金水六君煎对慢性阻塞性肺疾病小鼠模型巨噬细胞M1/M2表型分化的影响*

杨亿然，张 真，刘 雨

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是临床常见的呼吸系统疾病，以不可逆的气流受限为主要特征，临床表现为咳嗽、咳痰及呼吸困难等[1]。COPD与吸烟、呼吸道感染和空气污染等因素密切相关。炎症是COPD发生发展的重要机制，预防和控制肺部炎症的发生是改善COPD患者症状的重要方法[2-4]。肺部炎症与巨噬细胞密切相关，主要包括经典激活的巨噬细胞（巨噬细胞M1极化）和替代活化的巨噬细胞（巨噬细胞M2极化）两种活化方向。M1极化以释放炎症因子、促进炎症发展为主，M2极化以释放抑炎因子、抑制炎症发展为主。因此，明确COPD中巨噬细胞的极化方向有重要意义[5-8]。金水六君煎出自《景岳全书》，具有养阴化痰之功效。现有研究表明，金水六君煎对COPD有着良好的治疗作用。无论是COPD缓解期还是急性加重期，在常规治疗的基础上加用金水六君煎，能有效缩短病程，改善患者症状，减少病情恶化的发生率[9]。研究认为其机制可能与抑制炎症因子高表达有关[10]。因此，本研究以COPD小鼠为研究对象，观察金水六君煎对巨噬细胞极化方向的影响，以阐明金水六君煎治疗COPD的可能机制及靶点。

1 材 料

1.1 实验动物 SPF级雄性ICR小鼠32只，6～8周龄，体质量（16.91±1.24）g，由北京华阜康生物科技有限公司提供，实验动物质量合格证号：110322211101433345，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。本实验经湖南中医药大学动物实验中心审核通过，动物实验伦理批号：LL2022022305。小鼠饲养于12 h黑夜、12 h白昼的环境中，饲养室温度为22～24 ℃，相对湿度为50%～60%。饲养期间小鼠自由进食和饮水。

1.2 香烟 金圣牌香烟，江西中烟工业有限责任公司生产，焦油含量8 mg，烟气烟碱量0.8 mg，CO含量9 mg。

1.3 实验试剂 PBS（批号：04B230203）购自长沙艾碧维生物科技有限公司；CD86抗体（PE）（批号：02S230111）、CD163抗体（APC）（批号：20210727003）、CD206抗体（FITC）（批号：00113481）均购自安诺伦生物科技有限公司；CD68抗体（PC5.5）（批号：00109616）购自百进生物科技有限公司；石蜡（批号：20213642012）、中性树胶（批号：20211031020）购自上海西格玛有限公司；苏木素（批号：20210301006）、PBS（批号：20210618005）、伊红（批号：20211130004）购自美国薇碧生化科技集团公司；白介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（批号：07D21228）、白介素-8（IL-8）ELISA试剂盒（批号：03C20216）、CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG（H+L）（批号：13A2030004）、CoraLite594-conjugated Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（批号：10S22110）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；甲泼尼龙片（批号：13A221229）购自意大利辉瑞制药厂。

1.4 实验仪器 SL02型低速离心机购自上海知信实验仪器；A00-1-1102型流式仪购自贝克曼库尔特有限公司；H1650R型台式高速冷冻离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PW-812型全自动酶标洗板机、MB-530型多功能酶标分析仪均购自深圳市汇松科技发展有限公司；DHP-500型电热恒温培养箱购自北京市永光明医疗仪器有限公司；TS-92型摇床购自其林贝尔；DYY-6C型恒温箱购自北京六一生物科技有限公司；MM721 AAU-PW型微波炉购自美的集团有限公司；M199型切片刀购自德国徕卡公司；YD-315型切片机购自浙江金华益迪试验器材；BMJ-A型包埋机购自常州中威电子仪器有限公司；BCD-245F型普通冰箱购自合肥荣事达电子电器集团有限公司；E-201-C型精密pH计购自上海雷磁环保工程有限公司；BA210T型显微镜购自麦克奥迪有限公司；DY89-1型盖玻片、AY89-2型载玻片均购自海门远泰实验器材厂。

1.5 药物配制 金水六君煎药物组成参照《景岳全书》原方[11]：当归6 g，熟地黄15 g，陈皮4.5 g，法半夏6 g，茯苓6 g，炙甘草3 g，生姜10 g。以上各药均为新绿药配方颗粒，购自湖南省中医药研究院附属医院，经田其学主任药师鉴定确认为正品。将上述药物用适量的灭菌水配置成生药质量浓度为1 g/mL的药液，现配现用。

2 实验方法

2.1 模型制造 将小鼠放置于熏烟箱（1.6 m×0.5 m×0.25 m），箱体设有通风口，防止小鼠窒息死亡。通风口对接烟雾处理设备，防止烟雾逸出污染环境。将20根香烟点燃后并放入熏烟箱内，持续熏烟1 h，中途休息15 min，重复上述步骤再次熏烟1 h，1次/d，2 h/次，连续12周。

2.2 实验分组 将32只ICR小鼠随机分为空白组、模型组、西药组和中药组，每组8只。小鼠给药剂量参考人和动物表面积折算的等效剂量比率表，中药组给药剂量为6.565 g/（kg·d），西药组经人体剂量换算后予甲泼尼龙，4.16 mg/（kg·d）[12]，空白组和模型组小鼠予等量生理盐水灌胃，6.57 mL/（kg·d）。除空白组外，各组小鼠均在第1周起接受烟熏，第5周开始在熏烟前1 h灌胃相应药物。空白组小鼠只灌胃，不做熏烟处理。

2.3 观察指标

2.3.1 肺功能检测 12周后腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉小鼠后，分离暴露气管，进行气管插管固定，使用小动物肺功能检测仪测定每分钟通气量（MV）、吸气峰流量（PIF）及呼气峰流量（PEF）。

2.3.2 肺组织病理 HE染色观察肺组织病理。12周后处死小鼠，取小鼠肺部组织浸入4%多聚甲醛内固定24 h。60 ℃烤片12 h，切片脱蜡至水，经苏木素、伊红染色后，梯度酒精脱水。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性树胶封片，显微镜观察并采集图像。

2.3.3 肺组织IL-6和IL-8水平 取一定量肺组织，制备10%肺组织匀浆液，4 ℃，1 000 r/min离心10 min（离心半径为7 cm），取上清液，严格按照ELISA检测试剂盒说明书检测IL-6、IL-8水平。

2.3.4 肺组织CD68和CD206表达 采用免疫荧光观察小鼠肺组织CD68和CD206表达。取小鼠肺部组织浸入4%多聚甲醛内固定24 h。60 ℃烤片12 h，切片脱蜡至水，热修复抗原，经过硼氢化钠溶液、乙醇溶液、苏丹黑染液处理后，于10%正常血清/5%BSA封闭60 min。孵育一抗：滴加适当稀释的一抗（CD68+CD206），4 ℃过夜。PBS冲洗3次，5 min/次。孵育二抗：滴加50～100 μL抗-小鼠+兔-IgG标记荧光抗体，37 ℃孵育60～90 min，PBS冲洗3次，5 min/次。DAPI工作液染核后PBS充分冲洗后取出。荧光显微镜下观察，荧光显微镜电脑采集图像。

2.3.5 巨噬细胞M1和M2极化情况 采用流式细胞仪检测巨噬细胞M1和M2极化情况。取小鼠肺组织冷冻于液氮内，并用胶原酶I配制成0.2 mg/mL的消化液，组织剪碎后转移至15 mL离心管，加入6 mL消化液，充分消化后加入6 mL DMEM终止消化。使用细胞滤网过滤，剩余组织研磨后，DMEM冲洗过滤网。4 ℃，1 000 r/min离心5 min（离心半径为7 cm），弃去上清液，收集细胞悬液后再次4 ℃，1 000 r/min离心5 min（离心半径为7 cm），收集细胞沉淀。加入CD86和CD163抗体，孵育。设置阴性管，单染管。4 ℃，1 000 r/min离心5 min（离心半径为7 cm），破膜、洗涤，加入CD86和CD206抗体，孵育。设置单染管，洗涤后4 ℃，1 000 r/min离心5 min（离心半径为7 cm），分别加入200 μL PBS重悬细胞，用流式仪检测。

2.4 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料用“均数±标准差”（±s）表示。计量资料符合正态分布且方差齐，使用单因素方差分析，若不符合正态分布，则使用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组小鼠肺功能比较 模型组小鼠MV、PIF和PEF水平均低于空白组（P＜0.05）；中药组和西药组小鼠MV、PIF和PEF水平均高于模型组（P＜0.05）；中药组小鼠MV、PIF和PEF水平均高于西药组（P＜0.05）。（见表1）

表1 各组小鼠肺功能比较 （±s）

表1 各组小鼠肺功能比较 （±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与西药组比较，cP＜0.05。

组别 n 给药剂量 MV/mL PEF/（mL/s） PIF/（mL/s）空白组 8 - 44.85±3.05 4.53±0.32 3.71±0.16模型组 8 - 17.80±2.09a 2.37±0.19a 2.16±0.08a西药组 8 4.160 mg/（kg·d） 31.48±1.90a b 3.64±0.23a b 2.57±0.09a b中药组 8 6.565 g/（kg·d） 37.56±2.95a bc 3.69±0.87a bc 3.16±0.16a bc F 162.015 124.508 220.161 P 0.000 0.017 0.000

3.2 小鼠肺组织病理改变 空白组小鼠肺组织完整，肺泡无明显破裂融合现象；模型组可见肺泡破裂融合，为明显的COPD肺组织征象；与模型组比较，中药组和西药组肺泡破裂融合现象明显减少。（见图1）

图1 小鼠肺组织病理图 （HE，×100）

3.3 各组小鼠肺组织IL-6和IL-8水平比较 模型组小鼠肺组织IL-6和IL-8水平均高于空白组（P＜0.05）；西药组、中药组小鼠肺组织IL-6和IL-8水平均低于模型组（P＜0.05）；中药组小鼠肺组织IL-6和IL-8水平均低于西药组（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组小鼠肺组织IL-6 和IL-8 水平比较 （±s，pg/mL）

表2 各组小鼠肺组织IL-6 和IL-8 水平比较 （±s，pg/mL）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与西药组比较，cP＜0.05。

组别 n 给药剂量 IL-6 IL-8空白组 8 - 0.12±0.02 0.07±0.01模型组 8 - 0.26±0.02a 0.17±0.03a西药组 8 4.160 mg/（kg·d） 0.21±0.02a b 0.15±0.02a b中药组 8 6.565 g/（kg·d） 0.18±0.01a b c 0.13±0.02a b c F 84.301 37.696 P 0.001 0.000

3.4 小鼠肺组织CD68和CD206的表达 免疫荧光实验结果显示，各组小鼠均有不同程度的CD68和CD206阳性表达。其中CD68反映巨噬细胞激活程度，CD206反映巨噬细胞M2极化程度。空白组小鼠肺组织中CD68及CD206表达均不明显，提示巨噬细胞处于未激活状态。与其余各组比较，模型组的CD68阳性表达量最明显，提示模型组肺组织中巨噬细胞被激活。中药组和西药组CD206阳性表达明显升高，提示经过治疗后，肺组织中巨噬细胞有向M2极化趋势。（见图2）

图2 各组小鼠肺组织CD68 和CD206 的表达 （×200）

模型组小鼠肺组织CD68、CD206占比和CD206/CD68均高于空白组（P＜0.05）；西药组、中药组小鼠肺组织CD68占比低于模型组，CD206占比和CD206/CD68均高于模型组（P＜0.05）；中药组小鼠肺组织CD68占比高于西药组（P＜0.05），CD206占比和CD206/CD68均低于西药组（P＜0.05）。（见表3）

表3 各组小鼠肺组织CD68、CD206 占比和CD206/CD68比较 （±s）

表3 各组小鼠肺组织CD68、CD206 占比和CD206/CD68比较 （±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与西药组比较，cP＜0.05。

组别 n 给药剂量 CD68占比/% CD206占比/% CD206/CD68空白组 8 - 2.40±0.18 0.06±0.01 0.03±0.01模型组 8 - 10.55±0.39a 2.64±0.32a 0.25±0.02a西药组 8 4.160 mg/（kg·d） 6.43±0.33ab 3.65±0.19ab 0.57±0.05ab中药组 8 6.565 g/（kg·d） 7.60±0.64abc 3.56±0.39abc 0.47±0.02abc F 1 460.409 946.189 794.516 P 0.030 0.000 0.028

3.5 小鼠肺组织巨噬细胞极化方向 CD86阳性比例反映巨噬细胞M1极化，CD163阳性比例反映巨噬细胞M2极化。模型组小鼠肺组织CD86阳性比例和CD86/CD163高于空白组（P＜0.05），提示巨噬细胞激活以M1极化为主。西药组与中药组小鼠肺组织CD86阳性比例和CD86/CD163低于模型组（P＜0.05），CD163阳性比例高于模型组（P＜0.05），提示巨噬细胞以M2方向极化趋势为主。（见表4、图3）

图3 各组小鼠巨噬细胞M1、M2 型表达水平

表4 各组小鼠肺组织CD86、CD163 阳性比例及CD86/CD163 比较 （±s）

表4 各组小鼠肺组织CD86、CD163 阳性比例及CD86/CD163 比较 （±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与西药组比较，cP＜0.05。

组别 n 给药剂量 CD86阳性比例/% CD163阳性比例/% CD86/CD163空白组 8 - 0.36±0.03 0.52±0.07 0.70±0.01模型组 8 - 2.76±0.08a 0.62±0.05a 4.46±1.34a西药组 8 4.160 mg/（kg·d） 0.85±0.06ab 1.83±0.14ab 0.47±0.04ab中药组 8 6.565 g/（kg·d） 1.24±0.11abc 2.54±0.08abc 0.48±0.05abc F 522.299 310.593 1 426.198 P 0.000 0.000 0.000

4 讨 论

COPD是一种常见的慢性疾病，尤以老年人多见，严重影响患者的生活质量[13]。COPD的急性发展与炎症密切相关，抗炎贯穿COPD治疗始终，控制炎症的进展是治疗COPD的重要组成部分。临床常根据痰培养鉴定选出合适的敏感抗生素进行治疗，当炎症反应严重，难以控制时，常配合激素治疗改善症状。巨噬细胞在炎症反应过程中有着不可替代的作用[14-15]。在人体气道表面，巨噬细胞广泛分布，具有抵御外来病原微生物入侵和调节人体炎症反应的作用[16]。巨噬细胞具有明显的可塑性和非均一性，其激活状态取决于其自身的局部微环境信号。目前，巨噬细胞的表型主要有两类：经典活化型（M1极化）和替代活化型（M2极化），细胞因子和表型标志物可区分两者[17]。M1极化后的巨噬细胞主要分泌IL-6、IL-12和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），具有积极的促炎作用，有利于机体对外来病原体的消灭清除，但是过度的炎症反应对机体组织亦能造成损害[18]。M2型极化后的巨噬细胞主要分泌IL-10、转化生长因子-β（TGF-β），具有积极的抗炎作用，有利于机体炎症的减退，帮助组织修复[19]。研究表明，在COPD发生发展过程中，巨噬细胞的极化现象贯穿其中。对于极化方向，目前主流观点认为，COPD往往由感染导致急性加重，巨噬细胞向M1转化符合炎症的发生发展规律[20]。

COPD属中医学中“肺胀”“喘证”等范畴。咳嗽、咳痰、胸闷气促为主要表现。肺为娇脏，喜润恶燥。肺阴不足，宣降失常，气滞饮停，聚而为痰。肾阴不足，肾不纳气，发为气促[21-22]。金水六君煎养阴化痰，主治肺肾不足，水泛为痰。方中当归补血活血；熟地黄补血滋阴，益精填髓。两者合用，补肺肾之阴，以复肺脏宣降之权，肾脏纳气之能，治病之本[23]。半夏燥湿化痰，陈皮理气健脾，茯苓利水渗湿。三者合用，健脾运湿，化痰止咳，治病之标。甘草调和诸药。诸药合用标本兼治，共奏滋养肺肾、止咳化痰之功。现代药理研究证实，当归可以通过降低毛细血管的通透性、抑制炎症因子的释放、维持机体免疫细胞敏感性来起到抗炎的作用，同时当归还可以通过增加免疫细胞的数量来起到提高免疫力的作用[24]。不同剂量地黄提取物能不同程度地提高T淋巴细胞比值和血清溶血素水平，从而提高机体免疫力。研究表明，地黄醋酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等有明显抑制作用[25]。现代药理研究表明，半夏提取物有显著的镇咳和祛痰作用[26]；陈皮具有抑菌抗炎、抗病毒、抗氧化、清除自由基的作用[27]；茯苓具有增强特异性细胞免疫功能、抗炎、抗病毒等作用[28]。

本实验结果显示，模型组小鼠存在明显COPD病理现象，肺功能各项指标恶化，提示COPD造模成功。经金水六君煎和甲泼尼龙干预后，小鼠肺组织病理和肺功能明显改善，炎症因子减少，提示两者可通过抑制肺部炎症治疗COPD。同时，模型组肺泡巨噬细胞数增多，M1/M2型巨噬细胞百分比升高。经金水六君煎和甲泼尼龙干预后，小鼠肺泡巨噬细胞数降低，M1型巨噬细胞比例下降，M2型巨噬细胞比例上升，提示金水六君煎和甲泼尼龙可通过抑制肺泡巨噬细胞M1极化和促进M2极化来抑制肺部炎症，达到治疗COPD的作用。

综上所述，COPD小鼠肺组织存在巨噬细胞极化M1/M2失衡。金水六君煎可能通过促进巨噬细胞M2极化起到改善肺部炎症，从而起到治疗COPD的作用。