环状RNA在肺癌发生、发展、诊断及预后中的研究进展*

韩 希 综述,张艳亮 审校

昆明医科大学第一附属医院医学检验科/云南省检验医学重点实验室/云南省医学检验临床医学研究中心,云南昆明 650032

肺癌是目前对人类生命威胁最大的恶性肿瘤之一,根据2020年版全球癌症统计报告(GLOBO-CAN2020)的数据,2020年,全球肺癌的发病人数和病死人数分别为220万例和180万例[1]。根据组织学类型,肺癌可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC),其中前者占肺癌的85%[2]。环状RNA(circRNA)是真核生物中的前体mRNA(pre-mRNA)经反向剪接而形成的头尾相连的环状RNA分子,不具有5′“帽”和3′末端结构。1976年,SANGER等[3]首次发现了circRNA的存在,但在当时其被视为错误剪切产生的副产物。随着二代测序技术和生物信息学技术的应用,circRNA被认为是一类具有调节功能的RNA,并且提出circRNA可以作为微小RNA(miRNA)海绵发挥生物学功能[4-5]。有研究显示,circRNA的表达与肺癌的发生和进展过程具有密切联系,在疾病的动态监测过程中发挥关键作用[6]。

1 circRNA概述

1.1circRNA的生物学特性 (1)稳定性:因circRNA具有特殊的环状结构,其表达极为稳定,半衰期可比线性RNA(linear RNA)长达10倍左右,并且天然对核酸酶(RNase)具有抵抗能力,能够使其自身丰度保持在一个较高的水平上[7-8]。(2)特异性:circRNA广泛存在于细胞中,在不同的细胞类型及细胞的生长阶段、不同疾病及疾病的进展阶段分别具有不同的表达模式[9]。(3)丰富性:circRNA 广泛存在于各物种当中,有时其表达丰度可比相应的宿主基因高达5倍以上[10]。(4)保守性:circRNA是一种高度保守的环状分子,且在不同物种当中也具有保守性[11]。

1.2circRNA的形成机制与分类 circRNA分为以下4种类型[12-13]:(1)外显子circRNA(ecircRNA)。ecircRNA的形成主要为套索环化模式,通过外显子的3′端剪接供体与5′端剪接受体结合,形成套索结构,进而再将套索中内含子成分移除。ecircRNA多数定位于细胞质中,富含miRNA的结合元件,能够在恶性肿瘤转录后调控发挥关键作用。(2)内含子circRNA(ciRNA)。线性内含子通过配对诱导反向剪接过程,2个内含子共价结合形成内含子ciRNA。(3)外显子-内含子circRNA(EIciRNA)。EIciRNA是由外显子和内含子共同环化而形成的,大多数位于细胞核,可以调控宿主基因的转录过程。(4)前体tRNA剪接形成的circRNA(TricRNA)。

1.3circRNA的调控机制

1.3.1circRNA的海绵吸附活性 位于细胞质中的circRNA富含miRNA结合位点,可以作为高效的竞争性内源RNA(ceRNA),通过circRNA-miRNA-mRNA轴实现对靶mRNA的调控作用。另外,有些circRNA还可以与多个miRNA结合,实现对多种基因信号通路的调控[14-15]。HANSEN等[5]早期在人和小鼠的正常大脑中发现了一个表达量很高的circRNA分子小脑变性相关蛋白反义转录物1(CDR1as),其富含多于70个miRNA的作用位点,同时还可以与Argonaute(AGO)蛋白相互作用调控miR-7的功能。circRNA 可作为“miRNA海绵”是目前circRNA发挥生物学功能的主要途径。

1.3.2与RNA结合蛋白(RBP)相互作用 RBP是一类可以参与RNA代谢调控的蛋白质。circRNA 可以与 RBP结合形成复合物调节游离RBP的活性,从而对下游靶mRNA的功能产生影响[16]。人类抗原R(HuR)是一种研究较为广泛的RBP,circDCUN1D4可以作为支架促进HuR蛋白与硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)的相互作用,从而提高TXNIP mRNA的稳定性。有研究证实,circDCUN1D4能够通过碱基互补直接与TXNIP mRNA相互作用,可以形成circDCUN1D4/HuR/TXNIP RNA-蛋白质三元复合体,并且circDCUN1D4抑制肺腺癌细胞的转移和糖酵解也需要依赖TXNIP途径发挥调控作用[17]。HUANG等[18]研究发现,circXPO1通过与IGF2BP1相互作用,增强肺腺癌细胞中CTNNB1 mRNA的稳定性,并且通过体内外实验证实了circXPO1/IGF2BP1-CTNNB1轴可以促进肺癌细胞的增殖和迁移,而沉默circXPO1能够抑制肿瘤的生长。上述研究提示circXPO1可能是肺腺癌的治疗靶点。

1.3.3翻译蛋白质或多肽 由于circRNA不具有头尾结构,缺乏翻译所需的必要元件,因此,一般被认为是不具备翻译功能。但最新的研究表明,circRNA可以以一种不依赖帽的方式,通过内部核糖体进入位点(IRES)和6-甲基腺嘌呤(m6A)诱导的核糖体参与位点(MIRES)来启动蛋白质/多肽的翻译[19]。YANG等[20]研究发现,circRNA CIRC-FBXW7在健康人脑中表达上调,由IRES 序列驱动的开放阅读框(ORF)能够对蛋白质FBXW7-185aa的序列进行编码,在人类胶质瘤的发生发展中扮演重要的角色。circZNF609可以在人和鼠的成肌细胞中表达,调节成肌细胞的增殖。circZNF609序列中含有跨过反向剪接位点的ORF,可以以不依赖“帽”和依赖剪接的方式使之被翻译成为蛋白质,并且其翻译过程还可以在应激条件下进行[21]。

1.3.4调节基因的转录和剪接 与线性RNA不同,circRNA可以存在于真核转录组中。EIciRNA广泛存在于细胞核,通过与U1小核糖核蛋白粒子(U1 snRNP)相互作用可以与U1 snRNP形成EIciRNA-U1 snRNP复合物,进一步与亲本基因启动子上的RNA聚合酶Ⅱ(RNA polⅡ)转录物作用,促进亲本基因的转录表达[22]。NAN等[23]通过体内外研究证实,circNOL10可以抑制转录因子SCML1泛素化降解过程并促进其表达,SCML1可以调控HN多肽家族的线粒体功能,影响多条信号通路,最终抑制肺癌细胞的恶性程度及致瘤能力,延缓肺癌的进展。

2 circRNA在肺癌中的作用

2.1circRNA作为致癌基因 LU等[24]研究发现,circCSNK1G3在肺癌组织中表达上调。通过细胞增殖和凋亡等功能实验证实,过表达circCSNK1G3可促进肺癌的恶性程度,并通过生信分析及双荧光素酶检测,circCSNK1G3与miR-143-3p的表达呈负相关,进而诱导下游靶基因HOXA10信号转导促进肺癌的进展。ZHANG等[25]研究结果表明,circ_0017639在肺癌组织中高度表达,circ_0017639的高表达通过触发PI3K/AKT信号转导通路增强了NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。circSATB2在肺癌中上调,发挥致癌作用,敲减circSATB2可抑制细胞增殖、侵袭,促进细胞凋亡;之后通过实验验证发现,circSATB2具有miR-326的结合位点,而肌动蛋白结合蛋白(FSCN1)为miR-326的靶基因,circSATB2 通过调节 miR-326/FSCN1 轴发挥致癌基因的作用。此外,circSATB2可以在NSCLC患者血清外泌体中检测到。因此推测,circSATB2 可以作为肺癌检测的新型循环生物标志物[26]。hsa_circ_0001875是一个在NSCLC组织和细胞系中显著上调的环状分子,可以促进NSCLC肿瘤细胞的增殖和转移;在作用机制上,circ-000187通过转化生长因子β(TGF-β)/Smad2信号通路调节miR31-5p/sp1轴,促进上皮细胞-间充质转化(EMT)过程,发挥致癌作用[27]。

2.2circRNA作为抑癌基因 circSCAP在肺癌组织中的表达水平低于癌旁组织,其表达水平与肺癌患者TNM分期呈负相关;通过生物学功能实验验证发现,过表达circSCAP可以显著减弱NSCLC细胞的活力,抑制迁移和侵袭;circSCAP可以直接与SF3A3结合并促进其降解,导致MDM4S水平升高,激活p53信号,进而抑制NSCLC的恶性程度,延缓肺癌的进展[28]。LI等[29]研究发现,hsa_circ_0030998在肺癌组织较癌旁组织中表达量较低,并可以通过与miR-558相互作用延缓肺癌的进展,抑制细胞增殖活性及侵袭等恶性细胞表型,同时可以降低肺癌细胞对紫杉醇的耐药性。circNDUFB2在肺癌组织中呈低表达,并且可以作为支架蛋白增强TRIM25与IGF2BPs的结合,IGF2BPs是能够促进肿瘤进展的正向调控因子,三者形成的复合物结构可以加速IGF2BPs的泛素化降解进程。此外,circNDUFB2还能够激活RIG-I-MAVS信号通路,触发肿瘤的免疫防御反应[30]。

2.3circRNA与肺癌的转移与侵袭 转移与癌症患者的死亡和治疗失败密切相关。circRNA 是多种恶性肿瘤进展相关的信号转导关键调控分子,如经典的Wnt信号通路、TGF-β等信号通路,这些通路都是影响肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移与EMT的重要调控通路。circ_0001806在NSCLC组织和细胞中表达呈高表达,circ_0001806可通过“miRNA海绵”抑制miR-1182的功能,增强神经肿瘤腹侧抗原2(NOVA2)的表达,促进NSCLC细胞的迁移和侵袭[31]。c-Myc是原癌基因 MYC 编码的转录因子,是多条信号转导通路的靶基因,与多种恶性肿瘤的发生具有密切联系[32]。ZHANG等[33]研究发现,circRNA_010763可作为miR-715的ceRNA发挥生物学功能,抑制miR-715对c-Myc的负调控,上调c-Myc基因的表达,促进癌细胞的生长、加速癌细胞的迁移和侵袭。LIU等[34]研究发现,雌激素受体β(Erβ)可通过与circ-TMX4宿主基因TMX4的5′端启动子区域结合促进其表达;体内外实验验证结果显示,circ-TMX4可以抑制miR-622的表达,通过减少miRNA与其3′非翻译区(3′UTR)的结合,增加CXCR4信使RNA的翻译,从而促进NSCLC细胞的侵袭。

2.4circRNA调控肺癌肿瘤微环境 肿瘤间质与细胞外基质、氧气水平和pH等因素共同构成了肿瘤微环境,微环境变化在肿瘤发生阶段具有至关重要的作用[35]。缺氧是肿瘤生长的重要标志,主要受缺氧诱导因子-1(HIF-1α)的调节。HIF-1α在缺氧环境中表达量增多,可以调节多种与缺氧有关的基因,使肿瘤细胞可以快速对缺氧的微环境进行适应性调节,促进肿瘤的进展[36]。有研究发现,circHMGB2在肿瘤组织中较配对癌旁组织表达上调,circHMGB2的高表达可以影响肺癌细胞的增殖,并且可以通过circHMGB2/miR-181a-5p/CARM1轴促进形成免疫抑制肿瘤微环境来限制程序性死亡受体-1(PD-1)的疗效[37]。SHANGGUAN等[38]研究发现,circSLC25A16(hsa_circ_0018534)可以促进NSCLC细胞的糖酵解过程,提升葡萄糖摄取、乳酸合成和三磷酸腺苷(ATP)产生的能力,促进癌细胞的增殖。此外,circSLC25A16可以吸附miR-488-3调节HIF-1α的表达,促进乳酸脱氢酶的转录激活。

3 circRNA的临床价值

circRNA 稳定性高、半衰期长,并广泛存在于人体的血清、血浆和外泌体中,容易被收集检测,使得circRNA成为包括癌症在内多种疾病理想的生物标志物。

3.1可作为肺癌诊断和预后的生物标志物 在NSCLC组织中筛选出表达显著上调的circRNA100146,circRNA100146对NSCLC的诊断具有一定价值,其灵敏度和特异度均高于大多数肺癌的诊断标志物[39]。circRNA_101237在NSCLC细胞和组织中均呈高表达,经Kaplan-Meier生存分析结果显示,circRNA_101237表达量高的患者的总体生存期短于表达水平低的患者,提示circRNA_101237的表达与NSCLC患者预后不良具有密切关系[40]。

3.2可作为肺癌治疗的靶点 circ_0072088在NSCLC组织中表达显著下调,细胞功能实验中证实,circ_0072088可以通过与miR-944结合抑制LASP1的表达,进而抑制NSCLC细胞的恶性进展,提高NSCLC细胞对顺铂药物的敏感性,因此,circ_007208可能成为NSCLC新的治疗靶点[41]。circRNA-002178在LUAD组织和细胞中显著上调,circRNA-002178可以通过海绵介导miR-34在癌细胞中促进T细胞耗竭促进PD-L1的表达。circRNA-002178可以通过外泌体从癌细胞转移到CD8+T细胞中,并吸收CD8+T细胞中的miR-28-5p诱导PD-1的表达,提示circRNA-002178可作为检测LUAD一个潜在的生物标志物,并可以作为肺癌免疫治疗的靶点[42]。

4 小结与展望

随着circRNA 在不同类型的肺癌组织中被发现,circRNA被证实参与肺癌的进展。circRNA对于肺癌的诊断具有较高的特异度与灵敏度,研究潜力较大。虽然越来越多的研究人员进行circRNA与肺癌发病机制的研究,但大部分研究重点集中在circRNA的miRNA海绵吸附功能上,应更多地关注circRNA与蛋白质的相互作用及其转录调控功能等的研究。由于circRNA数量繁多、功能复杂,它们的分子机制在很大程度上仍然是未知的,阻碍了其在临床上的应用,并且NSCLC患者的预后不良可能与肺癌进展的复杂性和分子机制的不明确性相关。因此,还需对circRNA进行深入研究,使其能够在癌症研究及精准医学领域中正确和精确地使用。