四类兽药残留检测ELISA试剂盒的质量评价

李文辉，于寒冰，方芳，倪香艳，张晶晶，魏紫嫣，怀文辉，赵莹，赵雅妮，王乐宜，孙志文

(北京农产品质量安全中心，北京 102600)

随着经济社会的快速高质量发展，食品安全问题已成为人民群众最关注的问题之一。兽药能预防和治疗动物疾病，有目的地调节动物生理机能，提高生产效益，然而由于对兽药的过度依赖、滥用或不正确使用等原因导致动物体内兽药残留超标，一旦超过限量，会使畜禽和人体内的细菌耐药性增强[1]，不仅影响药物治疗，还会引发疾病，导致中毒，将威胁人类的身体健康[2]。常见的兽药有磺胺类、四环素类、喹诺酮类和氯霉素等抗生素。其中磺胺类、喹诺酮类、四环素类具有抗菌范围广泛、化学性质稳定、价格低廉等优点[3]，主要被应用在动物预防、治疗细菌感染的疾病[4]；氯霉素是一种酰胺醇类抗生素，抑制细菌生长的作用，被广泛用于治疗畜禽感染性疾病，对人体造血系统的毒性极大，容易引起再生障碍性贫血症，可损害视力，引起急性中毒性表皮松懈症[5]。为了控制这些药物的使用，中国、欧盟等国家和组织对它们的最高残留限量做出了规定，我国农业农村部颁布的GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[6]和GB 31650.1—2022《食品安全国家标准 食品中41种兽药最大残留限量》[7]对兽药在动物体内的最大残留限量和日允许量做出了规定，但仍存在违规使用的情况。

目前药物残留检测的方法主要有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等[8-10]，这些方法的优点是准确定性定量检测，但前处理过程复杂、成本较高，给基层企业和单位的带来不便，不能满足快速检测需求。农业农村部在2008年同时发布了《1025号公告8—2008 动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测 酶联免疫吸附法》等方法[11-14]，这些方法的优点是成本低、操作简便、用时短，适合于基层和现场检测，但也存在准确性差，易出现测定结果不准确等缺点[15]。目前我国兽药残留试剂盒采用备案管理制度，缺乏后期对产品的监督，导致产品质量和稳定性差，达不到检测要求；基层检测实验室不掌握试剂盒评价方法，不能够判断产品质量好坏，给检测结果带来不确定性因素[16]。为规避筛选方法的检测风险，本研究依据农业农村部《兽药管理条例》和《关于加强兽药残留检测试剂(盒)管理的通知》(农办医[2005]3号)制定的《兽药残留酶联免疫试剂盒备案审查技术资料要求》和《兽药残留酶联免疫试剂盒备案参考评判标准》[17]，对部分市售兽药残留试剂盒进行质量评价，通过综合评价获得了4个品牌四类兽药残留试剂盒的质量，希望为基层选择兽药残留试剂盒提供技术参考，为支撑畜禽产品监管和快检产品高质量发展打下基础，保障北京市畜禽产品的质量安全。

1 材料与方法

1.1 试样制备

本研究中选用动物性产品基质相对复杂同时国家标准残留限量要求最严格的鸡蛋样品，鸡蛋样品6枚，来自北京正大公司，经液相色谱-串联质谱仪检测无本试验中的兽药残留，将样品去壳，用均质机匀浆，置于50 mL离心管中于-20 ℃保存备用。

1.2 试验设备

电子分析天平(ME802E型，瑞士梅特勒公司)；均质器(AX2000A型，北京安信惠康科技有限公司)；涡旋混合器 (MS3型，德国艾卡公司)；氮吹仪(Organomation Associates型，美国Jnc公司)；酶标仪(Infinite F50装载有450 nm滤光片，奥地利帝肯公司)；高速冷冻离心机(CF16RN型，日本HITACHI公司)；移液器(20～200 μL、100～1 000 μL、1～10 mL、50～300 μL，美国Eppendorf公司)；量筒、烧杯、计时器等。

1.3 试剂及耗材

磺胺类、四环素类、喹诺酮类、氯霉素残留检测试剂盒：通过北京市售官方渠道购买，1号和2号为进口品牌试剂盒，购自美国的公司，3号和4号为国产品牌试剂盒，购自北京本地公司，甲醇(色谱级)和乙腈(色谱级)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。离心管(50、15、1.5或2 mL)，超纯水，枪头(20～200 μL、100～1 000 μL、1～10 mL)，吸水纸等。

1.4 标准物质

磺胺二甲嘧啶标准品(批号:46802,纯度:99.6%),磺胺甲恶唑(批号：31737，纯度：99.9%)购于Sigma公司；恩诺沙星标准品(批号：132847，纯度：99.0%)，达氟沙星(批号：127052，纯度：94.0%)，盐酸四环素标准品(批号：C17396150，纯度：99.4%)，盐酸土霉素标准品(批号：C15820000，纯度：98.5%)，氯霉素标准品(批号：G129945，纯度：99.2%)购于Dr. Ehrenstorfer公司。

1.5 标准溶液配制

分别准确称量标准品至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解标准品定容，并配置成1 000 μg/mL标准品储备液，于-20 ℃冷冻保存；分别移取适量标准储备液至10 mL容量瓶中，标准品用甲醇定容到浓度为10 μg/mL，放置4 ℃冰箱保存备用。

1.6 评价方法和指标

本研究根据农业农村部针对《兽药管理条例》和《关于加强兽药残留检测试剂(盒)管理的通知》(农办医[2005]3号)制定的《兽药残留酶联免疫试剂(盒)备案参考评判标准》[17]和 SN/T 2775—2011《商品化食品检测试剂盒评价方法》[18]进行设计，考虑到基层检测机构和企业的实际需求，本次研究选取标准曲线相关系数、检测限、定量限、准确度、精密度以及交叉反应6个技术指标进行评价，同时综合评价前处理时间、性价比等客观因素。本研究按照说明书要求严格操作执行。

1.6.1 标准曲线评价

标准曲线是指标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。定量方法是测定不同品牌不同药物的5个标准溶液浓度，每个浓度测定5次，其均值作为标准曲线的测定值，按产品说明书的程序操作，以各类药物标准溶液浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，标准溶液的吸光度和浓度存在一定的关系，以算出相关系数R2值，以确定工作浓度范围和半抑制浓度(IC50)范围[17-18]。

1.6.2 灵敏度评价

灵敏度的评价包括检测限和定量限测定，检测限和定量限越低代表产品灵敏度越高。根据农业农村部发布的《兽药残留酶联免疫试剂(盒)备案参考评判标准》[17]方法，检测限为以20份空白样品测定均值加3倍标准偏差作为检测限测定方法；定量限为以20份空白样品测定读数的均值加10倍标准偏差，计算平均值及回收率，通过检测限和定量限数值评价灵敏度。

1.6.3 准确度和精密度评价

以添加回收率表征定量检测试剂盒的准确度。对于有最高残留限量的药物，添加浓度为最大残留限量(MRL)、1/2倍MRL和2倍MRL；对于禁用药物，添加浓度为定量限和2倍定量限，每个添加浓度测定5个平行样，并进行3批试验(不同检测日期，不同标准曲线，不同批次试剂盒)[13]。

以添加回收率的相对标准偏差检测试剂盒的精密度。针对每一种样品n的m个测试组分在d天内进行r次重复测定，其中r×m应不小于10；n至少为2；d至少为2。计算得到的重现性试验下的相对标准偏差(RSD)值。批内变异系数：每批平行样之间的变异系数≤25%，对于禁用药物≤30%。批间变异系数：所有样品之间的变异系数值≤30%，对于禁用药物≤40%[16]。

磺胺类、喹诺酮类、四环素类试剂盒的3个添加浓度为50、100及200 μg/kg，氯霉素试剂盒的3个添加浓度为0.05、0.1及0.2 μg/kg。

1.6.4 交叉反应评价

交叉反应是评价酶联免疫试剂盒特异性的方式，交叉反应一般以交叉反应率作为评价指标，交叉反应率一般是通过竞争抑制曲线来判断的[17]。交叉反应标准曲线浓度按照每个品牌每种药物标准品浓度制备，每个浓度点做3个重复。不添加抑制物质的对照孔的吸光度(OD)值为B0，添加了抑制物质的孔的OD值为B，IC50为50%抑制浓度即B/B0=50%时所对应的浓度，求出各自在IC50时的浓度，按下列公式计算交叉反应率(S)。IC50的数值越小，说明抗体的特异性能越强。

S=y/Z×100%。

S：交叉反应率，y：IC50时抗原浓度，Z：IC50时近似抗原物质的浓度。

1.7 其他因素评价

本研究在由国家规定评价技术指标的基础上，同时考虑了应用兽药残留试剂盒的人员关注的样品处理过程、检测时间、性价比等方面的因素，综合评价试剂盒的质量。样品处理过程按简单、一般、复杂3种分类，性价比以高、中、低3种分类，检测时间以分钟计算。

2 结果与分析

2.1 标准曲线线性范围

线性相关系数及平均IC50的结果见表1。可以看出，在不同药物各自的标准溶液浓度范围内吸光度与药物标准溶液浓度呈良好线性相关，相关系数均大于0.99。

表1 不同品牌四类兽药残留试剂盒基质标准曲线线性回归方程及相关系数

2.2 试剂盒的灵敏度评价

检测限是在给定的置信水平上，样品中的目标物能被可靠地与噪音背景区分的最低浓度或含量。检测限越低代表目标物能被检出的最小浓度越低，试剂盒的性能越好。测定结果如表2所示，总体上看，1号和2号进口试剂盒检测限明显低于3号和4号国产试剂盒，但整体上相差不大，符合液相色谱-串联质谱仪器国标定量检测方法的检测限要求。不同品牌的试剂盒检测限高低排序为：磺胺类：2<1<3<4；喹诺酮类：1<2<3<4；四环素类：2<1<3<4；氯霉素：1<2<3<4。

表2 不同品牌四类兽药残留试剂盒的检测限测定结果

定量限是用来反映方法或产品的能够准确测定待测药物浓度的最低浓度。测定结果如表3所示，综合结果分析，所有品牌所有种类药物回收率都大于60%，平均结果准确度都符合测定要求，浓度范围窄，定量限低，符合检测需求。在保证回收率的前提下，不同品牌试剂盒定量限高低排序为：磺胺类：1<2<3<4；喹诺酮类：3<1<4<2；四环素类：4<3<1<2；氯霉素：2<3<1<4。

2.3 试剂盒准确度和精密度评价

试剂盒准确度用质控样品的回收率来评价，回收率范围大于40%或符合相应检测标准的要求[17]，根据试剂盒准确度用质控样品的回收率来评价，其回收率应在60%～120%[18-19]。质控样品检测回收率平均值应大于40%，由表 4可以看出，符合要求的有：磺胺类1、2、3号，喹诺酮类1、2、3号，四环素类是1、3号，氯霉素是1、2号。综合判定结果：磺胺类和喹诺酮类回收率最好的是1号，2、3 号可以使用，4号品牌回收率过低；四环素类回收率最好的是1号，3号均可以使用，2、4号回收率低于40%，但MRL以上浓度范围基本可以满足回收率要求；氯霉素回收率最好的是1号，2号均可接受，3、4号回收率低于40%，不稳定，试剂盒准确度不好控制，从准确度上看，1、2号准确度明显高于3、4号。

试剂盒的精密度用变异系数来评价，批内变异系数≤25%，批间变异系数≤30%[16]。由表4可知，试剂盒的添加样品检测精密度变异系数，3号品牌的变异系数平均值最低，2号品牌最高，并且2号品牌在四类药物检测中批内变异系数多数超过25%，批间变异系数也是多数超过30%，精密度不符合检测需求，兽药残留试剂盒的精密度排序为3>1>4>2。

表4 不同品牌四类兽药残留试剂盒的准确度和精密度试验结果

表5 不同品牌四类兽药残留试剂盒的交叉反应结果

表6 不同品牌四类兽药残留试剂盒的其他因素分析结果

2.4 交叉反应评价

按1.6.4中陈述的方法测定四个品牌4类兽药残留试剂盒的IC50和交叉反应率S，但目前的标准中未规定IC50和S需要满足的数值和范围，但交叉反应率越低特异性越强，假阳性出现的概率越低。从磺胺类、四环素类、喹诺酮类药物看，1号的交叉反应率低，特异性强；从氯霉素药物看，1、2号产品交叉反应率高于3、4号，3、4号产品特异性更强，所有产品按说明书使用均可满足检测需求。

2.5 其他因素的评价

对应用人员选择兽药残留检测试剂盒的其他因素的讨论分析，结果如下表 6，不同品牌兽药残留试剂盒各有优缺点，具体根据应用单位的需求判断更适合选择的类别。

3 讨论

3.1 质量技术指标

关于兽药残留酶联免疫试剂盒评价的文献参考不多[20-22]，查到的文献多采用SN/T 2775—2011[18]的方法，但该方法中评价的指标与农业农村部发布的《兽药残留酶联免疫试剂(盒)备案参考评判标准》存在差异[17]，所以本研究选取的技术指标侧重参考农医发[2005]17号文件《兽药残留酶联免疫试剂(盒)备案参考评判标准》[17]的方法操作。研究从兽药残留酶联免疫试剂盒的技术指标(标准曲线、检测限、定量限、准确度和精确度、交叉反应)对市售主流试剂盒做出评价，从上述技术参数评价可以看出，针对标准曲线，在试剂盒说明书参考的浓度范围的相关系数均符合要求，但评价标准中并未对具体每种药物的浓度范围做规定，因此应完善评价标准；针对于灵敏度，检测限和定量限大部分范围窄，差距不大；针对于准确度和精密度，国产试剂盒在准确度上质量好一些，进口产品的精密度的稳定性差，各批次差距很大，可能与运输温度和时间有关系，因此选择兽药残留检测酶联免疫试剂盒时建议先进行有效评价，慎重选择试剂盒；针对交叉反应，试剂盒交叉反应率都高于60%，特异性一般，质量参差不齐，本次测试中进口试剂盒明好于国产试剂盒，但目前没有针对于交叉反应结果评价的规范标准，期望有关部门尽快更新评价标准。

3.2 其他因素

兽药残留试剂盒产品质量评价结果判断与检验人员的经验相关性较强[23]，在操作过程中，样品板的清洗力度控制是关键因素，力度小，样品回流影响结果的判定，力度大，容易溅入别的样品孔造成污染，特别是对弱阳性样品的判断，建议国家对快速检测方法操作人员的采取定期培训学习和考核制度，以保证快检结果的准确性。前处理方法的简便性、适用检测兽药种类的多样性、性价比都成为目前选择兽药残留试剂盒不可量化的因素，建议应用人员根据实际情况客观选择，避免盲目追求高灵敏度。

3.3 与仪器方法的比较

本研究中磺胺类、四环素类、喹诺酮类兽药残留试剂盒的前处理方法比较简单，但氯霉素兽药残留试剂盒前处理过程需经过提取、氮吹浓缩等步骤，这些操作相对其他快速检测法仍相对繁琐，在实验室条件下进行，需要额外配置大型仪器设备，占地空间大。鉴于此，有些厂家提供了可以同时进行提取、浓缩、离心等步骤的可移动式全自动提取仪[24]，但该仪器操作通量小，在实际现场应用时存在诸多限制因素，在完成前处理时仍需借助实验室仪器，给实际推广应用带来困难，因此在实际购买时应考虑到客观条件和实际应用再进行实际购买。

仪器方法一般是包括萃取、净化等前处理过程和样品上机过程。对这四类药物采用通用国家标准方法液相色谱-串联质谱法[25-26]进行确证试验，该方法灵敏度高、特异性强，可以定性和准确定量，但前处理方法过于复杂，对回收率造成影响，不利于计算样品实际浓度，因此要对前处理方法做合理优化；试剂盒方法灵敏度更高，可以用作大量样品的初筛，但免疫学方法容易出现假阳性和假阴性，对检测结果的准确性造成影响，所以要控制好试剂盒的质量技术参数。

4 结论

本研究对北京市售常见4个品牌的四类兽药残留ELISA试剂盒的产品质量进行了全面评价，每类兽药综合评价了6个技术指标：标准曲线相关系数、检测限、定量限、准确度、精密度以及交叉反应。从检测结果来看，兽药残留ELISA试剂盒的标准曲线相关系数R2≥0.99，符合检测要求；检测限和定量限达到试剂盒说明书中所标注的浓度，限值低，符合国家标准中仪器方法的灵敏度的要求；准确度和精密度结果存在差异，特异性不同。综合所有指标，1号优于2号；3号优于4号。基层应用单位可根据检测要求选择合适的兽药残留ELISA试剂盒，为兽药残留ELISA试剂盒的选择提供参考。