桤木Genomic-SSR 与EST-SSR 分子标记的差异分析

王泽亮 ,杨勇智,杜晋城,陈炙,黄振,郭洪英,2

1.四川省林业科学研究院,四川 成都,610081；2.四川省草原科学研究院,四川 成都, 611731

桤木属（AlnusMill.）为非豆科固氮树种，根系富含根瘤，可改良土壤，是重要的先锋造林与生态功能树种。桤木属是现存桦木科植物中最原始的属，也是北半球新生代植物区系的重要植物类群，主要分布在欧亚和北美，拉丁美洲与非洲有少量分布[1-2]。四川省及邻近地区是桤木属的重要分布区，原生分布有桤木（Alnus cremastogyne,又名四川桤木）、川滇桤木（A.ferdinandi-coburgii）、毛桤木（A.lanata）、尼泊尔桤木（A.nepalensis），可能是桤木属植物起源与分化的中心[1]，其中桤木是我国最重要的一个特有种，也是研究最广泛的一个种，生长迅速、适应性强、童期短且结实量大，目前其适生栽培区域已扩大至长江中下游地区，是中国长江流域退耕还林工程、生态建设工程和混交造林的重要树种。

SSR（Simple sequence repeat，简单序列重复）分子标记具有分布广泛、多态性丰富、稳定、共显性等特点，自从被开发以来，在物种遗传改良上获得了广泛的应用。在桤木属植物SSR 研究方面，Zhuk 等最早开发出了桤木SSR 引物[3]。随后，Lance等通过筛选海岸桤木（A.maritima）基因组文库获得了19 条桤木SSR 引物[4]。使用Lance 开发的引物，Jones 等人系统研究了美国濒危物种海岸桤木的遗传多样性与群体结构等，为其提供了的濒危保护理论基础[5,6]。随后SSR 技术逐渐的应用到其他桤木属树种中，这些树种的群体遗传变异基础与进化史也逐渐被深入揭示[7-10]。目前国内桤木遗传改良研究主要集中于育苗、栽培等常规育种方面，在群体遗传变异研究上，主要通过表型鉴定方法进行[11-14]，采用分子标记手段的研究较少，仅有卓仁英等建立了RAPD 体系[15]。在SSR 分子标记方面，也仅有饶龙兵等基于桤木、欧洲桤木（A.glutinosa）、硬桤木（A.firma）转录组数据开发了适用于桤木属的SSR标记[16]。总之桤木群体遗传变异缺乏分子水平上的数据支撑，影响了其保护与进一步的推广利用。

此外，SSR 分子标记从来源上说包括Genomic-SSR 与EST-SSR，分别来源于基因组数据与表达序列标签（Express sequence tags，EST）数据。本研究分析了2 种来源的桤木SSR 标记的差异，以期推动其在国内桤木遗传变异研究上的应用。

1 材料与方法

1.1 植物材料

采样群体为天然次生林，共包括13 个群体（表1）。群体范围包括成都平原区、盆周山地区、盆地丘陵区、川西高山峡谷区和川西南山地区。群体取样单株之间相距至少50m，采集桤木新鲜叶片，硅胶干燥保存带回实验室。

表1 桤木群体基本信息Tab.1 Location and number of trees sampled in 13 Alnus Cremastogyne populations

1.2 DNA 提取与PCR 扩增

使用天根植物基因组提取试剂盒DNA（DP305）提取基因组DNA。

SSR 扩增所用引物来源于2 部分：（1）Genomic-SSR，公开发表文献中其它桤木属树种相关研究中使用的SSR 引物[3-4,17-18]，10 对引物；（2）EST-SSR[19]，6 对引物。具体信息见表2。

表2 桤木10 个Genomic-SSR 与6 个EST-SSR 标记遗传参数Tab.2 Genetic diversity of 164 trees in A.cremastogyne revealed by 10 Genomic-SSRs and 6 EST-SSRs

SSR 上游引物添加FAM 荧光标记。PCR 扩增使用Takara Taq 聚合酶(Takara,Dalian,China)，20 uL反应体系包括：13.85 μL ddH2O,2.0 μL 10 × buffer,2.0 μL 2.0 mM dNTP,0.5 μL of each primer (at 10 μM),1 μL 基因组DNA 模版（30-50ng），and 0.75 U Taq DNA 聚合酶。扩增程序如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，退火温度退火20 s，72 ℃延伸40 s，25-30 个循环；72 ℃延长5 min，4 ℃保存。退火温度根据文献或引物设计软件给出的数据。PCR 产物进行毛细管荧光电泳分型，SSR 片段长度由软件GeneMarker version 2.2.0 (SoftGenetics,USA)判读。

1.3 SSR 数据统计分析

首先利用Excel2007 整理整合GeneMarker 输出的基因型分子量数据，随后数据输入基于R 环境的Polysat 1.6 软件[20]，整合相关信息后，最后输出为GenoDive 格式文件进行进一步分析。利用GenoDive 2.0b27[21]计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、总望杂合度（Ht）、固定系数（Gst，同Fst）等遗传参数，评价各群体的遗传多样性水平。基因流值（Nm）根据公式（1-GST）/（4GST）估算[22]。

利用GenoDive 2.0b27 计算Nei’s（1978）遗传距离，运用NTSYS-pc 2.10s 软件生成UPGMA 聚类图并计算各遗传距离的相关系数[23-24]。

2 结果与分析

2.1 桤木Genomic-SSR 与EST-SSR 多态性比较

利用10 个Genomic-SSR 位点与6 个EST-SSR个位点检测了13 个桤木群体164 个个体的遗传多样性参数，16 个位点全部具有多态性。进一步分析结果表明（表2），在10 个Genomic-SSR 位点中，平均等位基因数为13.10，平均有效等位基因数为3.779，平均观察杂合度为0.849，平均期望杂合度为0.754；对EST-SSR 来说，平均等位基因数为13.33，平均有效等位基因数为4.033，平均观察杂合度为0.768，平均期望杂合度为0.643。平均等位基因数EST-SSR 位点高于Genomic-SSR 位点，而对检测的杂合度来说，Genomic-SSR 位点高于EST-SSR 位点。就单个位点而言，揭示遗传多性度最高的为EST-SSR 位点Ace29，其等位基因数达到27，有效等位基因数为8.467，观察杂合度为0.994。在10 个基因组SSR 位点中，等位基因数≥20 的位点有2 个，在10 与20 之间的位点有4 个，10 以下的位点有4 个；而6 个EST-SSR 位点中，有1 个超过20，在10（包括等于）与20 之间的位点有4 个，10 以下的位点有1 个。

针对13 个桤木群体来说，除了平均有效等位基因数 EST-SSR 位点高于 Genomic-SSR（4.251>3.941）之外，其余3 个遗传参数（平均等位基因数、观察杂合度、期望杂合度）Genomic-SSR 位点均高于EST-SSR。对于具体群体来说，Genomic-SSR 与EST-SSR 位点分析均显示F（冕宁）群体遗传多样性水平最高，但是Genomic-SSR 位点显示I（平武、Ne 值最小）、J（青川、Na 与Ho 值最小）、Q（宣汉、Ht 值最小）群体遗传多样性水平最低，EST-SSR 位点显示I（平武、Na、Ne、Ho 值最小）、U（沐川、Ht 值最小）群体遗传多样性水平最低。

2.2 聚类分析

为确定两种标记对桤木群体遗传关系的鉴定准确度，本研究基于Nei’s 遗传距离使用UPGMA 方法对参试材料进行聚类分析，由图1（A、B）可知，Genomic-SSR 与EST-SSR 均将AA 与F 群体归为1 类，进一步Genomic-SSR 标记将其余群体归为3 类：AC、B；I、S、T、V；J、Q、U、K、N，而EST-SSR 划分的3 类为：AC；B、T；I、J、K、N、Q、U、V、S。说明在大的区域分类上，Genomic-SSR 与EST-SSR 相一致，而在小的分类上有差异。

图1 基于Nei’s 遗传距离的桤木群体UPGMA 聚类Fig.1 Unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) cluster analysis of 13 A.cremastogyne populations based on Nei’s genetic distance (A:Genomic-SSR;B:EST-SSR;C:Genomic-SSR+EST-SSR)

基于Genomic-SSR 与EST-SSR 总的16 个标记的Nei’s 遗传距离构建的UPGMA 聚类树显示桤木群体可明显地分为4 个类群（AA 与F、B、I、其它）（图1 C），与Genomic-SSR 标记结果更为相似，说明本研究中Genomic-SSR 更能精确地鉴别出桤木群体遗传关系。

对 Genomic-SSR、EST-SSR 以及 Genomic-SSR+EST-SSR 计算出的遗传距离进行相关性分析，结果显示（表3）：3 部分相关系数呈极显著正相关（P<0.01），但是Genomic-SSR 与Genomic-SSR+EST-SSR 相关系数稍高，即两种标记计算的综合相关系数与Genomic-SSR 标记更为相似，表明本研究中Genomic-SSR 能更准确地揭示不同桤木个体间的遗传关系，与上述聚类分析结果相一致。

3 讨论

3.1 桤木倍性

在相关研究中，欧洲桤木是被作为二倍体树种进行研究的，随后Lepais 等[7]与Mandák 等[25]在非洲与欧洲分别发现了四倍体群体（2n=4x=56）。在染色体水平上，任保青等[26]与杨汉波等[27]通过核型研究发现桤木染色体数为56，根据洪德元提到桤木属的染色体基数为x=14[28]，或Murai 认为的X=7[29]，则桤木可能是四倍体或八倍体。而核型分析显示桤木染色体结构相同的染色体对数多数为2 对[27]，表明桤木可能正在进行或接近完成二倍体化。由于本研究种桤木SSR 分型数据表现出了四倍体特性，因此本研究以多倍体分析软件Polysat、Genodive 为基础[20,21]，结合NTSYS 软件进行了桤木群体遗传参数估算与分析。

3.2 桤木Genomic-SSR 与EST-SSR 差异比较

本研究对两种来源SSR 标记的遗传差异进行了比较分析，结果显示：平均等位基因数与有效等位基因数EST-SSR 标记高于Genomic-SSR 标记，而两种杂合度Genomic-SSR 位点高于EST-SSR 位点，与前人研究结果均不完全一致。如在宋跃朋等与刘果等分别对杨树与桉树的研究中，均显示Genomic-SSR 标记的等位基因数、多态性、杂合度高于ESTSSR 标记[30,31]，而在张亚东等对杨树研究则显示EST-SSR 标记等位基因数、多态性、杂合度高于Genomic-SSR 标记[32]，而大豆相关研究则显示Genomic-SSR 的等位基因数高于EST-SSR 标记，但是EST-SSR 标记的多态性稍高于Genomic-SSR[33]。在对桤木群体遗传多样性的解析中，Genomic-SSR与EST-SSR 分析结果也不一致。尽管理论上由于EST-SSR 引物来自高度保守的DNA 转录区，其揭示的多态性在理论上应低于基因组SSR 标记，但由于试验材料与参试标记的不同，其显示的遗传差异可能不同。因此，在物种遗传多样性的研究中，应利用不同来源的分子标记进行综合评价，以获得更加客观的结论。

在对桤木群体遗传关系的分析中，在大的类群上Genomic-SSR 与EST-SSR 标记相一致，而在进一步的小类群上则显示出差异，而且本研究中两种标记计算的综合相关系数与Genomic-SSR 标记更为相似，表明本研究中Genomic-SSR 能更准确地揭示桤木不同群体或个体间的遗传关系，与前述宋跃朋等、刘果等与张亚东等研究结果不一致，这3 项研究均显示EST-SSR 能更准确地揭示基因型之间的遗传关系[30-32]。这可能与研究所用材料有关，这3 项研究分析的均是杨树与桉树不同种间的遗传关系，而本研究材料为桤木的不同群体，由于EST-SSR 来自DNA 转录区，保守性强，对亲缘关系较近的基因型灵敏度不及基因组SSR，但在近邻的种间具有通用性，对不同种属系统演化研究、加密遗传连锁图谱、基因精细定位、标记功能研究等具有重要作用。

总之，本研究表明桤木Genomic-SSR 与EST-SSR标记在解析群体遗传多样性与遗传关系方面有一定差异，要得到更准确的结果，需要综合使用两种标记。