与坏死性凋亡相关的lncRNA模型预测肾透明细胞癌患者预后及区分肿瘤的研究*

蒋奕斌,张梦翊,王朋佳,胡 泉,苗 叶,钱 晶,2△

(1.湖州师范学院医学院,浙江 湖州 313000;2.浙江省媒介生物学与病原控制重点实验室,浙江 湖州 313000)

肾透明细胞癌(KIRC)是肾细胞癌中的最常见亚型,是一种源自肾小管上皮细胞的恶性肿瘤,占肾恶性肿瘤发病率的近90%,占成人恶性肿瘤发病率的近3%[1]。KIRC患者是所有肾细胞癌患者中预后最差者,具有高侵袭性和高转移性[2]。由于KIRC缺乏有效的早期诊断方法,大约30%的患者在诊断时已为晚期,由于KIRC对放、化疗的天然抵抗力,预后非常差。目前,对KIRC患者进行手术切除仍是最有效的治疗方法[3]。因此,全面了解KIRC的分子机制并开发有效的早期检测方法具有重要意义。

在生物体内细胞凋亡是细胞程序性死亡的最常见原因。近年来,基于对细胞死亡机制的大量研究,最近提出了新的细胞死亡机制——坏死性凋亡。由于大多数肿瘤固有的抗凋亡作用,诱导其他细胞死亡,其越来越被认为是一种有前途的治疗策略[4]。坏死性凋亡是一种独立于细胞凋亡的特殊受调控细胞坏死,可通过激活肿瘤微环境(TME)中的RIPK1、3提高CD8+白细胞介导的抗肿瘤免疫力。同时,一种坏死性凋亡癌细胞模拟的纳米疫苗可通过刺激NKG2D+和CD8+T淋巴细胞增殖提高小鼠的抗肿瘤免疫力[2]。有研究表明,坏死性凋亡与肾细胞癌、卵巢癌、乳腺癌等恶性肿瘤的发生及发展相关[5]。因此,寻找更多参与坏死性凋亡的生物标志物,以理解涉及KIRC坏死性凋亡的相互作用尤为重要。

目前,长非编码RNA(lncRNA)被认为是关键的调节因子,并参与多种生物学过程,包括表观遗传重塑、染色质结构调节、RNA稳定性调节,以及作为微小RNA海绵的功能等[5]。然而,目前关于坏死性凋亡相关(NR)的lncRNA的文献报道很少见,并且NR lncRNA在KIRC预后中的作用仍未知。本研究旨在揭示KIRC与NR lncRNA的关系,并构建一个具有预后意义的与KIRC预后相关的NR lncRNA模型。

1 资料与方法

1.1资料来源 从TCGA数据库(https：//portal.gdc.cancer.gov/)中下载539 个KIRC肿瘤样本和72个正常样本的转录组数据和临床数据。 同时,剔除临床数据缺失或不完整的样本。

1.2方法

1.2.1筛选NR lncRNA 使用R语言(4.1.2版)中的“DESeq2”包进行差异分析,筛选出在肿瘤样本和正常样本中表达有差异的lncRNA。筛选标准为|log2fold change(FC)|>1.0 和P<0.05。P值经假阳性发生率校正。另外,将67个基因作为NR基因,包括坏死性凋亡基因集M24779.GMT和基因组富集分析(http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)获得的8个坏死性凋亡基因。随后,使用 67个坏死性凋亡基因和差异表达的lncRNA 进行共表达分析,筛选得到KIRC患者NR lncRNA。 筛选标准为Pearson相关系数大于0.8 和P<0.001。

1.2.3分析MYSOLID、LINC02362、MANCR与KIRC患者预后的关系 在TCGA的Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)数据库(http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html)中设定检索条件：(1)Single Gene Analysis选项,Enter gene name输入基因名CLEC16A、LINC02362和MANCR;(2)Dataset选择 KIRC;(3)在 Survival 栏中选择Overall Survival;(4)在Datasets Selection(Cancer name)栏中选择KIRC点击 Plot。

1.2.4基于3个NR lncRNA的肿瘤分群 使用“clusterplus”R软件包,依据风险模型中lncRNA的表达水平确定潜在KIRC的集群,同时,检验KIRC对免疫治疗的反应[7]。 应用“RTSNE”R包进行主成分分析(PCA)、T分布随机邻域嵌入(t-SNE)和Kaplan-Meier生存分析。另外,使用“GSVA Base”进行免疫检查点分析和计算不同集群KIRC的免疫细胞浸润。并区分冷、热肿瘤。

1.3统计学处理 应用R语言(4.1.2版)和GEPIA数据库进行数据分析,采用χ2检验和Kaplan-Meier生存分析检验NR lncRNA模型,以评估NR lncRNA模型的预后价值。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1KIRC患者中差异表达的NR lncRNA 基于67个NR基因得到97个差异表达的lncRNA,其中13个上调,84个下调。NR基因(如GATA3和CDKN2A)与lncRNA之间的网络关系见图1。

注：A.KIRC NR lncRNA的共表达网络(相关系数大于0.8,P<0.001);B、C.97个差异表达的NR lncRNA的热图和火山图。

2.2模型的构建与检验 10个NR lncRNA与KIRC患者总生存率相关(P<0.05)。见图2A、B。3个与KIRC预后相关的NR lncRNA。见图2C、 D。桑基图发现3个lncRNA均被下调。见图2E。高风险组有着不良的预后。见图3。

注：A.通过单变量Cox回归分析筛选的预后NR lncRNA;B.10个预后NR lncRNA的表达热图;C.10折交叉验证Lasso模型;D.3个预后NR lncRNA的Lasso系数图;E.坏死凋亡相关基因和lncRNA关系的桑基图。

2.3MYSOLID、LINC02362、MANCR与KIRC患者预后的关系 MYSOLID、LINC02362、MANCR低表达组患者总生存率均明显高于高表达组,差异均有统计学意义(P<0.05)。低表达组患者相较于高表达组具有更高的生存率。见图4。

图4 MYSOLID、LINC02362、MANCR与KIRC患者预后的关系

2.4区分冷、热肿瘤 KIRC 患者重新分组为2个亚型。见图5A。t-SNE显示2个亚型可以清楚地区分。见图5C。此外,获得风险组和亚型的PCA图。见图5E、F。亚型 1患者总生存率高于亚型2,提示预后较好。见图5B。亚型1与低风险组和高风险组均相关,而亚型2几乎与高风险组相关。见图5D。亚型2较亚型1具有更高的基质、免疫评分。见图5G～I。亚型2具有更高水平的免疫细胞浸润。见图5J。几乎所有的免疫检查点均在亚型2中表现出更多的活性,如 IDO1、PDCD1 和 CD44。见图5K。因此,将亚型2视为热肿瘤,亚型1视为冷肿瘤。

注：A.KIRC患者被“ConsensusClusterPlus”R包分为2个亚型;B.Kaplan-Meier生存率分析2个亚型之间的总体生存率;C.2个亚型的t-SNE;D.风险评分和亚型关系的桑基图;E、F.KIRC患者风险评分和亚型的PCA;G～I.TME分析;J.亚型1、2免疫细胞浸润的热图;K.36个基因检查点在亚型1、2中的表达水平。

3 讨 论

免疫疗法可改善肿瘤患者的预后,但其只对部分肿瘤有效[7-8]。 由于免疫抑制TME,免疫治疗对一些患者无效。GALON等[9]提出了冷、热肿瘤的概念以增强免疫治疗。其是基于免疫的肿瘤分类,而不是传统的基于癌症分类,具有高免疫评分的肿瘤通常被称为“热”,而具有低免疫评分的非侵入性肿瘤被称为“冷”。可通过T淋巴细胞靶向免疫疗法、微生物组调节或其他免疫药物治疗热肿瘤。然而,因T淋巴细胞预先存在的免疫力无法释放,这对冷肿瘤来说就很复杂。CD8+T淋巴细胞可通过释放 PRF1、GNLY 或 GZM 等细胞因子杀死癌细胞,并作为一种预先存在的免疫反应打破耐受性和通过PD-1/PD-L1免疫抑制轴增强免疫治疗。因此,临床治疗中谨慎的做法是将冷肿瘤转化为热肿瘤,而不是简单地进行其他治疗[2]。

本研究确定了3种与KIRC患者预后相关的NR lncRNA,并由此构建了NR lncRNA模型,对患者进行风险评分,试图区分冷、热肿瘤。 通过风险模型,患者被重新分组为低风险组和高风险组,并进行了多项分析,包括 Kaplan-Meier生存分析和χ2检验。有研究表明,分子亚型又称为集群,与肿瘤免疫抑制和微环境有关[10-11]。不同的亚型具有不同的免疫效应和 TME评分,进而亚型间具有不同的预后和免疫治疗反应[12-14]。因此,根据NR lncRNA模型中lncRNA的表达将患者分为2个亚型,其具有不同的免疫微环境。亚型1 具有免疫抑制性,相比之下,亚型2具有更密集的CD8+T淋巴细胞浸润,更活跃的促炎功能,更高的免疫评分及TIM3、LAG3、PD-L1活性。因此,亚型1可归类为冷肿瘤,亚型2可归类为热肿瘤。

此外,本研究在桑基图中发现了一些NR lncRNA,如ZBP1。 MANCR、MYOSLID 均与 CDKN2A相关。CDKN2A表达水平与许多肿瘤中的肿瘤突变负荷及许多肿瘤中的微卫星不稳定性显著相关[15]。指导癌症和其他疾病治疗策略的ZBP与 LINC02362相关,后者也与细胞凋亡有关,可克服免疫治疗失败,并保持持久的抗肿瘤反应[16]。近年来,发现MANCR在癌细胞的迁移和侵袭能力中发挥重要作用[17],其体外过度表达在一些研究中与肿瘤发生有关[18]。RAB13可能促进骨肉瘤的发生,而 MYOSLID 刺激微小RNA-1286 以增加RAB13表达[19]。

本研究与既往利用体外实验技术分析研究肿瘤发生及发展模式不同,通过在线数据库的数据挖掘分析,减小由于样本量不足导致的结果误差,相关结果可作为临床试验的前瞻研究与重要补充、指导。但本研究缺乏实验基础,MYSOLID、LINC02362、MANCR在KIRC发生及发展中发挥的机制和作用仍需进一步验证。