五味子种子种苗质量分级标准研究

贾丁丁, 尹海波, 贾 琳, 王 丹, 贾春雷, 吴 伟, 李博文

(1.辽宁中医药大学药学院, 辽宁 大连 116000;2.中华人民共和国沈阳海关沈阳国际旅行卫生保健中心, 沈阳 110623)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)为木兰科植物五味子的干燥成熟果实,习称“北五味子”。五味子具有收敛固涩,益气生津,补肾宁心的功效,用于治疗久嗽虚喘,梦遗滑精,遗尿尿频,久泻不止,自汗盗汗,津伤口渴,内热消渴,心悸失眠[1]。近年来,因野外生态变化和人为滥采,野生五味子资源不断减少,目前,五味子药材来源主要以栽培为主。

种子种苗的质量是保障中药材品质的关键,其分级标准也是药材规范化生产的保障[2-3]。目前,五味子种子种苗交易市场较混乱,对五味子种子种苗的定级尚不明确,造成栽培和人力资源的大量浪费。五味子种子种苗分级研究是确保其种子种苗质量、提高其药材质量和产量的重要手段,对不同级别的种子种苗进行筛选,优选级别较高的种子种苗,促进高质量品种的选育,提高药材安全性和有效性。本研究通过K-均值聚类等分析方法[4-6],对黑龙江、吉林、辽宁三省五味子主产地的种子种苗各指标进行分级,根据各指标分级结果优选种子种苗,促进中药材产业健康发展[7]。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、赤霉素(北京索莱宝科技有限公司)、娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)、浓硫酸95%～98%(锦州古城化学试剂有限公司)。

VD-650型桌上式洁净工作台(苏州净化设备有限公司),JX-188手提式压力蒸汽灭菌器(宁波市镇海金鑫医疗器械有限公司),PRX-1500B智能人工气候箱(上海坤诚科学仪器有限公司),SLY-CY液晶自动数粒机(杭州绿博仪器有限公司),游标卡尺(上海首丰精密仪器有限公司)等。

1.2 种子种苗收集

五味子种子共收集23批次,种苗共收集21批次,产地遍布辽宁、吉林和黑龙江三省,种苗均为一年生种苗,每批不少于100棵,种子每批500 g。种子种苗经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为木兰科五味子属植物五味子,种子种苗收集信息如表1、表2,图1。

图1 五味子种子(a)、种苗(b)实验样品

注:a为培养后第5天开始观察结果;b～i为每天连续观察结果,i为最终发芽结果。

注:a为染色前;b为染色后。

表1 五味子种子信息记录

表2 五味子种苗信息记录

1.3 测定方法

参考GB/T 3543.1～3543.7—1995《农作物种子检验规程》[8],每批取至少500 g种子送检。随机选取种子100粒,3次重复,对种子的外观及形态特征进行测量记录,得种子真实性信息;四分法选取每批50 g,把称量好的种子置于超净工作台上,将种子与杂质分离,3次重复,取3次均值得种子净度;每批种子1 000粒重,3次重复,取3次称量均值得种子千粒重;称取每批五味子种子2 g,在130 ℃条件下烘干5 h,直至2次称重变化在0.003 g以内,即为烘干结束,3次重复,取3次测定均值得种子含水量;清水浸透五味子种子每批100粒,在30 ℃的恒温环境中暗处理约48 h,用解剖刀沿种子胚中心线将种子纵切为二,使其胚外露,用TTC染色法染色,3次重复,取3次重复均值为种子生活力;挑选洁净未经沙藏的五味子种子150粒,置于40～45 ℃温水中浸泡后,用浓硫酸(95%～98%)浸泡7 min,致使种子种皮变黑。处理好后将种子用清水冲洗3遍,然后置于500×106的赤霉素中处理24 h,后在发芽床上放置50粒种子(n=3),置于25 ℃恒温环境中,湿度50%,每天自然光照12 h进行培育。

连续观察3 d检查其发芽情况,无种子发芽,视为种子发芽结束。

取21批各产地种苗100棵,对苗长、茎粗、根长、根粗、芽数、侧根数、单株重、每100 g种苗数等8个指标进行测定,用卷尺测量苗长(从种苗最下端到最上端的长度),游标卡尺测量茎粗(主要茎秆的直径),利用直尺测量根长(根最顶端到最下端的长度),利用游标卡尺测量根径(根的中部直径),芽数为种苗各分枝存在的芽的数量,侧根数为种苗主根旁现存的侧根数量,单株重为利用电子天平称取去除杂质的单株种苗的重量,每100 g种苗数为利用电子天平称取100 g种苗,按比例计算得出的种苗数。

种子净度/%=(供检种子重量-杂质总重量)×100%;

发芽率/%=(发芽种子数/种子总数)×100%。

1.4 数据处理

运用SPSS26.0软件对种子种苗指标进行统计描述与方差分析、相关性分析、K-均值聚类分析等数据处理方法[9]。根据K-均值聚类结果按照最低定级原则制定五味子种子种苗质量分级标准。

2 结果与分析

2.1 五味子种子种苗指标测定结果

五味子种子呈椭圆状肾形,表面黄褐色,平滑,有光泽,长3.3～5.8 mm,宽2.8～4.7 mm,厚1.8～3.4 mm,种子大小均一,饱满度好,种脐位于种子腹侧凹入处,种皮硬而脆;种苗红褐色或灰褐色,外皮具皱纹,根较细且侧根较多。

对23批五味子种子5种指标进行测定并统计分析,结果见表3、表5。结果表明,各批次种子净度、千粒重、生活力、含水量和发芽率等5个指标均具有显著性差异,且F值大小顺序依次为:发芽率、千粒重、含水量、生活力、净度。对21批五味子种苗8种指标进行测定并进行统计描述与方差分析,结果见表4、表6。结果表明,苗长、茎粗、根长、根粗、芽数、侧根数、单株重和每100 g种苗数等8个植株指标均具有显著性差异,且F值大小顺序依次为:茎粗、每100 g种苗数、苗长、侧根数、单株重、根长、芽数、根粗,本实验所用五味子种子种苗差异性较大,可以作为种苗分级依据。

表3 各产地五味子种子指标测定结果

表4 各产地五味子种苗指标

表5 各产地五味子种子信息统计描述与方差分析

表6 各产地五味子种苗信息统计描述与方差分析

2.2 种子种苗分级指标的确定

对不同产地五味子种子种苗各指标数据进行相关性分析,结果如图4。五味子种子中千粒重与净度呈极显著正相关,与含水量呈显著正相关。五味子种苗中苗长与根长、芽数、侧根数、单株重呈极显著正相关,茎粗与根粗呈极显著正相关,根长与芽数、单株重呈极显著正相关,芽数与侧根数、单株重呈极显著正相关,每100 g种苗数与苗长、根长、芽数、单株重呈极显著负相关,侧根数与根长、单株重呈显著正相关。由此可得,五味子种子越重,含水量越高,其种子净度也越高;五味子种苗苗长越高,根长越长,芽数、侧根数越多,单株重越大,每100 g种苗数越少,而根粗与茎粗则与其他指标无显著相关。结合方差分析可知,采用净度、千粒重、含水量、生活力及发芽率等5个指标作为种子分级候选指标;采用苗长、根长、芽数、单株重、每100 g种苗数等5个指标作为种苗分级候选指标。

图4 五味子种子(a)、种苗(b)相关性热图

2.3 五味子种子种苗分级标准制定

对各产地五味子种子的5个指标信息和种苗的8个指标信息进行K-均值聚类分析,分别得到4个聚类中心,结果如表7、表8。

表7 五味子种子指标聚类中心

表8 五味子种苗指标聚类中心

由方差分析可知,五味子种子各指标中,净度、千粒重和生活力差异性不显著,因此,选择含水量和发芽率等2个指标作为分级标准首要指标,净度、千粒重和生活力为分级次要指标;五味子种苗各指标中,茎粗、根粗、侧根数差异性不显著,因此,选择苗长、根长、芽数、单株重、种苗数/100g 5个指标作为种苗分级主要指标。见表9～表12。

表9 五味子种子分级指标方差分析

表10 五味子种苗分级指标方差分析

表11 五味子种子最终聚类中心类间距离

表12 五味子种苗最终聚类中心类间距离

在五味子种子聚类中心结果中,第1类与第2、4类距离较近,与第3类距离较远。结合种子质量指标信息,以发芽率、生活力为主要参考指标,可将种子分为3个等级,其中第1类为一级种子,第2、4类为二级种子,第3类为三级种子。种子分级标准见表13。

表13 五味子种子分级标准

在五味子种苗聚类中心结果中,第1类与第3类距离最近,与第2类次之,与第4类距离最远。结合种苗质量指标将五味子种苗分为4级,第4类为一级苗指标,第2类为二级苗指标,第3类为三级苗指标,第1类为四级苗指标。种苗分级标准见表14。

表14 五味子种苗分级标准

根据K-均值聚类结果,23批五味子种子被分为3个等级,一级种子有3批,占全部样品的13.04%,二级种苗16批,占全部样品的69.57%,三级种苗4批,占全部样品的17.39%;21批五味子种苗被分为4个等级,一级苗有3批,占全部样品的14.3%;二级苗有6批,占全部种苗的28.6%;三级苗有10批,占全部种苗的47.6%;四级苗有2批,占全部种苗的9.5%。

3 讨 论

种子种苗作为中药材有效性和安全性的重要基础保障,一直备受关注。种子种苗规范的制定是中药材安全有效应用临床的前提,目前我国种子种苗标准体系尚不完善,需要不断更新迭代,为药用植物资源栽培体系添砖加瓦。目前,五味子种子种苗质量良莠不齐,一方面是对五味子种子种苗质量的忽视,而另一方面是种子种苗质量标准的缺失或长时间未更新[10-11],导致栽培五味子种子种苗成活率和结果率不高,造成道地药材五味子产量、质量、临床疗效及知名度下降等问题。

本实验通过收集不同产地23批五味子种子和21批五味子种苗,采用相关性分析、聚类分析等方法,分别以净度、千粒重、生活力、含水量和发芽率等5个指标和苗长、根长、芽数、单株重、每100 g种苗数等5个指标为参考确定五味子种子种苗分级标准,种子分为3个等级,其中一级种子标准为净度≥96%,千粒重>29.08 g,含水量>6.75%,生活力>98.22%,发芽率>81.33%;二级种子标准为净度≥96%,千粒重25.89～29.08 g,含水量6.52%～6.75%,生活力72.55%～98.22%,发芽率11%～81.33%;三级种子(不合格种子)标准为净度<96%,千粒重<25.89 g,含水量<6.52%,生活力<72.55%,发芽率<11%。种苗分为4个等级,其中一级种苗标准为苗长>58.177 cm,根长>22.047 cm,芽数>17个,单株重>7.873 g,每100 g种苗数<15棵;二级种苗标准为苗长>34.803～≤58.177 cm,根长>15.935～≤22.047 cm,芽数>12～≤17个,单株重>3.055～≤7.873 g,每100 g种苗数>15～≤31棵;三级种苗标准为苗长26.453～34.803 cm,根长14.715～15.935 cm,芽数10～12个,单株重1.442～3.055 g,每100 g种苗数 >31～≤70棵;四级种苗(不合格种苗)标准为苗长<26.453 cm,根长<14.715 cm,芽数<10个,单株重<1.442 g,每100 g种苗数>70棵。如一批五味子种子种苗中当不合格数≤5%时,判该批合格,当不合格数 > 5%时,判该批不合格,则划为下一级。