贺兰山东麓‘马瑟兰’葡萄果实花色苷和原花色素特性分析

赵益梅,刘伟强,崔 萍,张晓煜,夏永秀,刘 旭*

(1 西北农林科技大学 葡萄酒学院,陕西杨凌 712100;2 茅台学院酿酒工程系,贵州仁怀 564507;3 宁夏贺兰山东麓葡萄酒产业园区管理委员会,银川 750004;4 宁夏气象科学研究所,银川 750002;5 中国林业科学研究院 华北林业实验中心,北京 102300)

宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区位于北纬37°43′-39°23′,东经105°45′-106°47′,光热充足、干旱少雨、昼夜温差大,是国际公认的酿酒葡萄种植“黄金地带”,也是中国最佳的酿酒葡萄种植区之一[1]。该产区地理分布广、种植面积大,不同子产区间的气候条件、土壤特性和栽培技术等均存在一定的差异,葡萄原料质量和葡萄酒品质表现出相应的区域差异性。

花色苷、原花色素(又称缩合单宁)等酚类物质是酿酒葡萄果实重要的次级代谢产物,广泛存在于果皮和种子中,是赋予葡萄果皮与葡萄酒颜色、口感及风味的重要成分。研究表明,酿酒葡萄果实品质尤其是酚类物质特性与产地密切相关,并受葡萄园的地理位置、气候、土壤、地形、太阳辐射和葡萄园管理水平等多种因素影响[2]。例如,‘玫瑰香’、‘梅尔诺’、‘蛇龙珠’、‘赤霞珠’等酿酒葡萄品种的果实品质分析结果表明,不同产地间葡萄果实酚类物质的特性均存在明显差异[3-5]。

酿酒葡萄‘马瑟兰’(Marselan)是由‘赤霞珠’和‘歌海娜’杂交选育而成的中晚熟品种,具有抗旱性强、耐瘠薄、果实品质优良等特点。该品种于2003年引入宁夏贺兰山东麓产区,表现出良好的生物学特性和酿酒潜力[6]。近年来种植面积不断扩大,有望成为未来重要的主栽品种。‘马瑟兰’葡萄和葡萄酒品质与气候、土壤和栽培管理密切相关[7]。研究表明,遮光处理减少了果实中来自于脂肪酸、氨基酸和异戊二烯代谢途径合成的挥发性有机化合物的种类和含量[8];不同产区间‘马瑟兰’葡萄与葡萄酒的基本理化指标和感官品质差异较大[9,10];秦皇岛5个小产区‘马瑟兰’果实的粒重、糖、酸、总酚和总花色苷含量均存在明显差异,且不同小产区果皮花色苷单体物质和非花色苷酚类物质的种类也不同[10]。Lan等[9]基于挥发性香气化合物,采用偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)对胶东半岛、渤海湾、怀涿盆地、黄土高原和新疆等5个产区年轻‘马瑟兰’葡萄酒的地理来源进行了区分,但是酚类化合物不能用于产地区分。

目前,针对贺兰山东麓产区‘马瑟兰’葡萄果实品质尤其是花色苷和原花色素等酚类物质特性的相关研究鲜见报道。因此,为了明确贺兰山东麓产区‘马瑟兰’葡萄果实的花色苷和原花色素特性,探明不同子产区间果实品质的差异性,本试验以贺兰山东麓4个子产区10个代表性酒庄的‘马瑟兰’葡萄为材料,对其果实基本理化特性、花色苷和原花色素的组分与含量等进行测定,通过PLS-DA分析筛选出造成不同酒庄果实品质差异的主要酚类物质指标,并采用主成分分析法(principal component analysis, PCA)对不同酒庄‘马瑟兰’葡萄果实品质进行综合评价,以期为该品种在贺兰山东麓产区的科学推广和种植提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2021年在贺兰山东麓自北往南选择银川、农垦玉泉营、青铜峡和红寺堡4个子产区的10个代表性酒庄(表1),在各酒庄‘马瑟兰’葡萄商业成熟期时采集果实样品。采样时,每个酒庄样地葡萄园随机选择5棵生长健康、长势一致的植株,分别剪下所有果穗,迅速带回实验室后剪下所有健康的浆果,然后按照各指标的测定方法随机选取一定数量的果粒装袋,设置3次生物学重复。所有样品除用于基本理化指标测定外均置于-20 ℃下保存备用。

1.2 指标测定及方法

1.2.1 果实基本理化指标

采用电子天平分别称量20粒浆果的粒重(精度0.01 g),然后用数显游标卡尺分别测定浆果的纵横径。采用CM-5色差仪(HunterLab公司,美国)测定葡萄果实的L*、a*、b*。L*值代表亮度,值越大亮度越大、颜色越白,值越小颜色越黑。a*值为正,代表红色,值越大就越红;a*值为负,代表绿色,值越大就越绿。b*值为正,代表黄色,b*值为负,代表蓝色。使用Biosystems(http://www.biosystems.es)试剂盒对葡萄果实可溶性固形物、还原糖和可滴定酸含量在Y15全自动分析仪(Biosystems, Barcelona,西班牙)进行测定。其他常规理化指标参考《葡萄酒分析检测》[11]进行测定。每个样品重复3次。

1.2.2 果皮花色苷特性

采用高效液相色谱仪(安捷伦1260型,美国)测定果皮花色苷的组分与含量,花色苷测定方法参考Downey[12]的方法并略作修改。

(1)样品提取:随机取80粒葡萄,冷冻状态下迅速将果皮和果肉分离,加液氮研磨成粉状,避光冷冻干燥24 h,-80 ℃贮藏备用。准确称取0.03 g果皮干粉于2 mL离心管中,加入1 mL 50%甲醇水溶液,于功率40 Hz、温度30 ℃下避光超声提取30 min,然后在4 ℃、8 000 r/min下离心10 min,重复提取3次,收集所有上清液于离心管中保存,过0.22 μm滤膜后上机检测。

(2)色谱条件:色谱柱Agilent EC-C18(150 mm×4.6 mm),柱温40 ℃,进样量25 μL,流速1 mL/min,检测波长520 nm。流动相A为10%甲酸水溶液;B为10%甲酸甲醇溶液。洗脱程序:0～14 min,18%～29% B;14～16 min,29%～32% B;16～18 min,32%～37% B;18～18.1 min,37%～30% B;18.1～29 min,30%～37% B;29～30 min,37%～100% B;30～32 min,100% B等梯度;32～33 min,100%～18% B;33～36 min,18% B等梯度。每个样品重复3次。单体花色苷的含量以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷计算。

1.2.3 果实原花色素特性

采用高效液相色谱仪(安捷伦1260型,美国)测定果皮和种子原花色素的亚基组成、含量和平均聚合度(mean degree of polymerization, mDP),提取与测定参考赵益梅[13]的方法。

(1)样品提取:将80粒浆果称重后分别撕下果皮和种子,加入液氮分别研磨成粉状,冷冻干燥24 h,称重。放入150 mL三角瓶中,加入丙酮水溶液震荡提取24 h,过滤,粗提液于38 ℃旋转蒸干,加入10 mL甲醇溶解后用于原花色素特性的测定。取200 μL原花色素提取液加入到等体积的间苯三酚溶液中,50 ℃水浴20 min后终止反应,过0.45 μm滤膜后上机检测。

(2)色谱条件:色谱柱Chromolith RP-18e(100×4.6 mm),柱温30 ℃,流速3 mL/min,进样量20 μL,检测波长280 nm。流动相A为1%乙酸水溶液,B为1%乙酸乙腈溶液。洗脱程序:0～4 min,3% B等梯度;4～14 min,3%～18% B;14～14.01 min,18%～80% B;14.01～16 min,80% B等梯度;16～16.01 min,80%～3% B;16.01～18 min,3% B等梯度。每个样品重复3次。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2019对试验数据进行基本统计分析,采用SPSS 20.0进行单因素方差分析(Duncan,P<0.05)、聚类分析和PCA分析,采用MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)进行PLS-DA分析。

2 结果与分析

2.1 不同酒庄‘马瑟兰’葡萄果实基本理化指标比较

宁夏贺兰山东麓‘马瑟兰’葡萄果实的可溶性固形物、还原糖、可滴定酸和颜色参数等品质指标在10个酒庄间均存在显著差异(表2),10个酒庄的葡萄果实产量也存在一定的差异(表1)。

表2 不同酒庄‘马瑟兰’葡萄果实的基本理化指标

其中,果实粒重以H-Hd酒庄的最大,显著高于除Y-H酒庄外的其他8个酒庄;果实横径以H-Hd酒庄的最大,显著高于Y-Mh、Y-Mq、N-C、Q-M和H-P酒庄;果实纵径以Y-H酒庄的最大,显著高于除Y-Mh、N-X和H-Hd酒庄外的其他6个酒庄。同时,果实的可滴定酸含量也以H-Hd酒庄最高(6.99 g/L),且与除H-Hs酒庄以外的其他酒庄间均差异显著;果实可溶性固形物和还原糖含量均以Q-M酒庄最高,分别为34.10%、315.3 g/L,且与其他酒庄间差异显著,这可能是由于产量较低导致果穗果实间隙较大,从而使其阳光照射充分,促进了糖分的积累。另外,CIELAB颜色分析结果表明,H-Hd酒庄‘马瑟兰’葡萄果实的L*值最低,而a*值为正值中最大,说明其果实颜色最深,颜色最红;H-P酒庄果实的b*值为负值中最高,说明其果实颜色最蓝。

2.2 不同酒庄‘马瑟兰’葡萄果皮花色苷特性比较

由表3可见,10个酒庄‘马瑟兰’葡萄果皮中共检测出19种花色苷单体,包含5种非酰化花色苷、5种乙酰化花色苷、3种咖啡酸酰化花色苷和6种香豆酰化花色苷,其含量范围分别为31.08～80.55 mg/g、8.14～18.72 mg/g、1.68～3.34 mg/g和3.47～9.99 mg/g,分别占果皮花色苷总含量的64.66%～73.76%、14.76%～21.38%、2.84%～4.36%和5.20%～14.86%。可见,非酰化和乙酰化花色苷是贺兰山东麓‘马瑟兰’葡萄果皮花色苷的主要类型。

表3 不同酒庄‘马瑟兰’葡萄果皮花色苷的组成与含量

由表3可知,10个酒庄葡萄果皮中花色苷总含量范围为46.46～111.91 mg/g。其中,H-Hs酒庄果皮花色苷总含量和非酰化花色苷含量均为最高,分别为111.91 mg/g和80.55 mg/g,且显著高于其他酒庄;H-Hs酒庄果皮中乙酰化花色苷含量和咖啡酰化花色苷含量也最高,分别为18.72 mg/g和3.34 mg/g,均与除N-X酒庄外的所有酒庄差异显著;从‘马瑟兰’葡萄果皮花色苷的香豆酰化程度来看,N-X和H-Hs酒庄的香豆酰化花色苷含量最高,分别为9.99 mg/g和9.30 mg/g,且显著高于其他酒庄。

2.3 不同酒庄‘马瑟兰’葡萄果实原花色素特性比较

从表4可知,10个酒庄‘马瑟兰’葡萄果皮原花色素共检测出7种亚基,包括4种延伸亚基和3种末端亚基,其摩尔百分比分别占亚基总量的86.47%～94.06%和5.94%～12.65%,延伸亚基和末端亚基分别以表儿茶素(EC-p)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)为主。其中,EC-p是贺兰山东麓‘马瑟兰’果皮原花色素的主要构成亚基,其占总量的摩尔百分比为50.46%～70.68%,并以H-Hs和Y-H酒庄最高;10个酒庄‘马瑟兰’果皮原花色素总含量为13.90～35.68 mg/g,并以H-Hs酒庄含量显著高于其他酒庄;不同酒庄‘马瑟兰’果皮原花色素mDP值范围为7.43～16.84,以H-Hs、Q-M、Q-H、Y-H和Y-Mh酒庄较高。

表4 不同酒庄‘马瑟兰’葡萄果皮和种子原花色素特性

由表4可见,‘马瑟兰’葡萄种子原花色素仅检测出6种亚基,包括3种延伸亚基和3种末端亚基,其摩尔百分比分别占亚基总量的70.63%～83.39%和16.61%～29.37%,延伸亚基和末端亚基分别以EC-p和儿茶素酯(CA)为主。与果皮相比,种子原花色素中没有检测到表没食子儿茶素延伸亚基(EGC-p)。其中,EC-p和表儿茶素没食子酸酯延伸亚基(ECG-p)为贺兰山东麓‘马瑟兰’葡萄种子原花色素的主要构成亚基,占总量的摩尔百分比分别为44.93%～67.13%和5.31%～20.58%,其中以H-Hd酒庄的EC-p含量占比最高;不同酒庄‘马瑟兰’葡萄种子原花色素的总含量范围为54.79～108.67 mg/g, 显著高于果皮;种子原花色素mDP值则低于果皮,范围为3.58～6.02。

2.4 不同酒庄‘马瑟兰’葡萄果实品质多元统计变量分析

2.4.1 PLS-DA和层次聚类分析

A.PLS-DA得分图;B.PLS-DA载荷图;C.PLS-DA的VIP得分图;D.聚类谱系图;ECG-p-SD. 种子原花色素ECG-p摩尔百分比; EC-p-SD. 种子原花色素EC-p-SD摩尔百分比; TA. 果皮总花色苷含量; Non-acylation Content. 果皮非酰化花色苷含量; EC-p-SK. 果皮原花色素EC-p摩尔百分比; EGC-p-SK. 果皮原花色素EGC-p摩尔百分比; Pn3g. 芍药素-3-O-乙酰葡萄糖苷; ECG-p-SK. 果皮原花色素ECG-p摩尔百分比; Dp3g.飞燕草素-3-O-葡萄糖苷; Pt3g. 矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷。

另外,本研究还对葡萄果实花色苷和原花色素特性指标数据进行标准化处理,通过系统聚类为组间联接,采用欧式距离差平方和法对D值进行聚类分析。

结果(图1,D)显示,10个酒庄被划分为4个类群,第Ⅰ类包括Q-H、H-P、Y-H、N-C、H-Hd和Y-Mq酒庄,其果皮原花色素EC-p、mDP和延伸亚基占亚基总量的摩尔百分比相近;第Ⅱ类包括Y-Mh和N-X酒庄,其果皮原花色素EC、末端亚基占亚基总量的摩尔百分比、乙酰化花色苷占比、Pn3ag、Pn3cag和Dp3cg(cis)含量均较高;Q-M酒庄单独成为第Ⅲ类,其果实种子原花色素EC、CA、C-p、末端亚基占亚基总量的摩尔百分比和非酰化花色苷占比均较高;H-Hs酒庄单独成为第Ⅳ类,其果实含有较高的Cy3g、Pt3g、Pn3g、Mv3g、非酰化花色苷含量、Pt3ag、Dp3ag、Cy3ag、Pt3cag、咖啡酰化花色苷含量、Pn3cg(cis)、Cy3cg(trans)、Pt3cg(trans)和总花色苷含量。

2.4.2 葡萄果实品质指标的主成分分析

通过对‘马瑟兰’葡萄各品质指标测定值进行主成分分析,最终提取5个主成分作为果实品质的综合评价指标,其累积方差贡献率为88.91%。结果(表5)表明,与主成分1有较高正相关性的指标有色差值a*、果皮原花色素延伸亚基摩尔百分比和果皮原花色素mDP,而负相关性较强的有果皮原花色素延伸亚基摩尔百分比和乙酰化花色苷占比,即主成分1的方差贡献率大时,色差值a*、果皮原花色素延伸亚基摩尔百分比和果皮原花色素mDP均增加,而果皮原花色素延伸亚基摩尔百分比和乙酰化花色苷占比均减少;与主成分2有较高正相关的品质指标有种子原花色素延伸亚基摩尔百分比和种子原花色素mDP,有较强负相关的为种子原花色素末端亚基摩尔百分比和可溶性固形物含量;与主成分3有较强正相关性的为色差值L*、果皮原花色素含量、种子原花色素含量和总花色苷含量,有较强负相关性的为咖啡酰化花色苷含量和浆果粒重;与主成分四有较强正相关的有色差值b*、可滴定酸含量;与主成分5有较强正相关的有香豆酰化花色苷占比,有较强负相关的是非酰化花色苷占比和总花色苷含量。

表5 ‘马瑟兰’葡萄果实品质指标的主成分分析

5个主成分分别从各个方面反映了‘马瑟兰’葡萄果实的品质,对其品质进行综合评价。利用公式计算出综合得分:S=S1λ1/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5)+S2λ2/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5)+S3λ3/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5) +S4λ4/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5)+S5λ5/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5),λ1、λ2、λ3、λ4、λ5分别为5个主成分的贡献率,S1、S2、S3、S4和S5分别为主成分1-5的得分,最终的综合得分越高,则其综合品质越好。

最终,不同酒庄‘马瑟兰’果实品质综合排名为H-Hs>Y-Mq>Q-H>H-Hd>H-P>Y-H>N-X>Q-M> Y-Mh>N-C(表6)。经综合分析,红寺堡子产区的果实综合品质均较好,尤其以H-Hs的表现最佳。

表6 不同酒庄‘马瑟兰’葡萄果实品质的综合评价结果

3 讨 论

贺兰山东麓酿酒葡萄产区处于季风气候边缘,气候多样和丰富的土壤类型使得该产区酿酒葡萄果实品质不尽相同,葡萄酒也各有特色[14,7]。本研究中10个酒庄所在地的无霜期均大于160 d,≥10 ℃积温最低为3 459.2 ℃,远远大于葡萄栽培最低界限2 800 ℃,但是10个酒庄的葡萄植株在冬季均需埋土防寒。葡萄园栽培管理措施、种植环境及品种本身特性等多方面的交互作用[15-16]会通过改变果实粒径、果皮/果肉/种子比值[17]、浆果化学物质构成与含量[18]等影响酿酒葡萄原料的品质。

作为红色酿酒葡萄果实中重要的次级代谢产物,花色苷和原花色素对葡萄果实品质形成及葡萄酒的颜色和口感具有重要作用。其中,花青素的甲基化和酰化反应产生的衍生物使得果实表现出多种色调和不同的颜色稳定性[19]。目前,在‘马瑟兰’葡萄果皮中主要检测到了13种花色苷单体[9],而本研究中则检测出了19种花色苷单体,这除了与采用的检测方法不同外,还可能由于贺兰山东麓较强的太阳辐射导致果实内苯丙烷生物合成途径相关基因上调,从而增加花青素等花色苷前体物质在果实中的合成[20]。此外,产地环境条件如土壤、光照、热量、水分、坡向、海拔等对葡萄果实化学成分具有重要的影响[21-22],尤其是挥发性香气物质和酚类化合物。有研究表明,不同产区‘马瑟兰’葡萄果实香气物质和酚类化合物的含量存在明显的差异[8],但该研究并未涉及宁夏贺兰山东麓产区。王宁等[22]、彭婧等[23]研究发现贺兰山东麓‘霞多丽’和‘赤霞珠’等品种果实酚类物质含量也存在明显的产地差异性,但呈现出的差异规律与本研究中‘马瑟兰’葡萄有所不同,表明酿酒葡萄品种本身也是造成产地间果实品质差异的重要因素。本研究分析了贺兰山东麓4个子产区10个酒庄‘马瑟兰’葡萄果实基本理化指标、花色苷和原花色素的组分与含量等指标,各个指标相互独立且不同酚类物质的组成与含量差异明显。其中,H-Hs酒庄葡萄果实果皮总花色苷和总原花色素含量均显著高于其他大部分酒庄,果实颜色呈现较深的紫红色,这可能与当地的土壤类型、光照条件和果实成熟期间≥10 ℃积温等有关[24]。此外,果实中较多的黄酮醇和黄烷-3-醇有利于花青素的辅色反应,从而增强葡萄果皮颜色强度[24],具体还需要针对‘马瑟兰’葡萄做进一步研究。

糖、酸、花色苷和原花色素等酚类物质是评价酿酒葡萄果实品质的重要因子[25]。为了筛选出贺兰山东麓不同子产区‘马瑟兰’葡萄果实品质差异的重要标志性指标,本研究采用PLS-DA分析和聚类分析确定了造成10个酒庄间葡萄果实品质差异的5个关键指标:种子原花色素ECG-p摩尔百分比和EC-p摩尔百分比、总花色苷含量、非酰化花色苷含量与果皮原花色素EC-p摩尔百分比,并将10个酒庄划分成了4类。并通过PCA分析得出‘马瑟兰’葡萄在红寺堡子产区的种植表现更好,这与文秀萍等的研究结果[26]较为一致,其对贺兰山东麓‘马瑟兰’葡萄的生态区划发现青铜峡市、红寺堡区等地属于生态优质区,这也与本研究中青铜峡子产区的Q-H酒庄‘马瑟兰’果实综合品质排名较前一致。

除了花色苷和原花色素等重要酚类物质外,果实香气化合物也是酿酒葡萄果实品质的重要指标。因此,后续将进一步研究贺兰山东麓产区‘马瑟兰’葡萄果实香气物质的产地差异性,并结合本研究结果进行综合评价,从而为该品种在贺兰山东麓产区的合理化种植提供科学依据。