尿苷二磷酸-葡萄糖4-差向异构酶编码基因galE影响甘薯青枯菌致病性和碳代谢

张鸿，林志坚，祝金栋，林赵淼，李国良，许泳清，刘中华，邱永祥，邱思鑫*

（1.福建省农业科学院作物研究所/农业农村部南方薯类科学观测实验站/福建省特色旱作物品种选育工程技术研究中心，福建 福州 350013；2.三明市农业科学研究院，福建 三明 365509）

青枯劳尔氏菌复合种（Ralstonia solanacearumspecies complex, RSSC）简称“青枯菌”，是极具破坏性的植物病原细菌，能侵染超过54个科、250余种寄主[1]，在全世界造成严重的经济损失。青枯菌是一个复杂的菌群，由许多不同菌系组成，具有丰富的遗传多样性（种内DNA 同源性低于一般标准的70%）[2]。根据多相分类学（polyphasic taxonomic）方法[3]及基因组和蛋白质组学测序结果[1]，将RSSC分为3个基因型群：茄科劳尔氏菌、蒲桃劳尔氏菌和假茄科劳尔氏菌。此外，还有能反映菌株地理起源的演化型-序列变种[4-5]，与寄主范围相关的生理小种，以及其他生化型、血清型、溶源型等多种RSSC种内分类方法[6]。

由甘薯青枯菌造成的甘薯瘟病，是甘薯生产上最为严重的细菌性病害，能对我国南方甘薯产区造成毁灭性打击，发病田块甘薯产量一般损失20%～30%，严重者可达70%～80%，甚至全田绝收[7]。甘薯青枯菌属于假茄科劳尔氏菌（R.pseudosolanacearum）演化型Ⅰ型[8]，15号序列变种[9]，1号生理小种[10]，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ生化型[11]。目前，对于防治该病尚无特效药，通过对病原菌致病相关基因功能的研究，有利于靶标药物与植物免疫激发生防因子的研发。

有研究表明，在RSSC致病和非致病菌株中，约50%的差异表达基因与碳水化合物和氨基酸代谢相关[12]，强调了营养代谢对于青枯菌致病的重要性。galE基因编码尿苷二磷酸（uridine diphosphate,UDP）-葡萄糖4-差向异构酶（又名UDP-半乳糖4-差向异构酶），能催化依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD）的尿苷二磷酸葡糖（uridine diphosphate glucose, UDPG）和尿苷二磷酸半乳糖（uridine diphosphate galactose,UDP-Gal）相互转化，该基因位于半乳糖代谢途径中。在细菌中，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[13-14]和鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）[15]的galE基因能保护细胞免受半乳糖衍生物的毒害作用；空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）[16]和淋球菌（Neisseria gonorrhoeae）[17]的galE基因参与脂多糖的合成和毒力构成，该基因缺失后会影响菌体对寄主的黏附性；牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的galE基因参与脂多糖O-抗原合成和生物膜形成[18]；嗜热菌（Thermusspp.）的galE基因促进了胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）的生物合成和生物膜的形成[19]。植物病原细菌野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestrispv.campestris）中，galE基因缺失影响了菌体的生物膜形成[20]。

在前期的研究中，通过对甘薯青枯菌SPRS911菌株全基因组测序及致病相关功能注释，发现青枯菌中存在galE基因，预测与多糖荚膜形成有关。而galE基因是否与青枯菌致病性相关，目前鲜有文献报道。为此，本研究以甘薯青枯菌为研究对象，克隆甘薯青枯菌中的galE基因，通过反向遗传学构建galE基因敲除菌株及回补菌株，明确基因与青枯菌致病表型的关联性和对青枯菌生理生化特性（特别是碳代谢）的影响，以期为进一步利用青枯菌致病机制进行病害防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用甘薯材料为感甘薯瘟病品种‘新种花’，来源于福建省农业科学院作物研究所薯类研究室种质资源圃。实验中所用的菌株和质粒信息见表1，培养基成分与用途见表2。

表1 本研究中所用菌株与质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究中所用培养基Table 2 Media used in this study

1.2 实验方法

1.2.1 GALE 氨基酸序列的系统进化分析

将甘薯青枯菌SPRS911 的GALE 氨基酸序列在NCBI网站上使用BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对，获得与之接近的青枯菌不同基因型群、同属不同种以及不同属菌株的同源序列。利用MEGA6软件中的ClustalW程序对上述GALE 氨基酸同源序列进行比对与分析[21]，并使用邻接法（neighbor joining, NJ）构建系统发育树。系统发育树可靠性采用自展法（bootstrap）评估，测试重复次数设置为500次。

1.2.2galE基因敲除与回补载体构建

敲除载体构建：以甘薯青枯菌SPRS911 的总DNA为模板，以galE-UP-F/galE-UP-R为引物扩增galE基因上游重组臂，以galE-DO-F/galE-DO-R为引物扩增galE基因下游重组臂，引物序列见表3。提取自杀性pK18mobScaB 载体的质粒。galE基因上、下游重组臂的聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增片段融合后，与pK18mobSacB质粒分别用EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切，回收酶切产物并连接。将连接产物转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，通过galE-UP-F/galE-DO-R 引物进行PCR扩增，并用EcoRⅠ、HindⅢ进行酶切验证，以获得重组质粒pK18-galE。

表3 本研究中所用引物Table 3 Primers used in this study

回补载体构建：以甘薯青枯菌SPRS911 的总DNA 为模板，采用BRgalE-F/BRgalE-R 引物扩增galE基因全长并进行回收、测序，引物序列见表3。提取回补骨架pBBR1MCS-5 质粒。galE基因全长序列与pBBR1MCS-5 质粒分别用HindⅢ、SpeⅠ进行双酶切，回收酶切产物并连接。将连接产物转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，通过BRgalE-F/BRgalE-R引物进行PCR扩增，并采用HindⅢ、SpeⅠ进行酶切验证，以获得回补质粒pBBR-galE。

1.2.3 甘薯青枯菌galE基因敲除与回补菌株构建

采用FAN 等[22]的三亲结合方法，将pK18-galE和pBBR-galE重组质粒分别转化入目标菌株。

galE基因敲除菌株ΔgalE构建：分别采用液体培养基培养含pK18-galE的大肠埃希菌DH5α菌株（含Kmr，50 µg/mL）、大肠埃希菌MT616 菌株（含Cmr，20 µg/mL）和甘薯青枯菌SPRS911 菌株（含PBr，50 µg/mL）。菌液离心并用无菌水洗涤2次，用无菌水重悬，调整菌液浓度至D（600 nm）=1.0后，将上述3种菌液以体积比1∶1∶4混合后涂在CPG平板上，在30～37 ℃下共培养48 h。第1 次筛选：用含有多黏菌素B 和卡那霉素的CPG 平板筛选出能正常生长的菌落（多黏菌素B 用于去除2 个大肠埃希菌菌株，卡那霉素用于筛选完成同源重组第1 次交换的青枯菌）。第2次筛选：用含有10%蔗糖的CPG平板筛选出能正常生长的菌落（10%蔗糖用于筛选完成同源重组第2次交换的青枯菌）。第3次筛选：筛选出能在CPG平板正常生长，但在含有卡那霉素的CPG平板上不能生长的菌落（完成同源重组的基因敲除菌株不具备卡那霉素抗性）。筛选完成的菌株用galE-UP-F/galE-DO-R 引物进行PCR 扩增和测序验证。

回补菌株CΔgalE构建：将含pBBR-galE的大肠埃希菌DH5α菌株、大肠埃希菌MT616 菌株和ΔgalE混合共培养后，用含有庆大霉素的CPG 平板筛选阳性菌株，用BRgalE-F/BRgalE-R 引物进行PCR扩增和测序验证。

1.2.4 菌落形态观察

将待测菌株接种至CPG 液体培养基中，于28 ℃、180 r/min 下振荡培养12 h，用无菌水稀释1×107～1×108倍，取100 μL 稀释液涂布于CPG 平板上，于28 ℃下培养3 d，使其长出单菌落。观察菌落形态及流动性，拍照并记录。

1.2.5 生长曲线测定

将待测菌株接种至CPG 液体培养基中，于28 ℃、180 r/min下振荡培养至菌液浓度D（600 nm）=1.0，取1 mL菌液接种到100 mL CPG液体培养基中进行振荡培养，每3 h 测定一次D（600 nm）值，每个菌株设置3个生物学重复。

1.2.6 致病性测定

采用剪叶法[23]将待测菌株接种至甘薯感病品种‘新种花’，菌液浓度为D（600 nm）=1.0，每个菌株接种10 片叶，重复3 次，以接种不含菌体的CPG 液体培养基叶片为阴性对照，接种后6～7 d统计叶片发病情况。以叶脉发病长度进行病害分级：0级，叶脉不变色；1级，叶脉变成黄褐色部分占切口以上叶片长度的1/4 及以下；3 级，叶脉变成黄褐色部分占切口以上叶片长度的＞1/4～2/4；5 级，叶脉变成黄褐色部分占切口以上叶片长度的＞2/4～3/4；7 级，叶脉变成黄褐色部分占切口以上叶片长度的3/4 以上；9 级，叶脉全部变成黄色，叶片萎蔫。病情指数（I）按下式计算。

式中，n为对应发病级别叶片数，N为参试叶片总数。

根据病情指数评价甘薯青枯菌致病性，评定标准如下：极弱，病情指数≤5.0；弱，5.0＜病情指数≤20.0；中，20.0＜病情指数≤50.0；强，50.0＜病情指数≤80.0；高强，80.0＜病情指数≤100.0。

1.2.7 泳动能力检测

参照陈小强等[24]的方法并稍作改进，将待测菌株接种于CPG液体培养基中，于28 ℃、180 r/min下振荡培养至菌液浓度D（600 nm）=0.3，吸取0.5 μL菌液接种于含0.3%琼脂的CPG 半固体培养基中央，于28 ℃培养箱中平置，观察待测菌株的运动情况。培养至菌体在培养基上有明显的菌圈（约24 h）后，每隔12 h测量菌圈的直径，每个菌株设置3个生物学重复。

1.2.8 胞外多糖含量检测

将待测菌株接种至SP液体培养基中，于28 ℃、180 r/min 下振荡培养至菌液浓度D（600 nm）=1.0后，以12 000 r/min 离心5 min，取上清液于离心管中，进行真空浓缩。取0.2 mL 浓缩样品加入1 mL无水乙醇，于4 ℃下静置1 h。以12 000 r/min 离心5 min 后弃上清液，并向离心管中加入1 mL 80%乙醇溶液并混匀，以12 000 r/min 离心5 min 后弃上清液，随后轻轻将离心管倒置在吸水纸上吸干多余的上清液。向所得沉淀中加入2 mL ddH2O，在95 ℃金属浴中使沉淀全部溶解，即得到多糖待检液。多糖检测方法参考多糖含量试剂盒说明书（G0593W，苏州格锐思生物科技有限公司），每个菌株设置3个生物学重复。

1.2.9 生物膜形成量测定

参照梁欢[25]的方法并稍作改进，将过夜培养的待测菌液浓度调整至D（600 nm）=0.3，分别取600 μL 菌液加到60 mL NB 培养基中，在28 ℃下静置培养7 d 后，加入600 μL 0.1%结晶紫溶液后在室温下染色30 min，随后用ddH2O小心冲洗，在室温下静置4～6 h，加入2 mL 95%乙醇溶液重悬试管壁上的生物膜，以加入600 μL 95%乙醇溶液为对照组，最后在酶标仪中测定490 nm波长处的吸光度值。

1.2.10 甘薯青枯菌半乳糖代谢相关基因表达量的qRT-PCR 检测

根据甘薯青枯菌SPRS911 基因组在京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）中的代谢途径预测结果，采用NCBI 网站Primer-BLAST 平台设计参与基因的qRT-PCR 引物（表3），以qgyrA-F/qgyrA-R 扩增青枯菌内参基因。待测菌株接种甘薯品种‘新种花’叶片12 h 后，取接种部位周围叶片组织，用RNA 提取试剂盒（TransZol Up Plus RNA Kit，北京全式金生物技术有限公司）提取植物和细菌总RNA，分别用ABScript Neo RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover 和 BrightCycle Universal SYBR Green qPCR Mix with UDG 试剂盒（武汉爱博泰克生物科技有限公司）进行反转录和qRT-PCR扩增。每个菌株设置3 个生物学重复，每个样品设置3 个平行反应，采用2－ΔΔCT法计算基因的相对表达水平。

1.2.11D-葡萄糖-6-磷酸含量检测

取在CPG 液体培养基中摇培至菌液浓度D（600 nm）=1.0 的待测菌株，以12 000 r/min 离心5 min，弃上清液；加入ddH2O 重悬，超声破碎细菌，超声条件为冰浴，功率200 W，超声3 s，间隔10 s，总时长为20 min；以12 000 r/min 离心10 min，得到的上清液即为待检液。D-葡萄糖-6-磷酸含量检测参考葡萄糖-6-磷酸检测试剂盒说明书（G0825W，苏州格锐思生物科技有限公司）进行，每个菌株设置3个生物学重复。

1.2.12 API 20 NE 生理生化检测与酶活性检测

API 菌种鉴定系统是由法国生物-梅里埃公司生产的细菌数值分类分析鉴定系统，由不同类别API试剂条（盒）和检索工具组成。本研究使用的是API 20 NE非肠道革兰氏阴性杆菌试剂条，包括8个标准化常规测试、12个同化试验和1个氧化酶检测，通过显色反应判断结果。待测菌株在CPG 固体培养基上以28 ℃培养3 d 后，挑取单菌落分别用于氧化酶检测和用0.85% NaCl 溶液制成菌悬液接种试剂条，试剂条在28 ℃下静置48 h后判读结果。

将待测菌株分别接种于纤维素、淀粉和果胶培养基（表2）上，以判断与细菌致病性相关的纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的活性。纤维素酶阳性试验结果为在菌体周围出现透明圈，而培养基其余部分呈蓝色；淀粉酶试验中，待菌落长出后在培养基表面滴加一层碘液，阳性试验结果为菌落周围培养基无色，而其余部分呈紫黑色；果胶酶阳性试验结果为菌体周围出现凹陷。

1.3 数据处理与分析

实验数据均使用GraphPad Prism 9.2.0 软件进行统计学分析和绘图。相同条件下的多样本间差异采用单因素方差分析，图片中误差线为均值标准误（standard error of mean, SEM）。

2 结果与分析

2.1 甘薯青枯菌GALE 蛋白结构预测

galE基因位于甘薯青枯菌大质粒上，全长1 026 bp，编码341个氨基酸。通过SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）对GALE 蛋白三级结构进行预测，结果显示：该蛋白质以同源二聚体形式存在（图1A），在已明确晶体结构的蛋白质中，与之最相近的是人类病原菌类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）的UDP-葡萄糖4-差向异构酶（SMTL ID：3enk.1），两者氨基酸序列相似度为65.87%（图1B）。3enk.1蛋白（图1C）每个单体都能与NAD 和尿苷-5´-二磷酸葡萄糖（uridine 5´-diphosphoglucose, UPG）配体相结合。

图1 GALE蛋白和UDP-葡萄糖4-差向异构酶结构Fig.1 Structures of GALE protein and UDP-glucose 4-epimerase

2.2 GALE 序列的系统进化分析结果

由于甘薯青枯菌的菌群复杂，为明确galE基因在甘薯青枯菌不同基因型群间的亲缘关系，以及在种、属外其他菌群中的进化特征，将甘薯青枯菌SPRS911菌株的GALE氨基酸序列在NCBI网站中进行比对并用邻接法开展进化树分析。结果（图2）表明，在RSSC 中，甘薯青枯菌的GALE序列与同在假茄科劳尔氏菌基因型群的菌株最为接近，序列最高相似度达100.00%（登录号：WP_011004390），其次是蒲桃劳尔氏菌，序列最高相似度为98.83%（登录号：CCA79832），以及茄科劳尔氏菌，序列最高相似度为98.53%（登录号：EAP74886）。同属其他菌群中，与甘薯青枯菌的GALE序列最接近的是解甘露醇劳尔氏菌（R.mannitolilytica）（登录号为AJW47277，序列相似度为94.13%）。其他属的菌株中，甜瓜黑点根腐病菌（Monosporascus cannonballus）（登录号为RYO75877，序列相似度为92.38%）和草酸贪铜菌（Cupriavidus oxalaticus）（登录号为QEZ44291，序列相似度为81.31%）与甘薯青枯菌的GALE序列相似度最高。

图2 基于GALE氨基酸序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on GALE amino acid sequences

2.3 galE 基因敲除、回补菌株的构建及基因表达量检测结果

采用三亲结合方法，将连入galE基因上、下游片段的重组自杀质粒pK18-galE导入甘薯青枯菌SPRS911，获得galE基因敲除菌株ΔgalE。用galEUP-F/galE-DO-R 引物进行PCR 验证，结果（图3A）表明ΔgalE扩增片段大小为1 326 bp（上、下游同源重组序列总长），SPRS911扩增片段大小为2 334 bp（上、下游同源重组序列与敲除部分序列总长），测序结果与预期一致。同样采用三亲结合方法，将构建完成的回补载体pBBR-galE导入ΔgalE，经过含庆大霉素平板的筛选，获得回补菌株CΔgalE，用BRgalE-F/BRgalE-R 引物进行PCR 验证，CΔgalE扩增得到大小为1 026 bp的序列（图3B），测序结果与预期一致。将野生型及基因改造菌株接种甘薯叶片12 h后提取接种部位RNA，采用qRT-PCR 扩增galE基因，结果（图3C）发现野生型及回补菌株的galE基因相对表达量均显著高于敲除菌株。

图3 galE基因敲除菌株和回补菌株的验证Fig.3 Verification of the galE gene knock-out and complementary strains

2.4 galE 基因缺失对青枯菌生长的影响

在CPG-TTC 平板上培养3 d 后，SPRS911 与CΔgalE菌落形态相似（图4），菌体表面似有一层光滑透亮的胶状物质，因流动性强而造成菌体形状不规则，易与周围菌落粘连。而ΔgalE菌落周围胶状物质流动性差，菌落较小，呈规则圆形。在CPG 液体培养基中对3 种菌株进行生长曲线测定，发现3种菌株进入对数生长期后的生长速率与生长量相似，但在对数生长后期至平稳期（15 h后），ΔgalE的生物量[用D（600 nm）表示]要低于SPRS911 和CΔgalE（图5）。

图4 SPRS911、ΔgalE 和CΔgalE 菌株在CPG-TTC 平板上的菌落形态Fig.4 Colony morphologies of SPRS911, ΔgalE and CΔgalE strains on CPG-TTC plates

图5 SPRS911、ΔgalE 和CΔgalE 菌株在CPG 液体培养基中的生长曲线Fig.5 Growth curves of SPRS911, ΔgalE and CΔgalE strains in CPG liquid media

2.5 galE基因缺失对青枯菌致病相关性状的影响

采用剪叶法测定SPRS911、ΔgalE和CΔgalE菌株对甘薯感病品种‘新种花’的致病性。病情等级判定标准如图6A 所示。接种后6 d 可见SPRS911 与CΔgalE接种的甘薯叶片主脉出现显著的枯黄症状（图6B），而ΔgalE接种的甘薯叶片主脉多维持正常青绿色。判断每片接种叶片的发病等级，并最终计算植株整体病情指数，结果（图6C）显示，SPRS911与CΔgalE病情指数分别为75.1和62.4，属于强致病等级，而ΔgalE致病性下降至15.6，为弱致病等级。

图6 SPRS911、ΔgalE和CΔgalE菌株对甘薯叶片的致病性Fig.6 Pathogenicity of SPRS911, ΔgalE and CΔgalE strains on sweet potato leaves

菌体的泳动能力、胞外多糖含量和生物膜形成量也是衡量青枯菌致病性的关键指标。泳动能力是青枯菌进入植物维管束并扩展的关键因素，胞外多糖对菌体逃避寄主免疫防御及引起寄主萎蔫症状至关重要，生物膜是菌体感应调控与抵御逆境的关键。对这3个指标测定的结果显示，ΔgalE的泳动能力（图7）、胞外多糖含量（图8）和生物膜形成量（图9）均显著低于SPRS911与CΔgalE。

图7 SPRS911、ΔgalE和CΔgalE菌株的泳动能力Fig.7 Swimming mobility of SPRS911, ΔgalE and CΔgalE strains

图8 SPRS911、ΔgalE和CΔgalE菌株的胞外多糖含量Fig.8 EPS contents of SPRS911, ΔgalE and CΔgalE strains

图9 SPRS911、ΔgalE和CΔgalE菌株的生物膜形成量Fig.9 Biofilm formation in SPRS911, ΔgalE and CΔgalE strains

2.6 galE 基因缺失对青枯菌半乳糖代谢的影响

根据甘薯青枯菌SPRS911基因组的KEGG代谢途径分析结果，可知galE基因参与半乳糖代谢途径。在该途径中，共注释到包括galE基因在内的11个基因。分别在上述3 种菌株侵染甘薯感病品种‘新种花’12 h 后取样，采用qRT-PCR 检测不同菌株受寄主诱导后参与半乳糖代谢基因的差异表达情况，结果（图10）显示：galE基因缺失后，galU、pgm、glk、lacC基因相对表达量显著降低，dgoK、dgoAa、dgoAb、malZ、galM基因相对表达量显著升高。

图10 SPRS911、ΔgalE和CΔgalE菌株接种甘薯后其半乳糖代谢相关基因的表达量Fig.10 Galactose metabolism related gene expression levels of SPRS911, ΔgalE and CΔgalE strains after inoculating sweet potatoes

以galE为枢纽，将基因表达结果与甘薯青枯菌半乳糖代谢途径相对应，结果（图11）表明：galE参与UDPG和UDP-Gal的相互转化，与galE基因表达趋势一致的是参与UDPG代谢的基因（图11中红色字体）。一方面，UDPG能直接参与戊糖和葡糖醛酸之间的相互转化途径；另一方面，galU催化UDPG与D-葡萄糖-1-磷酸间的相互转化，pgm催化D-葡萄糖-1-磷酸与D-葡萄糖-6-磷酸间的相互转化。而D-葡萄糖-6-磷酸作为一个关键物质，既能直接参与Entner-Doudoroff（ED）途径（细菌的一种糖酵解途径），又能在glk的作用下形成D-葡萄糖，参与果糖和甘露糖代谢途径。

图11 galE基因参与的甘薯青枯菌半乳糖代谢途径Fig.11 galE gene involved galactose metabolism pathway of R.pseudosolanacearum

D-葡萄糖-6-磷酸是ED 途径的第1 个代谢物，是磷酸戊糖循环的起始物，也是生物供能和核酸合成的重要原料。有研究报道，ED 途径的激活会抑制生物膜的形成[26]。用酶促反应的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide, NADH）显色反应测定相同条件下SPRS911、ΔgalE和CΔgalE菌株的D-葡萄糖-6-磷酸含量，发现ΔgalE的D-葡萄糖-6-磷酸含量极显著高于SPRS911和CΔgalE（图12）。

图12 SPRS911、ΔgalE 和CΔgalE 菌株的D-葡萄糖-6-磷酸含量Fig.12 D-glucose 6-phosphate contents of SPRS911, ΔgalE and CΔgalE strains

参与UDP-Gal 代谢反应过程的基因表达趋势与galE基因相反（图11中绿色字体），目前尚未预测到甘薯青枯菌中有基因直接参与从UDP-Gal 到蔗糖，UDP-Gal 到D-半乳糖及α-D-半乳糖，再到半乳糖醛酸的转化过程，但是galE基因缺失影响了参与上述3 个代谢方向基因的表达。galE基因缺失后，malZ基因表达量升高，促进蔗糖转化为D-果糖；galM基因表达量升高，将D-半乳糖构象转变为α-D-半乳糖，并在后续参与氨基糖与核苷酸糖代谢；dgoAb、dgoK和dgoAa基因表达量升高，这3 个基因参与半乳糖醛酸到D-甘油醛-3-磷酸转化的不可逆级联途径，并在后续进入磷酸戊糖途径。与D-甘油醛-3-磷酸相关的还有D-塔格糖-6-磷酸的磷酸基团转移过程，参与该过程的lacC基因与galE基因表达趋势一致。

2.7 galE基因缺失对青枯菌生理生化特性的影响

如表4 所示，SPRS911、ΔgalE和CΔgalE菌株都能还原硝酸盐、水解七叶苷和同化葡萄糖，并具有细胞色素氧化酶和纤维素酶活性。ΔgalE在反应48 h后能同化苹果酸，而SPRS911和CΔgalE无此特性。

表4 SPRS911、ΔgalE和CΔgalE菌株的生理生化特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of SPRS911, ΔgalE and CΔgalE strains

3 讨论

碳代谢在青枯菌致病过程中具有重要作用，其中多糖既可作为碳源维持菌体正常的营养生长，又具有致病功能，可造成寄主萎蔫[27]，还能逃避寄主抗病识别和抵御外界逆境[28]。本研究通过对甘薯青枯菌UDP-葡萄糖4-差向异构酶的编码基因galE进行敲除和回补，明确该基因与青枯菌致病性有关，并能影响多个致病相关表型。galE基因敲除菌主要表现为菌落形态改变，流动性减弱，液体培养后期菌体生物量下降，泳动能力、胞外多糖含量和生物膜形成量均下降。

galE基因敲除菌的致病相关表型与胞外多糖生物合成途径的eps基因缺失表型相似。在青枯菌中，与胞外多糖合成相关的结构基因有7 个：epsA、epsP、epsB、epsC、epsD、epsE和epsF[29]。已报道的epsB、epsC、epsD基因缺失突变体均能影响青枯菌的泳动能力、胞外多糖含量和生物膜的形成[24,30-32]。有研究认为胞外多糖含量和细菌的运动能力有关，如假交替单胞菌的胞外多糖可为鞭毛运动提供液体环境[33]。因此，galE敲除菌的致病相关表型很可能是源于对胞外多糖形成的影响。但是epsB、epsC、epsD基因缺失突变体的菌落形态和galE基因敲除突变体的菌落形态有所区别。在含TTC 的培养基上，虽然上述突变体共同表现出流动性下降的特征，但epsB、epsC、epsD基因缺失突变体的显著特征是菌落白边变窄，而galE基因敲除突变体菌落的边缘还能明显观察到有胶状物质覆盖。

青枯菌胞外多糖的主要成分是高分子量酸性多糖，包含3种组分：EPS1、EPS3和EPS4[34]。EPS1占据胞外多糖干质量的90%，主要以N-乙酰半乳糖胺、2-N-乙酰基-2-脱氧-L-半乳糖醛酸和2-N-乙酰基-4-N-（3-羟基丁酰基）-2，4，6-三脱氧-D-葡萄糖三糖重复结构存在[35]。EPS3 的主成分是N-乙酰氨基葡萄糖，结构与脂多糖相同。EPS4的主成分是葡聚糖。其中EPS1 与青枯菌的致病性相关程度最高[36]。EPS的生物合成过程主要是通过糖基转移酶将单糖从核苷酸糖转移、装配到脂类载体上，形成重复单元，随后这些重复单元聚合和输出以形成细胞表面多糖[37]。UDP-Gal是EPS1重要的胞外多糖合成前体，推测galE基因缺失影响胞外多糖合成的主要原因是UDPG到UDP-Gal的转化量减少，从而导致EPS1减少，青枯菌致病性下降；但是UDPG依然可以合成EPS3和EPS4，使菌落表面还有胶状物质覆盖。

碳代谢的多功能性及平衡性是影响青枯菌致病性及其在寄主中存活的关键因素。除了在侵染过程中摄取营养外，菌体还面临着能量分配的问题，既需要同化营养在寄主内部增殖，又需要合成物质和产生能量，生成必需的毒力因子[38]。在本研究中，甘薯青枯菌galE基因缺失影响了其所在的半乳糖代谢途径中其他基因的表达，其中，参与UDPG代谢的基因表达量降低，从而使D-葡萄糖-6-磷酸累积。D-葡萄糖-6-磷酸被认为是在碳代谢供能中大量消耗的物质，是青枯菌中ED 途径和非氧化磷酸戊糖途径（nonoxidative pentose phosphate pathway, non-OxPPP）[2]的关键物质。有研究报道ED途径的激活会抑制生物膜的形成[26]。推测galE基因缺失造成了青枯菌碳代谢方向的改变，使菌体能量从合成多糖增强致病作用（D-葡萄糖-6-磷酸到UDPG到UDP-Gal再到胞外多糖）流向碳源分解利用（ED和non-OxPPP途径）。

此外，在同等条件下，API 检测的甘薯青枯菌galE基因敲除菌株的苹果酸同化作用强于野生型SPRS911 和回补菌株CΔgalE。青枯菌EPS 合成相关的致病基因phcA[39]突变后同样能影响碳源同化作用。PhcA 是病原体多种毒力性状的主要调节因子，phcA基因突变后青枯菌致病性丧失，但其能够比野生型多代谢17 种底物[38]。推测galE基因缺失提高了碳源的代谢利用率，但是其中具体的过程和机制还需要进一步通过实验来阐释。

4 结论

本研究发现UDP-葡萄糖4-差向异构酶编码基因galE对甘薯青枯菌的致病性和碳代谢具有重要作用。galE基因缺失会造成甘薯青枯菌致病性下降，并抑制胞外多糖与生物膜形成，促进D-葡萄糖-6-磷酸累积，同时增强了甘薯青枯菌对碳源苹果酸的同化作用。本研究结果促进了对青枯菌致病相关机制与碳代谢的了解，为相关无毒菌株及靶标农药的开发提供了理论依据。