靶向细胞器的DNA纳米材料用于疾病治疗

李文,周丽,马祎

(中国药科大学 工学院,江苏 南京 211198)

随着对疾病发展分子机制的研究,靶向细胞器进行药物递送成为了精准医疗更深层次的目标,开发高效的个性化药物可解决耐药性等临床问题。DNA纳米材料凭借其高度的可编程性等优势在众多药物载体中脱颖而出。总结了DNA纳米材料靶向不同亚细胞器进行药物递送的应用。

1 靶向细胞核

作为真核细胞的“中央处理器”,细胞核在细胞的代谢、生长和分化中起着重要的作用。细胞核的功能障碍可导致包括癌症在内的不同疾病发生。靶向、干预细胞核可直接诱导细胞死亡,有效治疗各种疾病。将药物传递到细胞核主要有两种策略:(1)在纳米载体表面修饰核靶向配体,如核定位信号肽(NLS)[1];(2)精确控制纳米载体的尺寸,使其足够小以便通过核孔通道进入细胞核内[2]。其中,NLS在核靶向DNA纳米结构的构建中起到重要作用。研究表明,无修饰的纯DNA纳米结构常以小窝蛋白依赖的内吞途径进入细胞,并自然存在于溶酶体中。通过功能化基团修饰后的DNA纳米结构更有效逃逸溶酶体,靶向目标细胞器发挥作用。Fun团队利用电击化学将NLS功能化DNA四面体(TDN),利用荧光信号观察TDN进入细胞后的命运。结果显示,NLS-TDN定位于细胞核内,而没有NLS的TDN大多局限于细胞质中,这一进展为核靶向治疗提供强大理论基础[3]。作为遗传物质的储存中心,向细胞核中递送核酸药物是疾病治疗的有效手段。Ding等设计的TDN将反义寡核苷酸沉默原癌基因c-raf和核靶向肽进行整合,功能化的DNA四面体可以被A549细胞内化,并协助反义寡核苷酸向细胞核传递,从而增加下调细胞核和细胞质中靶标mRNA的机会[4]。

另外,研究报道核酸适配体AS1411可主动靶向细胞核,并特异性结合核仁蛋白,防止DNA损伤修复,促进细胞凋亡[5]。在DNA纳米材料设计时引入AS1411序列,可实现肿瘤靶向给药。Lin等人比较了AS1411修饰的TDN(Apt-TDNs)与纯TDN缺氧条件下在不同细胞系中的摄取差异及对细胞生长周期的影响。大量的Apt-TDNs进入并积累在MCF-7细胞(乳腺癌细胞)的细胞核中,而进入L929细胞(成纤维细胞)的Apt-TDNs数量相对较少。Apt-TDNs可以抑制MCF-7细胞生长,促进L929细胞生长,而TDNs对MCF-7和L929细胞生长影响无明显差异[6]。实验结果表明Apt-TDNs在缺氧条件下可有效地将抗癌药物转运到肿瘤细胞的细胞核,少量进入正常细胞,从而增强化疗药物对肿瘤细胞的作用,减少化疗药物对正常细胞的副作用。

除了采用纳米材料表面修饰核靶向分子外,从纳米结构尺寸入手,直接构建比核孔更小的纳米载体是细胞核靶向治疗的潜在方法。基于DNA自组装技术与金属纳米颗粒的结合,Tan等人开发了一种可控制纳米平台(称为纳米卡车),可以将抗癌药物送入细胞核。这种纳米载体由一个金-银纳米棒(NR)和多个小的金纳米颗粒(NPs)组成。具体来说,通过CS/DAS的杂交,小型载药NPs(纳米药物)可以自组装到大型纳米棒的侧面。由于纳米棒在两端被细胞类型特异性的内化DNA适配体修饰,它可以作为引导载体,穿透细胞膜进入细胞质。然后,采用NIR激光器(808 nm)照射,通过基于光热效应的CS/DAS双相变性,触发纳米药物的释放。因此,纳米药物可以进入细胞核,在那里它们可以持续释放化疗药物,诱导细胞凋亡[7]。此外,该研究小组还开发了一种可控大小的DNA纳米花(NFs),将化疗药物阿霉素(Dox)递送到细胞核。据报道,纳米花是一种由DNA组分自组装而成的多功能DNA纳米结构。在生物医学中,DNA NFs作为药物纳米载体存在一定的缺陷,导致货物生物利用度低、治疗效果差的局限性。为了应对这些限制,研究人员将含有金属的人工类似物加入到DNA链中,以控制DNA纳米花的大小和功能,并引入二茂铁碱来控制纳米花的大小从1 000～50 nm。所得到的材料Sgc8-NFs-Fc可以在过氧化氢的存在下,通过Fenton的反应进行自然降解。实验证实,Sgc8-NFs-Fc/Dox可被癌细胞选择性地吸收。此外,在Fenton反应引起的自我降解后,负载的阿霉素迅速释放并积累在细胞核中,诱导细胞毒性增强[8]。

2 靶向溶酶体

溶酶体作为细胞物质运输的“中转站”,在细胞自噬、病原体降解等生命活动中起着至关重要的作用。溶酶体腔内微环境成分的变化与许多疾病的发生发展相关,包括自身免疫性疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病和癌症。因此,溶酶体靶向治疗具有重要意义。研究表明,大多数DNA纳米材料被细胞摄取后,通过小窝蛋白内吞途径可自然定位于溶酶体。利用这一特性,DNA材料常被用于溶酶体靶向的精准递药。例如,Odom的研究小组提出了一种基于DNA适配体与金纳米颗粒结合的纳米结构体系(HApt-AuNS)。HApt-AuNS首先与质膜上的HER2相互作用,形成HER2-HApt-AuNS复合物,并通过内吞作用内化。随后,HER2-HApt-AuNS复合物从核内体运输到溶酶体,在溶酶体中HER2被降解并导致细胞死亡[9]。另外,溶酶体内酸性环境为pH值响应型DNA纳米材料的应用提供了天然的有利条件。Liu等人设计了一种基于矩形DNA折纸的纳米机器,在预定位置延伸三个不同的捕获链。通过DNA杂交,将抗原(多肽)、toll样受体(TLR)激动剂、双链RNA(dsRNA)和CpG DNA精确地排列在DNA纳米装置上。为了保护抗原/佐剂免受细胞外核糖核酸的干扰,在矩形的边缘添加一条DNA链来锁定它,后者只在特定的pH值范围内解锁。当DNA纳米细胞进入抗原提呈细胞时,它们会优先进入溶酶体。在溶酶体的酸性环境中,打开矩形两侧的锁,暴露佐剂和抗原多肽,激活了很强的免疫力,有效消除小鼠的肿瘤[10]。Dong等人利用i-motif设计了一个质子驱动的DNA框架。在溶酶体的酸性环境下,DNA框架动态地组装成聚集体并保留在溶酶体中。同时,质子化作用导致了溶酶体酸度和水解酶活性的降低,阻碍了核酸药物在溶酶体中的降解,提高了基因沉默的效率。这种溶酶体干扰方法可能在保护核酸药物方面发挥突出的重要作用[11]。

然而,溶酶体中存在约60种水解酶,能够降解多种生物大分子,这对靶向溶酶体的DNA纳米材料稳定性提出挑战。Cui等人将半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64锚定在一个DNA纳米装置上,并通过尾静脉将该纳米装置注射到小鼠体内。DNA纳米装置优先内化,通过清除受体介导的途径定位于溶酶体,之后释放半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64,有效抑制溶酶体中半胱氨酸蛋白酶的活性,提高肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的抗原呈递能力。随后,将DNA纳米装置与抗癌药物环磷酰胺(CTX)联合使用,在治疗三阴性乳腺癌小鼠中显示出良好的效果[12]。

总之,基于DNA纳米结构易被细胞内吞并定位于溶酶体的特性,实现了对溶酶体的功能干预。通过溶酶体中酸性环境设计pH值响应性DNA纳米器件,实现了抗肿瘤药物的控释释放,并证明了其强大的肿瘤治疗效果。

3 靶向线粒体

线粒体作为细胞的“动力源”,在三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(ROS)的产生和细胞凋亡等环节中起重要作用。与其他亚细胞结构相比,线粒体具有特殊的结构特征。它由线粒体外膜(OMM)、线粒体内膜(IMM)、膜间空间(IMS)和基质组成。因此,将药物送入线粒体的最大挑战之一是如何通过大多数分子不渗透的双层线粒体膜[13]。由于线粒体进行氧化呼吸过程中存在质子泵,在线粒体基质中富集大量的负电荷,亲脂性阳离子进入细胞后,它们可以利用线粒体的高膜电位主动靶向线粒体,因此,大多数被线粒体靶向的DNA纳米器件都是通过修饰亲脂性阳离子配体来实现的。如三苯基膦(TPP)含有三个带有正电荷的亲脂性苯基,DNA纳米结构经TPP修饰后可选择性地定位于线粒体。Li等人在DNA四面体的一个顶点上修饰TPP,并设计了一个富含鸟嘌呤的DNA序列在其他顶点。在细胞质的高浓度钾离子的触发下,多个四面体框架形成稳定的G-四链体结构,允许DNA四面体聚集在线粒体表面,形成一个阴离子屏障。这种纳米装置显著抑制了线粒体的有氧呼吸和糖酵解,减少了细胞内ATP的产生,抑制了癌细胞的迁移[14]。

除TPP外,线粒体靶向信号肽(MTS)也是一种常用的线粒体靶向配件。如D-(KLAKLAK)2(KLA)是一种带正电荷的特异性线粒体靶向序列,它可以破坏线粒体膜并启动细胞凋亡。Li的团队开发了一种KLA功能化的四面体DNA纳米结构,将蒽环类抗癌药物(Dox)送入线粒体。首先,KLA通过叠氮化物和炔基的“点击化学”偶联到DNA的5’端,形成大小约为15 nm、具有高生物稳定性的KLA-TDN偶联物。然后,将能够杀死癌细胞的阿霉素分子插入TDN中,达到77%的加载效率。利用KLA偶联的TDN,将抗癌药物转移到乳腺癌细胞中,并在线粒体中积累,激活线粒体介导的程序性凋亡途径,并在体外实现增强的抗癌作用[15]。

4 靶向内质网和高尔基体

靶向蛋白降解已经成为治疗疾病的重要手段。靶向嵌合体的蛋白水解(PROTACs),利用泛素蛋白酶复合体系统(UPS)降解蛋白,利用自噬靶向嵌合体(AUTAC)和通过自噬途径消除选择性蛋白已作为靶向细胞质或细胞膜蛋白的方法[16-17]。然而,在特定膜结合细胞器(MBOs)中的过表达蛋白的降解可能不适用于这些降解工具。内质网作为重要的膜结合细胞器,在蛋白质的生物合成及修饰环节起关键作用。靶向内质网进行蛋白降解有望从源头控制疾病发展,加速疾病治疗进程。Qian等人开发了一种DNA纳米装置,利用具有特定配体功能化的DNA纳米结构选择性地捕获内质网定位的蛋白,然后将它们转运到溶酶体进行降解。通过该技术,可实现外源性ERsostird蛋白(ER-eGFP)和内源性过表达分子伴侣(葡萄糖调节蛋白78)在癌细胞中高效降解[18]。You等人开发了一种内质网靶向多肽体(pardaxin,PAR)修饰的阳离子脂质体(PAR-Lipo),以提高基因传递效率。结果表明,PAR-Lipos可以通过细胞内的非溶酶体途径积累到内质网,诱导DNA有效载荷滞留在细胞核,促进它们进入细胞核依赖内质网和核膜之间间隙,提供了在细胞中有效传递基因的替代方法[17]。

高尔基体由许多扁平的囊泡组成,主要负责生物合成、分泌和细胞内信号转导。近年来的研究表明,高尔基体在细胞骨架、钙稳态和有丝分裂的调节中起着重要的作用[19]。Jani等人设计了一种名为NOckout的DNA纳米装置,将NO敏感荧光团、内参考荧光团和反式高尔基网络(TGN)进行组合,利用适配体MUC1的靶向性,NOckout可特异性标记TGN管腔[20]。为探寻高尔基体在调节心脏功能、伤口愈合或癌症进展等方面的重要作用提供基础。

综上所述,当DNA纳米器件用于靶向其他亚细胞结构时,还需要修改相应的靶向模块。然而,目前关于用于靶向吞噬小体和高尔基体的DNA纳米装置的研究较少。这可能是因为这些细胞器的定位机制尚不清楚。另一方面,将现有的靶向基团与DNA纳米器件结合起来也可能存在技术上的困难。进一步丰富各种细胞器靶向的DNA纳米器件,将为亚细胞水平的基础研究和临床诊断提供强有力的工具。

5 展望

鉴于DNA纳米结构在干细胞、生物传感器和抗肿瘤治疗领域的许多令人兴奋的应用,它们有望成为未来的关键纳米材料。但其广泛的应用仍存在一些问题,对亚细胞水平的DNA纳米器件的研究主要集中在溶酶体、线粒体和细胞核上。对其他负责蛋白质合成和加工的核糖体、内质网和高尔基体的研究仍然不够。此外,目前还没有针对特定细胞内细胞器的给药系统达到临床试验阶段。未来对于DNA纳米材料的修饰、改造,应将使其能够更有效地靶向高尔基体、内质网等其他细胞器,进而促进新的靶向配体于药物传递策略的发展。