自制负压血培养瓶的临床应用*

李忠涛,瞿 良,陶 娜,依南温

(中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院：1.医学工程科;2.检验科,云南 昆明 650032)

目前,国内外用于诊断感染性病原体的血培养方法至今仍然是直接从血中检出病原菌和进行药敏试验的“金标准”。但国内医院血培养系统不同检测手段的局限性,以及国内的研究现状和军队野外驻训、国际维和、抗震救灾等突发事件对感染性血液感染的诊疗较困难。当前,国内医院血培养瓶大多数采用美国BD 公司和法国梅里埃公司生产的全自动血液培养系统配套产品,由于设备和配套耗材价格昂贵的原因,小医院仍然采用传统手工血培养瓶,采集2次以上血液进行培养,导致检验试剂成本、人力成本、耗材成本及污染率等升高。据统计,新生儿血流感染是由于病原体侵入患儿血液所引起的全身感染性疾病,是新生儿死亡的重要原因之一[1]。新生儿复数菌血流感染与多方面因素有关,临床防治应从其主要相关危险因素入手,减少采集血液培养困惑,减少医院内感染的发生,合理使用抗菌药物,关注早产儿与危重患儿救治是减少新生儿复数菌血流感染的主要措施[2]。由于采集的血液被污染的因素有很多种,如住院时间延长、药物成本增加等,从而引起假阳性血培养率达0.6%～6.0%[3]。受污染的血液培养对就诊患者有两方面的影响：(1)临床治疗时间、疗效等;(2)经济方面的支出增加。为有效控制血培养被污染,比较好的方法是监测和反馈污染率,如采用干预方法,污染率大约减少了50%[4]。KELLY等[5]通过研究污染率减少的简单信息干预的效果评估发现,干预前血培养污染率为2.59%,干预后为2.23%。不同地区血培养病原菌分布情况的差异可能与不同地区儿童常见疾病类型、细菌流行种类,以及抗菌药物的使用种类、强度等有关,这也为该地区医疗机构合理使用抗菌药物提供了借鉴[6]。为减少血培养污染,医疗工作者近年来在这方面做了很多的努力。主观方面包括防止人员将外源细菌带入血培养瓶和加强对采血者的培训;客观方面包括采用降低阳性血液培养中病原体污染物的方法。本研究旨在实现立足血培养瓶国产化并提高检验效率、减少不必要的一些步骤,从而避免污染,降低耗材和人力成本,提升临床病原微生物诊断的检验功效。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1材料 瓶体、培养基、瓶盖、玻璃纸、纱布、细线等。自制负压血培养瓶构造体包括瓶体和瓶盖,瓶内温度为-10～65 ℃,湿度为小于或等于85%,压力为-50～-30 kPa,在瓶口处有包裹瓶口的玻璃纸,玻璃纸外面包裹纱布,瓶内有血培养基,容量为30 mL。自制负压血培养瓶结构示意图和剖析图见图1。

注：A.示意图;B.剖析图;1.瓶体;2.培养基;3.瓶盖;4.玻璃纸;5.纱布;6.细线。

1.1.2血培养基配方 包括胰蛋白胨0.15 g、酪蛋白胨0.45 g、牛肉膏0.09 g、氯化钠0.15 g、葡萄糖0.01 g、枸橼酸钠0.09 g、七水硫酸镁0.15 g、0.5%对氨基苯甲酸 1 mL、酵母浸液2 mL、酚红0.4% 0.5 mL、肌醇0.01 g、甘油0.5 mL、非离子活性剂1 mL、盐酸吡哆醛0.01 g、含铁的柠檬酸铵0.01 g、磷酸钾0.03 g、非离子吸附树脂1.00 g、阳离子交换树脂1.00 g、精氨酸0.05 g、重碳酸钠0.03 g等。

1.2方法

1.2.1自制负压血培养瓶的制备

1.2.1.1准备实验材料 用医院常用的100 mL玻璃输液瓶,瓶子和瓶盖清洗干净,高温121 ℃消毒5 min后备用。

1.2.1.2实验方法 (1)除对氨基苯甲酸、硫酸镁、酚红外所有血培养基的配方物质均称好,煮化充分溶解后调整pH为7.4±0.5;加酚红前必须调整好pH;(2)在无菌条件下加入硫酸镁、对氨基苯甲酸;(3)余量为蒸馏水补充至30 mL。血培养基pH为7.4±0.5,121 ℃消毒15 min后备用。

1.2.1.3瓶子制成负压状态 负压的压力控制为-50～-30 kPa,用2层玻璃纸包裹后再包裹纱布,用细线固定后制成负压血培养基。

1.2.2采用本院临床常见血培养微生物进行留样验证 将留样菌株从-80 ℃低温冰箱取出后接种于相应平板上(血平板、巧克力平板、沙保弱平板),于35 ℃、5%二氧化碳环境下过夜培养,且所有菌株传代2次以确定为纯培养并经质谱验证。见表1。

表1 本院临床常见血培养微生物构成情况

1.2.3无菌实验 参照《中华人民共和国药典》2005年版的无菌检查方法[7]。采用薄膜过滤法,将自制负压血培养瓶中的培养基过滤,冲洗(冲洗液为pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液),冲洗量为每张膜400 mL,冲洗50 mL,每次抽干,以大肠埃希菌为阳性对照菌。培养条件为硫乙醇酸盐流体培养基桶30～35 ℃培养,真菌培养基23～28 ℃培养。各管置于规定的温度培养5 d,逐日记录结果。

1.2.4有菌试验 采用表面菌落计数法进行有菌试验,用无菌棉签将自制负压血培养瓶中的培养基涂抹在营养琼脂表面,采用平板菌落计数法统计菌落数目。根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的,也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时先将待测样品进行一系列稀释,再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中的培养基内,经培养后由单个细胞生长繁殖形成菌落,即可换算出样品中的含菌数。这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。

1.2.5性能验证 根据中国合格评定国家认可委员会分布的《医学实验室质量和能力认可准则》(CNAS-CLO2 CNAS-CLO2：2012)[8]和《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明》(CNAS-CLO2-A005：2018)[9]中有关血培养临床微生物检验程序要求进行负压培养瓶的性能验证。(1)模拟临床血流感染患者的细菌含量,挑取留样菌株单个菌落并用生理盐水配制成0.5麦氏单位(0.5麦氏单位=1.5×10 CFU/mL)的菌悬液,其理论浓度为1×106～5×106CFU/mL[3];(2)取0.2 mL菌悬液于1.8 mL无菌生理盐水中10倍稀释为1×105～5×105CFU/mL,同法继续分别稀释为1×104～5×104、1×103～5× 103、1×102～5×102CFU/mL,以1×102～5×102CFU/mL为最低检出限;(3)随机分别取1 mL浓度为1×102～1×105CFU/mL接种于Bactec9120血培养瓶、传统手工血培养瓶和自制负压血培养瓶中,置于37 ℃孵箱,分别按细菌特点进行需氧、厌氧、真菌及苛氧菌培养。

1.2.6临床验证 血培养基配方参照《全国临床检验操作规程》第4版进行调试、消毒、负压制备等环节,进行临床性能验证实验。选取本院就诊患者210例作为临床患者血培养标本,选取本院住院患者618例作为比对验证血培养标本,患者必须签署本研究知情同意书后建档,然后进入研究流程。临床护士根据医生申请检验项目,与其他检验采集真空管一样,一次性消毒,逐次采集血样,包括自制负压血培养瓶,根据瓶上标注儿童瓶“5 mL”、成人瓶 “8 mL”刻度进行血量采集。按正常检验培养流程进行试验。

1.3统计学处理 应用SPSS21.0统计软件进行数据分析,计数资料以率或构成比表示,采用χ2检验;3种血培养瓶对不同浓度标准菌株检出时间比较进行单因素和多因素非条件logistic回归模型分析,采用相关系数(R)表示培养瓶检出细菌的相关性。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1无菌试验结果 接种阳性对照菌(大肠埃希菌)的培养基呈现生长;自制负压血培养瓶无细菌和真菌生长。见表2。

表2 无菌试验结果

2.23种血培养瓶有菌试验结果及最低检测浓度、最低检出时间比较 3种血培养瓶有菌试验及最低检测浓度见表3。自制负压血培养瓶在所有菌株的最低浓度级别时均培养出阳性,阳性符合率为100%。3种血培养瓶最低检出时间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 3种血培养瓶有菌试验及最低检测浓度

表4 3种血培养瓶最低检出时间比较

2.3临床患者血培养标本检验结果比较 Bactec9120血培养瓶检出细菌10种,阳性患者28例;传统手工血培养瓶检出细菌11种,阳性患者29例;自制负压血培养瓶检出细菌10种,阳性患者28例。见表5。

表5 临床患者血培养标本检验结果比较[n(%),n=210]

2.4比对验证血培养标本检验结果比较 Bactec9120血培养瓶、传统手工血培养瓶、自制负压血培养瓶分别检出49例(7.93%)、44例(7.12%)、50例(8.09%)。三者阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 比对验证血培养标本检验结果比较(n=618)

3 讨 论

感染性疾病主要由传统的、寄生虫病及各种机会性感染性疾病组成的生物病原体侵入机体引起的疾病[10]。感染性疾病是导致人们身体不健康或亚健康的因素之一[11-13]。血培养是采集患者血液标本并接种到培养瓶中的病原微生物,是诊断菌血症和真菌血症的基本方法[14]。血流感染、感染性心内膜炎及临床不明原因感染等疾病的诊断可通过血培养的检验技术来实现[15]。因此,血培养检验在血流感染和脓毒症确诊,尤其是在诊治中具有举足轻重的作用[16]。

一般的其他就诊患者在住院期间如发生血流感染会导致住院时间延长、治疗费用增加、治疗康复也可能达不到预期效果[17]。血培养在临床及时诊断血流感染和用药方面具有非常重要的指导意义[18]。本研究自制的负压血培养瓶采集血液时与其他检验项目的负压管一起,一次穿刺,减少二次损伤和降低污染率,在临床病原微生物检验中具有现实的临床价值,分别接种1×102～1×105CFU/mL金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌3种标准参考质控菌株于Bactec9120血培养瓶、传统手工血培养瓶和自制负压血培养瓶中进行性能比对实验,阳性符合率为100%。

对成年人来说,根据国际惯例,一般的操作是在较短时间内连续采血,采血量为16～30 mL,每瓶血培养需要的血液为8～10 mL[19]。血培养的阳性率与血培养瓶的数量和采血量频次等多因素相关[20]。血培养组合的多次检出率是与血培养采样次数的增加呈一定比例关系[21],血量为2～30 mL血培养的病原菌阳性率增减与血量增减是一致的[22]。血培养仍然是菌血症检验的“金标准”,而临床微生物实验室血培养是用传统的培养模式,即通过肉眼观察培养液浑浊、溶血、菌膜及指示剂是否因产酸变色等情况提示有菌生长,从而产生不利因素[23]。因此,需研究生产一种负压血培养瓶来解决这个问题。本研究对618例临床患者的3种培养瓶阳性检出率比较发现,差异无统计学意义(P>0.05)。这种在血培养技术中革命性的变革,显著减轻了实验室的工作量,并可使血培养报告时间比手工瓶提前。虽然血培养仪有诸多优点,是今后的发展方向,但进口血培养仪及相应的血培养瓶价格非常昂贵,目前,国内仅部分大医院使用,且从国内情况看其对需氧菌的检出效果并不明显。近年来,国外已证实Bactec、Bact/Alert等市场较广使用的血培养仪仍存在某些漏检(主要是铜绿假单胞菌和白色念珠菌等专性需氧菌),且原因至今尚未完全查明。本研究自制的负压血培养瓶,为提高病原微生物检验效率,减少不必要的一些步骤,从而避免污染,降低耗材和人力成本,提升临床病原微生物诊断检验功效,具有重要的临床价值,值得推广应用。