饮用水中病毒富集、检测方法及标准的探讨

官杰 孙胜敏 高翠玲 王祎珂 彭晓辉 王肖 索依拉 朱风亮

摘 要：新冠疫情爆发后，多个研究机构从城市排水系统中检测到新冠病毒，目前为止已经发现700余种病毒可通过水体传播。由于病毒的粒径远小于细菌，富集浓缩、检测方法也不同，本文综述了饮用水中病毒浓缩富集及相关检测方法，并探讨了相关的国内外关于饮用水中病毒的标准要求。

关键词：饮用水，病毒，浓缩富集，检测，标准

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.01.034

基金项目：本文受国家市场监管总局科技计划项目“家用及类似用途饮用水净化产品的病毒净化性能评价关键技术研究”（项目编号：2020MK060））资助。

Study on the Enrichment， Detection Method and Standard of Virus in Drinking Water

GUAN Jie1 SUN Sheng-min1 GAO Cui-ling1 WANG Yi-ke2 PENG Xiao-hui1 WANG Xiao1 SUO Yi-la1 ZHU Feng-liang1

（1. Shangdong Institute for Product Quality Inspection； 2. Joyoung Company Limited）

Abstract： After the outbreak of the COVID-19 pandemic， several research institutions have detected novel coronavirus from urban drainage systems. So far， more than 700 kinds of viruses have been found to be spread through water bodies. Since the particle size of viruses is much smaller than that of bacteria and the detection methods are different， this paper reviews the concentration and enrichment of viruses in drinking water and related detection methods， and discusses the related domestic and foreign standard requirements for viruses in drinking water.

Keywords： drinking water， virus， enrichment， detection， standard

1 引 言

新冠肺炎病毒COVID-19疫情爆发以来，多国研究机构均从排水系统中检测到活性新冠病毒的存在，由此可见城市生活污水系统可以成为新冠病毒传播的渠道。不仅如此，目前已发现700余种病毒可通过水体传播，其中以肠道病毒居多。由于生活饮用水在日常生活中占据重要地位，饮用水中病毒的传播可在学校、办公区域等造成严重的群体性中毒事件，给消费者带来严重的健康危害。由此可见，饮用水的安全关系到人类的生命健康。据报道，某些肠道病毒在水中能存活较长时间，在自来水中可存活2～168天，在海水中可存活2～130天，并且水体中的病毒可吸附在水体中的悬浮物上，在污水处理廠的污泥和海底污泥中常检测到人类肠道病毒。以脊髓灰质炎病毒、诺如病毒等为代表的肠道病毒是在水体环境中最常见，也是水病毒学研究最多的一类肠道病毒。由于肠道病毒具有对外界环境抵抗力强、存活时间长、传播途径广、易检测等特点，故在研究水体的病毒中，常以肠道病毒作为代表。据统计，全球每年因轮状病毒，导致急性腹泻的儿童超过1.4亿，1981年美国科罗拉多州由于市政供水污染，导致大范围轮状病毒病的爆发。1982年以来，中国爆发了几次因饮用水污染导致的B族轮状病毒感染事件，感染人数超百人。近几年，由于饮用水资源污染，在我国引起群体性中毒事件频发，特别是在抵抗力差、人员密集的幼儿园及大中专院校中造成严重感染事件[1-4]。

由此可见，对生活用水中病毒的检测，事关消费者的身体健康，可避免群体性中毒事件及突发水污染状况的发生，具有重要意义。

2 饮用水中病毒的富集方法

由于病毒粒径较小，粒径远小于细菌，且在经消毒处理后的饮用水中，病毒浓度较低，通常需要对大量的水样进行浓缩富集，达到检测需要的浓度，故对饮用水中病毒富集浓缩是水体中病毒检测的前提。

由于病毒粒径很小，多数在20～200nm，其平均直径为100nm左右，也有少数病毒的直径大于200 nm，不同富集方法具有相对的局限性，如果水体中病毒富集效果达不到预期目标，可能使测试结果出现假阴性，导致存在饮用水安全风险隐患。目前饮用水中病毒浓缩富集常用的方法主要有絮凝沉淀法、固相吸附-洗脱法、抗原捕获分离法、免疫磁珠分离法、复合富集法等。

2.1 絮凝沉淀法

絮凝沉淀法是一种简单、快速、有效的病毒富集浓缩的方法之一，向水体中添加絮凝剂，通过调节水体的pH值，使絮凝剂在水体中絮凝形成沉淀，水中的病毒在沉淀形成过程中吸附在沉淀表面达到浓缩的目的。絮凝沉淀剂主要有无机类、有机类、生物类三大类。其中，生物絮凝剂，又称为微生物絮凝剂（Microbial flocculant，MBF），是一种新型天然生物高分子絮凝剂，由微生物产生并分泌到细胞外，是一种具有絮凝活性的微生物代谢产物。

与常规滤膜相比，絮凝沉淀法的吸附力较强，病毒被沉淀吸附后，以小体积的洗脱液将病毒从沉淀物上洗脱下来，常用的洗脱液有碱溶液或缓冲溶液（如柠檬酸等）。此方法成本较低，适用于小体积水样中病毒的富集，常与固相吸附法连用，用于洗脱液中病毒的再浓缩。

目前，絮凝沉淀法是废水中浓缩新冠病毒常用的方法之一，聚乙二醇（PEG）和铝絮凝沉淀剂是目前常用浓缩新冠病毒的沉淀剂，Itay课题组[5]分别采用铝和PEG絮凝沉淀两种方法富集水体中新冠病毒，均具有良好的浓缩效果。Sylvia等人采用共沉淀剂NaCl与PEG相结合，通过改变溶解度纯化病毒，优化了PEG絮凝法[6]。

2.2 固相吸附-洗脱法

水体中病毒的浓缩常用的固相吸附法主要包括固相膜吸附法和固相颗粒吸附法。

固相膜吸附洗脱法利用荷电滤膜与病毒之间的吸附作用实现病毒浓缩，根据滤膜的电荷性可分为阳离子滤膜和阴离子滤膜。以肠道病毒为例，大多数肠道病毒的等电点通常介于4.8～6.4，故在pH值呈中性的水体环境中，肠道病毒带负电。阴离子滤膜主要有硝酸纤维膜、聚氯乙烯纤维膜、尼龙膜、带电陶瓷膜等荷负电的滤膜材料，阴离子滤膜需在多价阳离子和酸性环境中使用，多价阳离子包裹病毒形成带正电荷的复合物，基于静电吸附作用，阳离子复合物吸附于阴离子滤膜表面，经小体积高浓度阳离子洗脱液洗脱后得到浓缩的病毒样本。阴离子滤膜的使用始于1967年，Wallis和Melnik[7]选用阴离子滤膜-硝化纤维膜，向水体中添加MgCl2，使水体中带负电的病毒颗粒被Mg2+包裹形成正电荷复合物，吸附于硝化纤维膜表面，后用强碱进行洗脱。此方法的缺陷在于，富集结果易受水体中其他离子的影响。阳离子滤膜，以纳米铝滤膜为例，可不经水体pH值调节，直接吸附水体中的病毒，达到浓缩的目的，操作简单，受外界干扰因素少。邓宇[8]课题组以硅藻土微孔陶瓷膜为基膜，经在涂膜液中涂覆、干燥、煅烧后得到纳米Y2O3表面修饰的荷正电微孔陶瓷膜，以细菌内毒素和大肠杆菌噬菌体MS2为目标物，研究了荷正电微孔陶瓷膜对二者的吸附作用，通过静电作用吸附饮用水中的病毒，实现对病毒的分离。

固相膜吸附法在饮用水中病毒的浓缩富集具有一定的优势，但是此方法易受水体中的悬浮物、带电物质、有机物等因素的影响，不仅影响净水量甚至干扰洗脱，因此，目前急需开发一种适用于多种水质、高效、便捷、低成本固相膜吸附法。

固相颗粒吸附法是以带电固体颗粒未填充材料，如树脂、羟磷石灰、玻璃粉等作为柱填充材料，含有病毒的水样经过柱体时，基于静电吸附作用，带电颗粒吸附水体中的病毒后，用小体积洗脱液进行洗脱，达到病毒富集的目的。此法中水样的体积和浊度对病毒回收率的影响较小，故其可作为大体积水样病毒富集的有效手段。

2.3 抗原捕获富集法

抗原捕获富集法是一种基于免疫学技术的水体中目标病毒富集方法[9]，利用病毒与其特异性抗体唯一结合的机理，将目标病毒的特异性抗体通过物理或化学手段固定于柱填充材料的表面，含有目标病毒的水体流经过滤柱后，目标病毒被其特异性抗体吸附后，用缓冲液清洗柱体吸附的杂质，洗脱液洗脱吸附的目标病毒，由此可得到浓度较高的病毒试样。但此法中，特异性抗体仅适用于病毒已知的检测，不适用于未知病毒的突发水体污染事件，其适用范围较窄。

2.4 免疫磁珠分离法

免疫磁珠分离法是20世纪后期兴起的一种分离技术，是基于免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应特性相结合的新型免疫学技术，是抗原捕获富集法的一种，其具有特异性强、分离快速、纯化度高、操作简便的优点。

免疫磁珠结构上可分为三部分，其核心为具有强且稳定磁性的微小金属颗粒，中间层为聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚乙烯亚胺等具有活性基团的高分子材料，外层为修饰的特异性抗体。基于磁珠表面活性抗体蛋白改性，赋予磁珠免疫活性，作为抗体的载体，免疫磁珠表面活性抗体与特征微生物或特异性抗原物质结合后，形成具有较高磁响应性的抗原-抗体-磁珠免疫磁性复合物，在外加磁场作用下定向移动，使体中病毒与其他物质相分离，达到水体中病毒富集、浓缩的目的。与抗原捕获分离法相似，此法仅适用于病毒已知的水体，对于突发水污染事件并不适用。

2.5 复合富集法

复合富集法是指多种富集方法同时使用，实现病毒高效富集的一种方法。通过不同的富集方法相互补充，实现最佳富集。

吴立梦等[10]将阳离子滤膜Nano Cream吸附与有机絮凝沉淀法和超滤法相结合，实现大体积水体中肠道病毒的富集。以美国环保局公布的“Method 1615”标准为依据，分两步对水体中的肠道病毒-脊髓灰质炎病毒进行富集，采用阳离子膜滤芯Nano Cream膜吸附法对水体中的病毒颗粒进行初步富集，然后采用碱化牛肉膏洗脱吸附在滤膜上的病毒，调整洗脱液的pH值，使蛋白质包裹病毒形成絮凝沉淀，经离心分离实现脊髓灰质炎病毒的富集。

3 饮用水中病毒的检测方法

水体中的病毒检测始于20世纪对污水及生活饮用水中脊髓灰质炎病毒的检测。早期病毒的检测方法主要是细胞培养法，通过培养过程中宿主细胞的病变来判断病毒的存在情况，但是细胞培养法的检测周期长，存在病毒难以培养、宿主细胞无明显病变等缺点，导致难以实现快速、灵敏、便携的水体检测。随着检测技术的不断发展，病毒检测技术得到快速提升，为实现饮用水中病毒快速、灵敏、高效检测提供了技术保障。

3.1 电镜法

电镜检测法是水体中病毒检测最直接的检测手段之一，其包括常规电镜法和免疫电镜法。但是由于水体中病毒含量低、电镜法灵敏度低，难以满足饮用水中病毒快速、灵敏检测的需求。

免疫电镜法是免疫化学技术与电镜技术相结合的一种技术，是指在电镜下直接观察抗原和抗体反应，称为免疫吸附电镜技术或免疫电镜技术，是研究抗原抗体相互作用的一种技术方法。与电镜法相比，免疫电镜法的敏感性可提高10～100倍，而免疫电镜法检测结果的准确性与实验人员的试验技能和经验有很大关系。

3.2 免疫法

免疫法的原理是利用水體中病毒与其特异性抗体之间的生物学反应检测样本中的病毒，此方法的灵敏度、特异性依赖于抗原和抗体的之间差异性。目前常用的免疫法主要有生物素-亲和素免疫法、酶联免疫吸附（ELISA）法、放射免疫法（RIA）和免疫胶体金技术等。

生物素-亲和素免疫法，是指利用生物素和亲和素这两种分子的独特性质的检测方法，生物素是一种存在于动植物体内的一类小分子生长素，经活化后的生长素可与多种生物大分子如蛋白质、核酸、生物多糖等生物大分子通过酰化反应发生偶联反应，且每个生物大分子可与多个生物素偶联；亲和素是一种具有四个相同亚基的碱性糖蛋白分子，呈四价反应性，可结合四个生物素分子，产生新的放大作用。生物素-亲和素免疫法具有高灵敏度、高特异性、高稳定性、应用面广、快速经济等优点[11]。

酶联免疫吸附（ELISA）法是Engvall和Perlman在1971年首次提出的，酶分子通过共价结合的方式与抗体分子结合，实现对抗体的标记，其可与固定相载体上的抗原发生特异性结合，通过底物颜色反应来判断有无免疫反应，通过ELISA检测仪对颜色反应进行定量测定，可实现标准化检测。

1977年雅洛创立放射免疫法（RIA），利用同位素标记的与未标记的抗原，与抗体发生竞争性抑制反应的方法，研究机体与抗原物质反应的发生、发展和转化规律，是一种高灵敏度、简便的测量方法。

免疫胶体金技术是基于具有纳米尺度的胶体金颗粒与生物大分子表面的具有还原性的巯基结合，寡核苷酸探针经巯基修饰后可被胶体金颗粒标记，用于固相核酸杂交的信号显示。液相杂交中，通过胶体金标记的寡核苷酸探针与靶向核酸结合后，导致胶体金颗粒的聚集，产生颜色反应，基于颜色的变化可定性判断靶向核酸是否存在。

基于抗原-抗体的特异性反应，免疫法测定水体中的病毒具有高灵敏性，但是此方法限于病毒种类已知的水体检测，对于突发水污染事件并不适用。

3.3 分子生物学检测方法

以分子生物学方法检测水体中的病毒时，首先要提取病毒的核酸，采用不同生物学分析检测方法对提取的核酸进行分析，常用的分析方法有聚合酶连反应、逆转录PCR法、实时荧光PCR法、核酸杂交检测法等。

病毒中核酸提取是病毒检测非常关键的一步，如何获得较为完整的DNA或RNA，是核酸提取的关键，在提取过程中应避免内源及外源性的脱氧核糖核酸酶（DNase）或核糖核酸酶（RNase）对DNA或RNA的降解。因此在提取过程中需抑制DNase和RNase，防止核酸降解。硫氰酸胍类物质作为强蛋白变性剂，在裂解细胞释放核酸的同时能够使核酸酶快速失活，避免核酸被降解。

聚合酶链反应（PCR）是一种在体外特异性扩增靶DNA序列的技术，其基本过程为模板双链DNA的变性、引物与模板DNA的退火和在DNA聚合酶引导下的链延伸反应三个阶段的多次循环。每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板。理论上，扩增产物量呈指数形式上升，即经过n个循环后，产物量增加到2倍。PCR试剂操作简单，短时间内在体外可获得数百万个特异靶DNA序列的复制，为临床疾病的诊断、治疗监测和预后评估提供了一种非常有效的实验室辅助手段。

逆转录PCR（RT-PCR）法作为一种病毒定性检测手段，是指以mRNA为模板在逆转录酶作用下合成的cDNA第一链的PCR。该反应分为两步，第一步在单引物的介导和反转录酶的催化下合成RNA的互补链cDNA；第二步加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链DNA，最后同常规PCR一样，扩增靶DNA。合成cDNA 第一链所用的逆转录酶是一类依赖于RNA的DNA聚合酶。目前常用的逆转录酶主要有两种：一种是来源于禽成髓细胞性白血病病毒的AMV逆转录酶，另一种是来源于莫洛尼鼠白血病病毒的MOMLV 逆录酶。逆转录PCR是轮状病毒（RV）常用的检测方法，RV病毒为双链RNA病毒，检测过程中将水样中病毒的RNA逆转录为cDNA，以逆转录的cDNA为模板进行PCR扩增，通过检测PCR特异性的扩增产物来检测RV。

实时荧光定量PCR法是一种DNA定量方法，定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料或特异性荧光探针，实时监测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数（CT值），绘制标准曲线，此方法具有简便、快捷的优点，能够有效扩增低拷贝的靶片段DNA，对每克样品中20pg～10ng的转基因成分进行有效检测。

核酸杂交检测法是一种分子生物学技术，基于特定序列的寡核苷酸探针与待测病毒的核酸互补杂交，探针上的标记物杂交后可产生发光、显色等可视化现象，显示杂交结果，用于检测病毒。但是此方法的敏感性较低，无法单独用于水体中病毒的检测，目前此法常与PCR等技术串联使用，用于水体中病毒定性、分型和定量等检测[12]。

环介导等温扩增法（LAMP）是2000 年开发的一種新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63℃左右） 保温30～60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

4 国内外饮用水中微生物的控制指标

目前国内外相关标准针对饮用水中微生物造成的人体健康风险给予高度重视。目前世界卫生组织WHO的《饮用水水质准则》对19种致病菌、7种病毒和11种致病原虫（寄生虫）做了评估；欧盟《饮用水水质指令》中对饮用水中的大肠杆菌、肠道球菌、铜绿假单胞菌等微生物指标提出限制要求；2004年，美国环保局修订的《饮用水水质标准》中，新增对分枝杆菌的控制要求，共包括含病毒在内的8项微生物指标，此标准中病毒主要是指来源于人和动物粪便导致肠胃疾病的病毒。其他国家，如俄罗斯、日本、加拿大等国家参照WHO、欧盟及美国的饮用水相关要求制定本国的饮用水卫生标准。

我国以WHO《饮用水水质准则》为依据，立足我国实际情况，制定了GB 5749-2006《生活饮用水卫生标准》，此标准中提出对大肠埃希氏菌和耐热大肠菌的限量要求，对贾第鞭毛虫和隐孢子虫限值提出要求，但并未涉及对饮用水中病毒的限量要求。2022年3月15日GB 5749-2022发布，于2023年4月13日正式实施。

5 结 语

饮用水的安全关乎消费者的身体健康，由于病毒的独特的生物结构，对饮用水中病毒高效浓缩富集方法的研究，以及高灵敏度、快速检测方法的探讨势在必行，目前我国饮用水标准要求中并未涉及病毒的限量要求，因此应加快推进饮用水中病毒标准要求的制定，为消费者提供更干净、更安全的生活饮用水。

参考文献

[1]黄江平，钟格梅.两起诺如病毒污染饮用水致感染性腹泻疫情暴发案例[J]. 分析环境卫生学杂志，2021，11（4）：385-389.

[2]祁艳秋. 1 起幼儿园GⅡ型诺如病毒急性胃肠炎暴发疫情调查[J].中国校医，2018，32（11）：851-853.

[3]齐孝旗，蔡少健，谢忠杭，等.福建省某高校一起诺如病毒感染性腹泻暴发调查[J].海峡预防医学杂志，2019，25（4）：17-19.

[4]叶淑君，秦秋翠，黄燏，等.一起因井水污染引起的诺如病毒胃肠炎暴发调查[J]. 疾病监测，2019，34（8）：771-774.

[5]BAR-ORITAY， YANIV K， SHAGAN M， et al. Regressing SARSCoV-2 sewage measurements onto COVID-19 burden in the population： a proof-of-concept for quantitative environmental surveillance[J].Med Rxiv，2020：20073569.

[6]SYLVIA S A， WHITTALL J J， PANDOPULOS A J， et al. An optimized and robust PEG precipitation method for detection of SARS-CoV-2 in wastewater[J].Science of the Total Environment， 2021，785：147270.

[7]WALLIS C， MELNICK J L. Concentration of enteroviruses on membrane filters[J]. Journalof virology， 1967， 1（3）： 472- 477.

[8]程秀婷. 荷正电微孔陶瓷膜对病毒的分离性能及机理研究[M].天津：天津科技大学， 2016.

[9]MYEMEL M， RIMSTAD E， WASTESON Y. Immunomagnetic separation of a Norwalk- like virus （genogroup I） in artificially contaminated environmental water samples[J]. Int J Food Mircobiol， 2000， 62（1-2）： 17-26.

[10]吳立梦，林庆能，王文静，等.基于阳离子膜滤芯的环境水体病毒浓缩方法效果评价[J].现代预防医学，2015，24：4471-4474.

[11]章古生，李绍康，严咏堂.生物素-亲和素系统在免疫学检测中的应用[J].上海免疫学杂志，1985，5（2）：112-115.

[12]翁康生，陆晔，刘国星，等.分子生物学技术检测水中病毒[J].中国卫生检验杂志，2002，10（5）：630-631.

作者简介

官杰，硕士研究生，高级工程师，主要从事消费品质量安全风险评估与检测。

（责任编辑：袁文静）