H9N2 亚型禽流感病毒感染鸡红细胞引起白细胞介素的免疫应答

刘智民 ，任鹏飞 ，韩心语 ，乔梦丽 ，牛 胜 ，王 颖 ，任建乐 ，赵宇军 ，张 鼎 ，范瑞文 ，毕玉海 ，2，田文霞

（1.山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷 030801；2.中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室/中国科学院 流感监测与预警中心，北京 100101）

H9N2 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）可引起鸡的免疫抑制性疾病，给家禽业带来巨大的经济损失。AIV 是20 世纪90 年代初首次在我国鸡群中发现和分离的一种病毒，在发现后的几十年中逐渐发展成大部分地区家禽养殖的地方病[1]。H9N2 AIV 属于低致病性禽流感病毒，但因其变异能力强、流行范围广而成为最难防控的禽流感亚型之一。目前，虽然疫苗防控研究已取得一定进展，但没有从根本上阻断其流行和传播。

红细胞不仅能够运输氧气，还参与机体的免疫调节反应。1981 年，“红细胞免疫系统”的概念首次由SIEGEL 等[2]提出，他们的研究鉴定了红细胞的多种免疫功能，并发现红细胞是通过免疫黏附作用发挥其免疫功能。人红细胞是红细胞免疫领域研究的重点，动物中有关核红细胞免疫功能方面的研究侧重于鱼类和爬行类，但关于鸡红细胞参与机体免疫反应的研究较少。模式识别受体的识别是机体抵抗病原感染的第一步，也是机体诱导天然免疫反应的关键一步。Toll 样受体（TLRs）是发挥模式识别功能最重要的受体之一，当外界病原入侵机体，TLRs 能立刻识别病原相关配体，激活下游相应细胞因子，启动天然免疫应答反应[3]。白细胞介素（Interleukin，IL）是一种细胞因子，现已发现39 种[4]，它们在免疫细胞的成熟、活化、调节中发挥重要作用，可参与炎症反应和免疫反应。最新研究发现，这些ILs 的mRNA 表达量随着病毒入侵机体而发生变化。JAHEJO 等[5]研究发现，IL-7在感染马立克氏病毒（Marek’s disease virus，MDV）的鸡红细胞中的表达量与对照组相比显著上升，而IL-12和IL-13的表达量显著降低。董建国等[6]研究发现，PK15（猪肾细胞）感染A型塞内卡病毒（SVA）后，IL-6表达水平显著上升。BOULASSEL 等[7]和胡宽修等[8]研究均发现，感染HIV-1 的患者体内IL-15和IL-16的表达量明显上升。鸡感染禽白血病病毒（ALV-J）后，单核细胞中IL-18mRNA 的表达水平升高[9]。感染流感A 病毒（Influenza a virus，IAV）后期，患者血清和外周血单核细胞（PBMC）中IL-34表达量升高[10]。因此，鉴定H9N2 感染鸡后红细胞中ILs 表达水平的变化有助于更深入研究H9N2 的致病和免疫机理。

目前，关于H9N2 感染鸡红细胞后ILs 的表达水平变化仍未见报道。本研究通过实时荧光定量PCR 鉴定H9N2 感染鸡红细胞后不同白细胞介素（IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-34）的表达水平，旨在为研究鸡红细胞在感染H9N2 后ILs 相关基因参与免疫调节功能以及防治H9N2 提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 毒株 禽流感病毒H9N2 亚型山西毒株A/chicken/Shanxi/1.23 TGRL003-O/2019 由山西农业大学生物制品实验室保存；SPF 鸡胚购自山东济南赛福实验动物养殖有限公司；SPF 鸡和H9N2 免疫鸡血清购自山西太谷隆科尔公司。

1.1.2 试剂 RNAiso plus 2000、荧光定量PCR 试剂盒(AK6003）、反转录试剂盒（AK3020）、淋巴细胞分离液均购自大连Takara 宝生物工程公司。DMEM 培养基购自美国HyClone 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 H9N2 体外感染鸡红细胞 翅静脉采集SPF 鸡新鲜血液，参考NIU 等[11]的方法分离红细胞（大约5.0×109个）用于后续试验。试验组根据红细胞与H9N2 共孵育的时间分为4 组：0 h 组、2 h组、6 h 组和10 h 组，每组4 个重复。每个离心管中先加入50 μL 红细胞，然后加入100 μL 的H9N2 AIV 尿囊液（病毒滴度7×㏒2）和900 μL 的细胞维持液DMEM。在对照组的4 个离心管中直接加入50 μL 红细胞和1 000 μL 的细胞维持液DMEM。将4 组红细胞与H9N2 混合后在37 ℃培养箱分别孵育0、2、6、10 h 后，2 000 r/min 离心20 min，重新分离红细胞，然后用PBS 洗涤3 次，用于后续试验。1.2.2 H9N2感染雏鸡 选择1日龄SPF雏鸡48羽，随机分为攻毒组和对照组（每组各24 羽）。预饲期7 d，预饲期结束后，试验组滴鼻接种H9N2 亚型禽流感尿囊液（病毒滴度7×㏒2）0.2 mL/只，对照组滴鼻接种相同体积的PBS 缓冲液。攻毒后第3、7、14 天从2 组中各随机选取5 只进行心脏采血（2 mL/只），抗凝处理后用于后续试验。

1.2.3 红细胞的分离 心脏采集4 mL 新鲜血液保存于抗凝管中，采用淋巴细胞分离液分离红细胞。按淋巴细胞分离液∶血液∶无菌PBS 比例为2∶1∶1使用，首先将抗凝血与等体积无菌PBS 混匀，随后缓慢倾斜加入到等体积的淋巴细胞分离液中，避免发生混合，2 000 r/min 离心20 min，弃去最上层的血清和中间层的淋巴细胞，分离得到红细胞，再用无菌PBS 洗涤红细胞，2 000 r/min 离心12 min，重复3 次。

1.2.4 RNA 提取与cDNA 合成 按照1.2.3 方法从血液样品中分离得到红细胞，收集25 μL 红细胞，采用Trizol 法提取总RNA。总RNA 的浓度和纯度通过1.5%琼脂凝胶电泳和核酸测定仪检测。评估核糖核酸质量的标准是凝胶中可以看到28 S和18 S 条带且RNA 的A260/A280值为1.9～2.1。根据反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）的操作步骤，将总RNA 反转录为cDNA，保存至-20 ℃，用于后续的荧光定量PCR 检测cDNA。

1.2.5 荧光定量PCR 根据NCBI 数据库中8 种白细胞介素的CDS 序列信息，使用Primer 5.0 软件设计引物，引物序列如表1 所示。荧光定量PCR 采用10.0 μL 反应体系，其中SYBR®Premix Ex Taq™II（2×）5.0 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.1 μL，上下游引物各0.25 μL（100 μmol/L），cDNA 模板1.0 μL，ddH2O 3.4 μL。反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，共42 个循环，每个样品设置4 个重复。

表1 定量PCR 引物信息Tab.1 Primers of real-time qPCR

1.3 数据分析

以18S rRNA 作为标准内参基因，使用2-ΔΔct方法计算目的基因在不同时间段试验组的表达差异。使用GraphPad Prism 5.0 进行上述基因表达量数据的统计分析，结果以平均值±标准误表示，P＜0.05代表具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 体外感染H9N2 AIV 后鸡红细胞中ILs 相关基因的mRNA 表达变化

荧光定量PCR 结果如图1 所示，H9N2 体外感染鸡红细胞后，与对照组相比，IL-6的表达水平在感染后期（6、10 h）显著上升（P＜0.05）；IL-7在0、6 h 显著上升（P＜0.05），在2 h 显著下降（P＜0.05）；IL-12的表达量在0、6 h 都显著升高（P＜0.05），0 h 的表达量高于6 h；IL-13的表达水平在感染病毒后0、6 h 显著下降（P＜0.05）；IL-15在感染早期（0 h）显著上调（P＜0.05），而在感染的中间点（2、6 h）显著下调（P＜0.05）；IL-16仅在感染后2 h 显著下调（P＜0.05），在其余感染时间点无显著变化；IL-18在感染第2、6 h 显著上调（P＜0.05），并且在6 h 上调程度更高；IL-34在感染后的0、2、6、10 h 表达水平有轻微的波动，变化规律不明显。

图1 体外H9N2 AIV 感染鸡红细胞后各IL 相关基因mRNA 表达变化Fig.1 mRNA expression change of the IL-related genes in chicken erythrocytes infected by H9N2 AIV in vitro

2.2 体内攻毒后鸡红细胞中IL 相关基因的mRNA表达变化

荧光定量PCR 结果如图2 所示，体内感染H9N2 AIV 后，与对照组相比，IL-6的表达水平在攻毒3 d 显著下降（P＜0.05），在体内攻毒7 d 显著上升（P＜0.05）；IL-7在攻毒后的3、7、14 d 都显著上升（P＜0.05），并在14 d 时达最高；IL-12、IL-13、IL-15、IL-16的表达量在攻毒后的7、14 d 显著升高（P＜0.05），并且在攻毒14 d 的表达量高于7 d 表达量；IL-18的表达水平在体内攻毒3 d 没有显著变化，7 d 时显著上升（P＜0.05），而在14 d 时显著下降（P＜0.05）；IL-34在体内攻毒3 d 时显著下降（P＜0.05），7、14 d 显著上升（P＜0.05）。

图2 体内攻毒后鸡红细胞中各IL 相关基因mRNA 表达变化Fig.2 The mRNA expression change of the IL-related genes in chicken erythrocytes infected by H9N2 AIV in vivo

3 结论与讨论

近年来，鸡红细胞的免疫调节功能受到越来越多的关注。TLR 已被确定为脊椎动物先天免疫识别的关键受体之一[12-13]，近期研究发现，鸡红细胞可表达多种TLRs[14]。IL 可以通过TLR 与其配体的相互作用来诱导ILs 的表达，如IL-1β、IL-6和IL-8[15]。本研究结果显示，鸡红细胞中8 个免疫相关基因IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18和IL-34均表达，这些基因可能通过表达水平的变化参与红细胞的免疫调节作用。

IL-6是一种多种功能细胞因子，既是一种促炎细胞因子，又是一种抗炎的肌氨酸，在鸡的免疫反应中起着重要的调节作用[16]。IL-6被证明具有很强的生物佐剂活性，可增强机体免疫功能[17]。本研究结果显示，IL-6的mRNA 表达水平在体内攻毒后3 d 显著下降，可能是由于病毒增殖速度快，在体内拷贝数较高，抑制了IL-6的表达，导致其在3 d表达量降低。IL-6的mRNA 表达水平在感染后期（体外孵育后6、10 h 和攻毒后的7 d）表达量显著上调。有报道称，IL-6能够有效改善感染流感病毒引起的肺损伤[18]，据此推测IL-6的mRNA 表达水平在感染后期升高，一方面改善了病毒感染对机体的损伤；另一方面增强了机体的免疫功能，对机体免疫稳态维持起调节作用。

IL-7主要由淋巴组织、胸腺和骨髓的基质细胞产生，不仅在T 细胞分化中起作用，也在B 细胞的分化、增殖、成熟和维持过程中发挥重要作用[19-20]。IL-7是一种促炎细胞因子，其在细胞内的表达和活化可刺激炎性细胞产生大量致炎因子，致炎因子可调控炎症过程各组分之间的相互作用，维持机体免疫平衡。有研究表明，IL-7重组蛋白具有较强的免疫增强活性[21]。本研究结果显示，IL-7的表达水平在体外感染H9N2 AIV 后0、6 h 以及体内攻毒后的3、7 d 显著上升，这与HIV 感染者体内IL-7水平升高结果一致[22]，推测红细胞在该时间段可能通过上调IL-7的表达量来提高B 细胞和T 细胞免疫功能，控制由病毒感染引起的炎症过程，但其具体的免疫机制还有待进一步证实。

IL-12是由Th1 细胞及树突细胞分泌的一种促炎性细胞因子，可以调节辅助T 细胞的分化，诱导NK 细胞和Th1 细胞分泌γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）。IFN-γ 属于II 型干扰素，在免疫调节和抗病毒方面发挥重要作用。鸡IL-12的结构和功能与哺乳动物IL-12相似[23]，并且重组IL-12可作为生物佐剂在鸡脾细胞中诱导高水平的IFN-γ表达。本研究结果显示，随着感染的时间增加，病毒的载量和活性逐渐降低，IL-12的表达量也随之降低，这与李洁萍等[24]的试验结果一致，其结果显示，慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染患者血清蛋白IL-12水平和HBV DNA 载量呈现正相关。但值得注意的是，体内IL-12的mRNA 表达量的变化趋势与体外表达量变化趋势相反，说明体内外免疫机制不同，具体机制还有待进一步证实。

IL-13是一种抗炎细胞因子，属于B 细胞因子家族，主要在机体体液免疫反应中发挥作用，可通过参与机体免疫反应、造血和刺激急性期反应促进宿主防御机制[25]，并可显著降低细胞毒性单核细胞功能和抑制单核细胞分泌促炎性递质进而控制炎症反应。李杰等[26]研究健脾益气方对人类免疫缺陷患者（Human immunodeficiency virus，HIV）体内病毒载量与IL-13相关性时，发现IL-13水平在治疗前后存在明显差异，治疗后体内病毒载量降低且IL-13水平显著升高。有文献报道，IL-13表达量的升高影响了病毒DNA 合成，显著降低HIV 病毒的感染性，对病毒活性有抑制作用[27]。本试验结果显示，随着攻毒时间的推移，IL-13的表达水平在检测的3 个时间点（3、7、14 d）逐渐上升，与前2 个研究结果完全一致。

IL-15在NK 细胞发育、成熟、增殖、活化以及向炎症部位的迁移具有调节能力，对NK 细胞免疫应答有重要作用，因此，能够响应感染并抑制病毒复制。哺乳动物体内的IL-15 在B 细胞的增殖和分化、CD4+T 细胞的发育、自然杀伤细胞的增殖中都具有重要作用，在炎症反应中IL-15通过多种途径发挥促炎症作用。LIM 等[28]研究表明，鸡IL-15在增强体液免疫应答过程中发挥作用。BOULASSEL等[7]研究发现，感染HIV-1 患者血液中的IL-15的水平高于健康者，但在抗病毒治疗后IL-15的水平又恢复了正常。此外，一些研究者还发现，感染人类免疫缺陷病毒1 亚型（Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）的患者患血液病毒症的概率与IL-15的水平密切相关，尤其是IL-15表达水平升高或者不稳定的患者[29]。IL-15的mRNA 表达量在感染后0 h 显著升高，之后表达量下降，这与前面2 个的研究结果一致，说明IL-15在抵抗禽流感H9N2 早期感染中发挥重要作用，IL-15也可以作为体外早期感染禽流感H9N2 AIV 的一个特征因子。体内IL-15的表达量在攻毒后的7、14 d 显著升高，沈桂堂等[30]研究发现，重型肝炎患者的IL-15水平在一定程度上反映了肝脏炎症严重程度，据此推测感染禽流感H9N2 AIV 后引发了机体的炎症反应，但仍需进一步证实。

IL-16作为一种免疫调节细胞因子，主要发挥促炎症的作用。有研究表明，IL-16在CD4+Th1 细胞的募集和激活中起重要作用，它通过刺激炎性细胞因子的分泌和促进T 淋巴细胞的活化参与炎症性疾病[31]。IL-16能够促进CD4+淋巴细胞、单核巨噬细胞及嗜酸性粒细胞的应答反应。IL-16促进这些免疫细胞产生应答的主要原因是它们都能表达CD4。CD4 是IL-16的主要受体，二者结合后，可以产生一系列免疫反应，比如通过抑制HIV-1 的启动子抑制病毒复制。一些研究结果显示，白细胞介素IL-16的表达量在攻毒后逐渐上升，这与丙型肝炎病毒（Hepatitis virus C，HCV）患者经抗病毒治疗后IL-16表达上调相似。说明在感染初始阶段，IL-16的表达量较低，免疫功能被抑制，但是随着攻毒时间的延长，机体自身的免疫力提高，病毒载量也相应降低，以致IL-16的表达量升高。胡宽修[8]研究也发现，在感染HIV-1 的患者中，治疗组的患者IL-16的表达水平高于对照组患者，且差异具有显著性。

IL-18在CD4+和CD8+T 细胞反应的发展和自然杀伤细胞的诱导中发挥重要功能，同样具有促炎症作用。IL-18在机体的先天免疫和获得性免疫方面都起到重要作用[32]。袁朋等[33]在昆虫细胞中利用杆状病毒表达载体表达了鸡白介素18（cIL-18），研究发现，cIL-18蛋白可在MDCK 细胞中抑制H9N2 AIV 的复制。本研究结果显示，IL-18的表达量在感染后2、6 h 和攻毒后7 d 都显著上调，说明IL-18可能起到了免疫作用，抑制了H9N2 AIV的复制，维持了机体的免疫平衡。在研究IL-18与乙肝病毒形肝炎（Hepatitis B virus，HBV）感染的相关性时，有研究发现，HBV 与IL-18表达密切相关[34]，其可作为HBV 诊断和疗效检测的新指标，提示IL-18也可以作为感染H9N2 AIV 的一个指标。

IL-34的功能尚不完全清楚。在哺乳动物中，IL-34的功能包括促进趋化因子以及炎症细胞等的生成和释放、刺激巨噬细胞和单核细胞的增殖与分化，从而发挥促炎作用。IL-34与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF 或CSF-1）共用一个受体CSF-1R，当配体与受体结合后可调节单核细胞和巨噬细胞的生物学功能，所以，研究集中于IL-34在一些炎症性疾病中的作用。慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染患者肝脏纤维化阶段血清中IL-34的表达量明显升高，此外，HCV 感染和炎症因子可促进体外培养的肝脏细胞表达IL-34。本研究结果显示，IL-34的表达量在体外感染H9N2 AIV 的0、2、6、10 h没有发生差异变化，一定程度上说明IL-34在体外发挥的作用较小。攻毒后IL-34的表达量在7 d 和14 d 显著上升，推测机体感染H9N2 亚型禽流感病毒后引发了强烈的炎症反应，导致机体产生了大量的炎性因子。YU 等[35]也报道了同样的结果，发现在感染流感A 病毒（IAV）后期，患者血清和外周血单核细胞中（PBMC）中IL-34表达量升高。IL-34的表达量在攻毒的7 d 较14 d 相对表达量更高，可能是由于随着感染时间的增加，机体自身的免疫力增强，而鸟类本身可能在感染后期获得一些针对特定病原体或感染的免疫力，导致14 d 的攻毒水平和炎症因子水平较7 d 低。

本研究结果显示，无论是鸡红细胞在培养条件下感染H9N2 AIV，还是易感雏鸡体内攻毒H9N2 AIV，鸡红细胞中IL-6、IL-7、IL-12、IL13、IL-15、IL-16、IL-18和IL-34共8 种白细胞介素呈现了转录水平上的变化。表明鸡感染H9N2 亚型禽流感病毒后红细胞可能发生了相应的免疫应答反应，起到抵抗病毒感染、调节机体免疫稳定的作用。