连翘绿茶不同加工阶段提取物的抑菌及抗氧化活性分析

马海会，邢嘉倩，吴永娜，牛颜冰，王德富

（山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801）

连翘（Forsythia suspense（Thunb.） Vahl）为木犀科（Oleaceae）连翘属（Forsythia）植物，在我国山西、陕西、河南、河北等地广泛分布[1]，在韩国、日本和一些欧洲国家也有零星分布[2]。连翘果实在我国的开发利用较为广泛，对风热感冒、高热烦渴、炎症等有很好的治疗效果。研究表明，连翘果实的主要生物活性成分有苯乙醇苷类、黄酮类和木脂素类等[3-5]，具有抗病毒、抗炎、抗癌、保肝、利尿等功能[6-7]。新型冠状病毒肺炎严重威胁人类的生命健康，连翘作为双黄连口服液和莲花清瘟颗粒的主要活性成分，在预防治疗新冠肺炎中发挥了重要作用[8-9]。

连翘叶是植物连翘的叶片，具有清热解毒、消痈散结的功效[10]，连翘叶具有和连翘果实相同的功能成分，并且一些活性成分甚至高于连翘果实，如连翘苷、连翘酯苷A、芦丁等[11]，具有抗菌、抗炎、抗衰老等药理作用[12-15]。2017 年国家正式批准连翘叶列入食品范畴，这对连翘叶资源在食品领域的综合开发和利用具有重大意义。WANG 等[16]对绿茶加工过程中非挥发性和挥发性代谢物质的动态变化进行了分析，结果表明，代谢物在杀青过程中发生了显著变化；原江锋等[17]对连翘绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖的化学成分进行了比较分析，结果表明，连翘绿茶的茶多酚、氨基酸、总黄酮、总木脂素和总三萜酸含量均较高；李曦等[18]对连翘绿茶和连翘红茶的营养成分进行了比较分析，结果表明，连翘绿茶的水浸出物、维生素C、总多酚、黄酮、连翘酯苷A、连翘苷和芦丁含量均显著高于连翘红茶；WANG 等[19]对连翘叶茶的化学成分及毒理进行了分析，发现连翘叶茶具有无毒性或低毒性。而截至目前，对连翘绿茶不同加工过程提取物的抑菌及抗氧化活性的研究鲜有报道。

本试验以连翘叶不同加工过程所得产物的提取物为研究对象，以常见7 种食源性细菌为供试菌株进行抑菌试验，并以不同样品提取物对DPPH、ABTS+自由基的清除率及铁离子还原（Ferric reducing ability of plasma，FRAP）能力来判断其抗氧化活性，进而明确连翘绿茶的抑菌和抗氧化能力，为连翘绿茶加工工艺的进一步优化提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试连翘叶采集于山西省泽州县川底乡山西泽翘科技股份有限公司连翘茶标准示范基地（东经112°44′54″，北纬35°30′51″）。

供试菌株：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）（CICC：10389）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）（CICC：21261）、肠沙门氏菌肠亚种（Salmonella entericasubsp.enterica）（CICC：21513）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）（CICC：21534）、阪崎氏年轻泰坦杆菌（Cronobacter sakazakii）（CICC：21544）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CICC：21600）和痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）（CICC：23829）均购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

试验药剂：DPPH、ABTS 和2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪（TPTZ）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品提取物的制备 连翘绿茶加工制备主要包括鲜叶摊放、杀青、捻揉及干燥4 个部分。首先将新鲜连翘叶均匀摊放12 h，厚度为2～3 cm，空气湿度为55%，使用水分测定仪测定水分含量，含水量达到70%左右时停止摊放；然后将其放入杀青锅中，200 ℃快速翻炒4 min，连翘叶变软，颜色由鲜绿色变成暗绿色，得到杀青叶；把杀青叶放入捻揉机遵循“轻—重—轻”原则进行捻揉，杀青叶变成卷条状，得到捻揉叶；最后将捻揉叶置于110 ℃环境下干燥，直至茶叶含水量降至10%左右停止，得到干燥茶叶。

将连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶及干燥茶叶置于恒温箱50 ℃烘干，后用粉碎机粉碎。准确称取植物样品25 g，以70%乙醇溶液为溶剂按照1∶20（m/V）比例混合倒入500 mL 烧杯中，超声提取3 h，真空泵结合布氏漏斗抽滤收集滤液，将滤液倒入旋蒸瓶中，在旋转蒸发仪（50 ℃、0.8 MPa）中蒸发得到深棕色膏状物，用无菌蒸馏水将其溶解，配制成质量浓度为1.0 g/mL 的母液，密封置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 抑菌活性测定

1.2.2.1 抑菌圈测定 利用二倍稀释法[20]，对不同连翘样品提取物进行稀释，配制成质量浓度分别为1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g/mL 的样品提取液，阳性对照（CK1）为0.005 g/mL 的氯霉素，水为空白对照（CK2）。用打孔器将滤纸片打成直径为6 mm 的小纸片，高压蒸汽灭菌后烘干，备用。对供试菌株进行活化，使其在600 nm 波长处的吸光度达到0.60±0.02。称取3.5 g牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于100 mL 锥形瓶中，加入100 mL 蒸馏水进行灭菌。待灭菌后的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基冷却至50 ℃左右时，加入1 mL 菌悬液混合均匀，倒入培养皿中，得到含菌培养基。用无菌镊子夹取浸润不同质量浓度的连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶提取物滤纸片轻放于含菌培养基表面，置于37 ℃恒温箱中培养24 h，测量抑菌圈直径。每个处理重复3 次。

1.2.2.2 最小抑菌浓度测定 最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）指药物和一定浓度的菌液相互作用后，能抑制可见菌生长的最低浓度[21]。利用二倍稀释法[20]对不同连翘样品提取物进行倍比稀释，然后加入等体积液体培养基，最后加入活化好的菌悬液100 μL 作为试验组，以仅含菌悬液的液体培养基作为阳性对照组，不含菌悬液的液体培养基作为阴性对照组，放入37 ℃恒温箱中培养24 h 后观察菌体生长情况。每个处理重复3 次。

1.2.2.3 最小杀菌浓度测定 最小杀菌浓度（Minimal bactericidal concentration，MBC）是在MIC 的基础上，吸取100 μL 含连翘提取物的菌悬液涂布于固体培养基上，37 ℃恒温培养24 h，观察可见菌的数量≤5 个，即认为该浓度为MBC。每个处理重复3 次。

1.2.3 抗氧化活性的测定

1.2.3.1 DPPH 自由基清除率 参考XU 等[22]的方法，在96 孔板中依次加入质量浓度为0.4 mg/mL的DPPH 工作液100 μL 和质量浓度为0.312 5、0.625、1.25、2.50、5.00 mg/mL 的样品溶液100 μL，混匀，室温静置30 min，空白组用水代替样品溶液，对照组用水代替DPPH 溶液，于517 nm 波长处测量吸光度，分别记为A样、A空和A对，以维生素C 为阳性对照。每个处理重复3 组，取其平均值。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除率 参考XU 等[22]的方法，将7 mmol/L 的ABTS 储存液和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液等比例混合，置于黑暗中反应12～16 h，后用0.02 mol/L 的醋酸盐缓冲液稀释至734 nm 波长下吸光度为0.700±0.002，制成ABTS工作液，在96 孔板中依次加入200 μL ABTS 工作液和10 μL 质量浓度为0.312 5、0.625、1.25、2.50、5.00 mg/mL 的样品溶液。对照组用水代替样品溶液，30 ℃下反应20 min，室温下测定734 nm 波长处的吸光度，分别记为A0和A1，以维生素C 为阳性对照。每个处理重复3 组，取其平均值。

1.2.3.3 FRAP 法测定总抗氧化能力 参考BENZIE 等[23]的方法，将50 mL 0.3 mol/L 的醋酸盐缓冲液、5 mL 10 mmol/L TPTZ 工作液和5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液混合摇匀，制成FRAP 工作液，避光保存备用。在96 孔板中依次加入20 μL 质量浓度为0.312 5、0.625、1.25、2.50、5.00 mg/mL 的样品溶液与180 μL FRAP 工作液混合作为样品组，加入20 μL 水与180 μL FRAP 工作液混合均匀作为空白对照组，于37 ℃静置10 min 后，在593 nm波长处测定其吸光度，分别记为Am和An。每个处理重复3 组，结果取平均值。

1.3 数据分析

利用Excel 软件对数据进行记录并进行平均值和标准差分析，利用SPSS 21.0 对数据进行方差分析检验数据差异显著性（P＜0.05），利用GraphPad Prism 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同连翘样品提取物的抑菌活性分析

连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶提取物对7 种供试细菌的抑制活性如图1 所示。

由图1 可知，连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶提取物均对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈较为敏感，对大肠埃希氏菌、肠沙门氏菌肠亚种、福氏志贺氏菌、阪崎氏年轻泰坦杆菌和痢疾志贺氏菌则不敏感，这说明连翘绿茶不同加工过程提取物对革兰氏阳性菌的抑制效果强于革兰氏阴性菌。

2.2 不同连翘样品提取物对蜡样芽孢杆菌的抑菌活性分析

通过对抑菌圈直径进行测量分析不同提取物的抑菌效果，结果如表1 所示，连翘鲜叶、杀青叶和干燥茶叶提取物对蜡样芽孢杆菌的抑菌效果随着质量浓度的升高而不断增强。干燥茶叶的抑菌效果最明显，当质量浓度为0.031 25 g/mL 时已表现出抑菌效果；当质量浓度升高到0.125 g/mL 时，干燥茶叶的抑菌圈直径为8.3 mm，除干燥茶叶外，鲜叶和杀青叶提取物也表现出抑菌效果，抑菌圈直径分别为7.3、6.9 mm，但干燥茶叶提取物的抑菌效果明显高于鲜叶和杀青叶提取物（P＜0.05）；当提取物质量浓度升到1.0 g/mL 时，连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶提取物的抑菌圈直径分别为11.1、10.5、9.0、11.2 mm，鲜叶和干燥茶叶提取物的抑菌效果明显较高（P＜0.05）。

2.3 不同连翘样品提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性分析

由表2 可知，连翘鲜叶和干燥茶叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径随着质量浓度的升高而不断变大。干燥茶叶的抑菌效果最强，当质量浓度为0.031 25 g/mL 时就表现出抑制效果，抑菌圈直径为6.9 mm；当质量浓度升到0.25 g/mL 时，鲜叶提取物也表现出抑制效果，抑菌圈直径为8.6 mm，干燥茶叶的抑菌圈直径为8.7 mm，二者的抑制效果无明显差异；当质量浓度增加到1.0 g/mL 时，鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶均表现出抑菌效果，抑菌圈直径分别为10.3、9.3、9.4、11.3 mm，干燥茶叶的抑菌效果最强（P＜0.05）。

表2 不同样品提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径比较Tab.2 Comparison of bacterial inhibition zone diameter of different sample extracts against Staphylococcus aureus

表3 不同样品提取物对不同细菌抑制活性的方差分析Tab.3 Analysis of variance of inhibitory activity of different sample extracts against different bacteria

连翘绿茶不同加工过程提取物在质量浓度为1.0 g/mL 时，对供试细菌抑制活性的方差分析如表3 所示，不同样品提取物对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性具有明显差异（P＜0.05）。

2.4 不同连翘样品提取物MIC 和MBC 的确定

在不同连翘样品提取物对7 种供试细菌抑菌活性分析的基础上，测定提取物对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC 和MBC，结果如表4 所示。

表4 不同样品提取物的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度结果Tab.4 Results of MIC and MBC of different sample extracts

从表4 可以看出，连翘鲜叶和干燥茶叶提取物对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC 最小，均为125 mg/mL；鲜叶和干燥茶叶提取物对蜡样芽孢杆菌杀菌效果一致，MBC 均为250 mg/mL，鲜叶和干燥茶叶提取物对金黄色葡萄球菌杀菌效果也一致，MBC 均为500 mg/mL，而杀青叶和捻揉叶提取物在500 mg/mL 的质量浓度范围内对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌都不具有杀菌作用。

2.5 不同连翘样品提取物对DPPH 自由基清除能力的影响

以维生素C 为阳性对照，不同连翘样品提取物对DPPH 自由基的清除率结果如图2 所示，在0.312 5 ～5.0 mg/mL 的质量浓度范围内，连翘样品提取物对DPPH 自由基都有不同程度的清除效果，并且高质量浓度的清除效果要大于低质量浓度。当质量浓度为2.5 mg/mL 时，连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶对DPPH 自由基的清除能力分别为97.3%、98.2%、97.7%和94.8%，清除率从大到小排序为：杀青叶＞捻揉叶＞鲜叶＞干燥茶叶，鲜叶、杀青叶和捻揉叶的DPPH 自由基清除率甚至高于维生素C。

图2 不同样品提取物对DPPH 自由基清除率的影响Fig.2 Effects of different sample extracts on DPPH free radical scavenging rate

2.6 不同连翘样品提取物对ABTS+自由基清除率的测定

不同连翘样品提取物对ABTS+自由基清除率的测定结果如图3 所示，随着质量浓度的上升，连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶对ABTS+自由基的清除能力也逐渐增大。当质量浓度为0.312 5 ～2.5 mg/mL 时，提取物的清除率呈对数增长；当质量浓度达到2.5 mg/mL 后，清除率增长变得缓慢；当提取物质量浓度达到5.0 mg/mL时，连翘样品提取物的清除率与维生素C 相当。当质量浓度为2.5 mg/mL时，连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶提取物对ABTS+自由基的清除率分别为81.1%、90.3%、87.8%和85.1%，清除率大小为：杀青叶＞捻揉叶＞干燥茶叶＞鲜叶，杀青叶对ABTS+自由基的清除活性最强。

图3 不同样品提取物对ABTS+自由基清除率的影响Fig.3 Effects of different sample extracts on ABTS+free radical scavenging rate

2.7 不同连翘样品提取物总抗氧化能力分析

从图4 可以看出，在本试验的质量浓度范围内，连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶的总抗氧化能力随质量浓度的升高而不断增强，且在不同质量浓度下，4 种样品提取物的总抗氧化能力不同。当提取物的质量浓度为0.312 5～2.5 mg/mL 时，样品提取物的总抗氧化能力呈明显的量效关系；当质量浓度达到2.5 mg/mL 后，总抗氧化能力的增长缓慢；当质量浓度达到5.0 mg/mL 时，总抗氧化能力基本一致。当质量浓度为2.5 mg/mL 时，连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶提取物的总抗氧化能力分别为91.3%、92.5%、92.2%和91.3%，总抗氧化能力大小为：杀青叶＞捻揉叶＞干燥茶叶=鲜叶，杀青叶的总抗氧化能力最高。

图4 不同样品提取物总抗氧化能力比较Fig.4 Compasion of total antioxidant capacity of different sample extracts

连翘样品不同加工过程提取物在质量浓度为2.5 mg/mL 时，抗氧化活性的方差分析如表5 所示，连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶的DPPH、ABTS+自由基清除率和总抗氧化能力具有明显差异（P＜0.05）。

表5 不同样品提取物抗氧化活性的方差分析Tab.5 Analysis of variance of antioxidant activity of different sample extracts

3 结论与讨论

连翘作为山西道地中药材，以其干燥果实入药。据《中华本草》记载，“连翘茎叶，性寒，主治心肺积热”[24]，在我国山西、陕西、河北等地，人们常把连翘叶晒干自制成连翘茶饮用。2020 年3 月，为贯彻落实《国务院关于促进乡村产业振兴的指导意见》，加快山西省农村振兴进程，山西省政府提出饮料水果产业以中药材和水果为主要资源优势，重点布局和打造药茶和果汁，大力发展连翘茶、沙棘叶茶等药茶[25]。连翘茶叶因其风味醇厚，香味纯正，成为广受大众欢迎的纯天然茶饮料。

食源性致病菌指可以引起食物腐败变质，并导致食源性疾病的一类微生物[26]。在各种食品安全事故中，由食源性致病菌导致中毒的比例占比最高，其中细菌引起的疾病占比2/3[26]。ZHOU 等[27]研究发现，连翘叶提取物可抑制大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的活性。李欧等[28]研究表明，连翘叶提取物对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抑制作用。本研究通过对连翘绿茶不同加工过程提取物进行抑菌分析，发现连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥叶对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有明显抑制作用，而对大肠埃希氏菌、肠沙门氏菌肠亚种、福氏志贺氏菌、阪崎氏年轻泰坦杆菌和痢疾志贺氏菌无明显抑制效果，说明连翘绿茶不同加工过程提取物对革兰氏阳性菌的抑制作用较好，与ZHOU 等[27]、李欧等[28]的研究结果略有不同，其原因可能是提取方法不同、生长环境不同等因素所造成。此外，当不同样品提取物的质量浓度为1.0 g/mL 时，鲜叶和干燥茶叶对蜡样芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为11.1、11.2 mm，抑菌圈直径显著高于杀青叶和捻揉叶（P＜0.05）；干燥茶叶对金黄色葡萄球菌的抑制效果最强，抑菌圈直径为11.3 mm。鲜叶和干燥茶叶提取物对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC 均为125 mg/mL；鲜叶和干燥茶叶提取物对蜡样芽孢杆菌的MBC 均为250 mg/mL，鲜叶和干燥茶叶提取物对金黄色葡萄球菌的MBC均为500 mg/mL。本试验研究对象均为连翘叶粗提物，关于不同连翘样品提取物是通过何种活性成分进行抑菌还需要进一步研究。

很多研究表明，连翘叶具有较强的抗氧化能力。原江锋等[17]研究表明，连翘叶绿茶具有较强的DPPH 自由基清除能力，且高于信阳毛尖和桑叶茶。李欧等[28]研究发现，连翘叶提取物对DPPH·、OH·和ABTS+·清除能力一致，均具有较好的抗氧化活性。本试验利用连翘鲜叶、杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶提取物对DPPH、ABTS+自由基清除率及总抗氧化能力进行测定，发现不同加工过程提取物的抗氧化活性随着质量浓度的增大而升高，当样品提取物的质量浓度为2.5 mg/mL 时，杀青叶对DPPH、ABTS+自由基清除率及总抗氧化能力最高，分别为98.2%、90.3%和92.5%。另外据报道，连翘叶中的连翘苷类物质和绿茶中的酚类物质都具有抗氧化活性[29-30]，而连翘叶在加工成绿茶的过程中，经过高温处理后的杀青叶、捻揉叶和干燥茶叶提取物的抗氧化活性有所降低，推测干燥过程中高温对连翘叶绿茶中的抗氧化活性成分造成了部分降解或转化为不具有抗氧化能力或抗氧化活性较低的化合物，具体是哪类物质发生了转变还需要通过代谢组学进行分析。

综上，连翘绿茶不同加工过程提取物对革兰氏阳性菌具有明显抑菌效果，其中干燥茶叶和鲜叶的抑菌效果最强，杀青叶的抗氧化活性最高。研究结果可为连翘绿茶加工工艺优化及其进一步开发利用提供理论依据。