高衰老小鼠抗氧化能力,减少脂质过氧化物的产生,缓解氧化应激对机体产生的损伤,具有一定的抗衰老作用。本研究为杜仲雄花粉产品的进一步研发提供了理论依据。杜仲雄花粉总黄酮提取物的延缓衰老作用究竟是什么形式,还有待进一步研究。