日粮添加缓释尿素对育肥湖羊瘤胃代谢和菌群结构的影响

2023-11-10曹力文阿不都沙拉木亚森江姜君孙美杰申军士毛胜勇朱伟云

畜牧与兽医 2023年11期

曹力文，阿不都沙拉木·亚森江，姜君，孙美杰，申军士，毛胜勇，朱伟云

(国家动物消化道营养国际联合研究中心/江苏省消化道营养与动物健康重点实验室/南京农业大学动物科技学院消化道微生物研究室，江苏南京 210095)

近年来，随着我国畜牧业规模逐渐扩大，饲用豆粕需求连年增长，导致我国大豆进口量连年升高，在2020年我国大豆进口量更是突破了亿吨大关。当前我国迫切寻求解决蛋白质饲料资源短缺的新方法和新途径。反刍动物具有复杂的瘤胃微生物区系，可以将非蛋白氮(如尿素)转化为优质蛋白质(微生物蛋白)。因此在反刍动物日粮中添加适量尿素不仅可以实现豆粕的减量替代和节本增效，同时能够缓解我国蛋白质饲料短缺的困局。但尿素在瘤胃内的分解速度极快，往往超过可发酵碳水化合物发酵的速度，造成能氮的不平衡，降低了微生物蛋白的合成效率和尿素氮利用效率[1]。能氮的不同步释放会造成瘤胃氨的积累，不仅会增加氨中毒的风险，多余的氨随尿液排出体外，还会造成尿素氮的浪费和对环境的污染[2-3]。为提高尿素饲喂的利用效率，一些研究致力于开发缓释尿素技术，以促进能氮的同步释放，提高微生物蛋白合成，同时降低氨排泄对环境造成的负面影响[4]。目前的缓释尿素产品主要包括膨化尿素和包被尿素两大类，其中包被尿素多采用天然聚合物或脂质对尿素芯进行包覆，缓释效果较膨化尿素更为出众。一些使用包被尿素替代豆粕的前期研究发现，相比于普通尿素，缓释尿素在高产奶牛瘤胃中显著降低了氨释放速率[5]。此外，日粮添加缓释尿素还可以提高日粮干物质、有机物和粗纤维的消化率[6]。在2项针对肉牛和奶牛的荟萃分析中发现，在以青贮玉米为粗饲料来源的日粮中添加缓释尿素能够提高肉牛的生长性能、提高经济效益[7]，而在奶牛日粮中使用缓释尿素替代豆粕的同时增加能量饲料，可以提高产奶效率。上述研究发现，缓释尿素能够降低氨释放速率，提高生产性能，但目前关于日粮添加缓释尿素对反刍动物瘤胃菌群组成和结构影响的研究较少。因此，本研究以育肥湖羊为研究对象，分别使用缓释尿素和普通尿素替代豆粕，旨在探究缓释尿素在瘤胃中的氨释放模式和日粮添加缓释尿素对育肥湖羊瘤胃代谢、血液生化和瘤胃菌群组成的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物及材料

试验动物：选取15只体重相近(25.7±1.3)kg，安装有永久瘤胃瘘管的3～4月龄公湖羊，每只羊在单独的栏中饲养。试验原料为1种常规饲用级尿素和1种包被缓释尿素(优瑞丹，由上海美农公司提供)，2种尿素的含氮量实测值分别为45.46%和41.50%。

1.2 试验设计及日粮配方

按照随机区组的设计原则将18只湖羊随机平均分为3个处理组，即豆粕对照组(SBM)、普通尿素组(CU)和缓释尿素组(SRU)。豆粕对照组饲喂含13%豆粕的日粮，根据等能等氮原则，普通尿素组和缓释尿素组分别添加1%普通尿素和1.1%缓释尿素替代日粮中7%和7.1%的豆粕，并使用玉米补充尿素缺乏的能量，保证各组日粮具有相近的粗蛋白和能量水平。日粮的营养成分满足中国农业部发布的25 kg育肥羊的生长需求[8]。具体日粮组成和营养成分见表1。整个试验过程分为2周的适应期和4周的正式试验期。每日8：00和18：00等量饲喂全混合日粮(TMR)，并保证5%～10%的剩料量，自由饮水。

1.3 体重、采食量、日增重测定

在正式试验开始和试验结束(第4周)时连续2 d于晨饲前准确称量每只羊的体重，并记录。试验开始后，每天晨饲和晚饲前准确称取饲喂量和剩料量以计算采食量。平均日增重=(末期平均体重-初始平均体重)/ 饲养时间间隔；日采食量=当天饲喂饲料总重量-第二天早晨饲喂前剩料重量。

1.4 样品采集

在试验期每周分别采集3种日粮饲料样品各500 g，试验结束后充分混合通过四分法缩减为每份500 g的饲料样品，并于-20 ℃密封保存，用于日粮营养成分的测定。于试验期最后1周第7天晨饲后0、3 h，分别采集每只羊静脉血10 mL，使用肝素钠抗凝管收集血样，3 000 r/min离心10 min后，取上清液冻存于-20 ℃，用于血浆生化指标的测定。于试验期最后1周第6、7天晨饲后0、2、4、6、8、10 h分别采集瘤胃液20 mL，测定pH值后冻存于-20 ℃，用于氨浓度和挥发性脂肪酸的测定。于试验期最后1周第6、7天晨饲后0、4 h采集瘤胃内容物10 mL冻存于-20 ℃，用于瘤胃菌群的测定。

1.5 样品测定

1.5.1 饲料成分的测定

尿素含氮量的测定：参照张丽英[9]的方法，取适量尿素加入10 mL浓硫酸420 ℃消煮3 h后，使用凯氏定氮仪测定样品含氮量。饲料常规成分的测定：将饲料样在65 ℃环境下烘干，粉碎并过40目筛，参照张丽英[9]的方法，在(105±2)℃烘箱中将饲料样烘干至恒重以测定饲料中水分含量，取适量饲料样进行消煮后使用凯氏定氮仪测定饲料中粗蛋白含量，采用索氏脂肪提出器用乙醚抽提饲料样以测定饲料中粗脂肪含量，将饲料样放入马弗炉中经550 ℃灼烧以测定饲料中粗灰分含量，分别将中性洗涤剂和酸性洗涤剂加入纤维分析仪中测定饲料中中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。

1.5.2 瘤胃液发酵参数的测定

氨态氮浓度的测定：取发酵液样品流水解冻，参照Marbach等[10]的方法，以氯化铵为标准品，用比色法进行氨态氮浓度的测定。挥发性脂肪酸的测定：取待测样品，经流水解冻后，参照秦为琳[11]的方法进行挥发性脂肪酸的测定。12 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm针式过滤器过滤后，使用气相色谱仪(日本，岛津GC-2014C)进行测定，其中柱温130 ℃，汽化温度180 ℃，检测温度180 ℃，压力为60 kPa，氢气压力为50 kPa，氧气压力50 kPa。

1.5.3 血浆生化指标的测定

通过全自动血液生化分析仪分别测定血尿素、血糖、总胆固醇、甘油三酯、总蛋白、白蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶的浓度。

1.5.4 瘤胃内容物DNA的提取

取0.3 g瘤胃内容物置于2 mL离心管，使用PBS清洗后，参照Zoetendal等[12]的方法，经CTAB、Bead-beating(Biospec Products，Bartlesville，USA)、DNA提取液处理后，提取瘤胃微生物的总DNA。使用Nano-Drop 2000c分光光度计(Thermo Fisher Scientific，USA)检测样品DNA浓度(ng/μL)，保证样品D260与D280的比值处于1.8～2.0之间，检测后将样品置于-20 ℃保存。

1.5.5 瘤胃内容物细菌DNA扩增与高通量测序

选取细菌通用V3-V4可变区域为目的片段，对发酵液微生物DNA进行PCR扩增。在扩增过程中引入不同样本的接头Barcode(8 bp碱基序列)和测序引物(314F：5′-ACTCCTRCGGGAGGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACCVGGGTATCTAAT-3′)。PCR扩增采用20 μL的反应体系，反应条件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，重复27个循环；72 ℃ 20 min。扩增完成后，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检验合格的经切胶后，采用试剂盒进行产物回收。回收后的PCR产物使用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统检测定量后，按照测序要求进行Illumian MiSeq测序。

对所有测序后数据作如下处理：原始数据使用QIIME 1.9.10软件进行片段拼接、质量过滤和引物去除。使用Usearch软件鉴定并去除嵌合序列后得到有效序列，按97%的序列相似性将有效序列聚类成不同分类操作单元(OTUs)，并将每个OTU的代表序列与Silva 16S rRNA数据库进行比对、分类和注释。参照Schloss等[13]的方法使用Mothur软件对样品进行α多样性分析(包括：OTUs数、覆盖率、丰富度指数和多样性指数)和主坐标分析(PCoA)。

1.6 数据分析

瘤胃发酵参数和血液生化指标使用SPSS statistics ver.23软件一般线性模型进行分析，日粮是主要影响因素。瘤胃微生物多样性和门、属水平相对丰度使用SPSS statistics ver.23软件非参数检验进行分析，Tukey法进行多重比较，P≤0.05表现差异显著，0.05

2 结果

2.1 育肥湖羊生长性能

如表2所示，试验开始前，不同处理组育肥湖羊的初始体重无显著差异(P=0.995)。经过为期4周的饲喂，不同处理对育肥湖羊的平均日增重、干物质采食和饲料利用率均无显著影响(P>0.05)。

2.2 育肥湖羊瘤胃发酵参数

表3展示了晨饲后10 h内瘤胃各项发酵参数的变化。育肥湖羊瘤胃各项发酵参数的浓度均不存在处理和时间的交互作用(P>0.05)。相比于豆粕对照组和普通尿素组，缓释尿素组在数值上降低了瘤胃pH值，但差异不显著(P>0.05)。如图1所示，在晨饲后3个处理组的氨浓度均呈现先升高后降低的变化趋势。豆粕对照组和普通尿素组的氨浓度在晨饲后2 h时升至最高并迅速下降，而缓释尿素组则维持了晨饲后2～4 h瘤胃内氨浓度的稳定。相比于豆粕对照组组，日粮添加普通尿素和缓释尿素均显著提高了瘤胃氨浓度(P<0.05)。如表3所示，相比于豆粕对照组和普通尿素组，日粮添加缓释尿素对瘤胃总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸浓度均无显著影响(P>0.05)。相比于普通尿素组，豆粕对照组和缓释尿素组的瘤胃丁酸浓度显著升高(P<0.05)，并且日粮添加普通尿素有降低瘤胃戊酸浓度的趋势(P=0.06)。

表3 不同处理对育肥湖羊瘤胃发酵参数动态变化的影响

2.3 育肥湖羊血液生化参数

表4展示了日粮添加缓释尿素对育肥湖羊血液生化的影响。育肥湖羊的各项血液生化指标均不存在处理和时间的交互影响(P>0.05)。如表4所示，相比于豆粕对照组，缓释尿素显著提高了血液中谷丙转氨酶的浓度(P<0.05)，普通尿素组的谷丙转氨酶浓度与其余两组无显著差异。相比于豆粕对照组，普通尿素组显著降低了γ-谷氨酰基转移酶的浓度(P<0.05)，而缓释尿素组的谷氨酰基转移酶浓度位于两组之间。此外，日粮添加缓释尿素有降低育肥湖羊血尿素(P=0.06)和血糖浓度的趋势(P=0.096)，日粮添加普通尿素有提高血液中胆固醇浓度的趋势(P=0.053)。

表4 不同处理对育肥湖羊血液生化动态变化的影响

2.4 育肥湖羊瘤胃菌群丰富度和多样性

表5展示了不同日粮处理对育肥湖羊瘤胃液菌群α多样性的影响。α多样性结果表明，晨饲后0 h和4 h时不同处理组间的育肥湖羊瘤胃液内检测出的OUTs数、Chao 1指数和Shannon指数均无显著差异(P>0.05)。

表5 不同处理对育肥湖羊瘤胃细菌菌群α多样性的影响

由图2a可知，基于Bray-Curtis算法(ANOSIM：R=0.114 7，P=0.076)的PCoA分析结果显示，晨饲后0 h各组间的瘤胃群落组成有分开的趋势(P=0.076)。由图2b可知，基于Bray-Curtis算法(ANOSIM：R=0.103 1，P=0.097)的PCoA分析结果显示，晨饲后4 h各组间的瘤胃群落组成有分开的趋势(P=0.097)。

图2 晨饲后0 h(a)和4 h(b)瘤胃内容物中细菌菌群的主坐标分析

2.5 育肥湖羊瘤胃细菌门、属水平相对丰度

高通量测序结果显示，在育肥湖羊瘤胃中一共检测出7个相对丰度大于1%的门和15个相对丰度大于1%的属。图3展示了瘤胃微生物在门水平上的组成，瘤胃微生物主要由Bacteroidetes、Firmicutes、Spirochaetes、Fibrobacteres、Proteobacteria、Actinobacteria、Synergistota组成，不同日粮处理对门水平的瘤胃细菌均无显著影响(P>0.05)。但在晨饲后4 h时，普通尿素组变形菌门的相对丰度有高于豆粕对照组和缓释尿素组的趋势(P=0.096)。3个处理组的优势菌门均为Bacteroidetes(44.40%～55.28%)和Firmicutes(33.24%～40.32%)，两者相对丰度占84%以上。

图3 不同处理组瘤胃细菌在门水平上的组成(>1%)

如图4所示，在育肥湖羊晨饲后0、4 h的瘤胃内容物中共检测出了15个相对丰度大于1%的菌数。

图4 不同处理组瘤胃细菌在属水平上的组成(>1%)

各处理组的优势菌属均为Prevotella1(21.49%～33.06%)，Rikenellaceae_RC9 gut(5.09%～8.05%)和ChristensenellaceaeR-7 group(5.57%～7.13%)。在晨饲后0 h，普通尿素组湖羊瘤胃内Succiniclasticum的相对丰度显著低于普通尿素组和缓释尿素组(P<0.05，见图5)，但在晨饲后4 h时不同处理组间Succiniclasticum相对丰度没有显著差异(P>0.05)。此外，不同处理没有对其他相对丰度大于1%的菌属产生显著的影响(P>0.05)。

图5 属水平不同处理组间发生显著改变的细菌

3 讨论

3.1 日粮添加缓释尿素对湖羊生长性能的影响

对于肉羊和肉牛来说，日增重和干物质采食量是衡量生长性能的主要指标，而料重比是影响经济效益的关键因素。本研究与Mahmoudi-Abyane等[14]和Corte等[15]的研究结果相同，相比于普通尿素，缓释尿素不能提高育肥羊的生长性能。先前的研究发现，在绵羊育肥期间，其干物质采食量和养分消化率是决定日增重的关键因素[16]。在本研究中，不同处理组间湖羊的干物质采食量没有表现出差异，这可能导致了3个处理组在试验期间具有相似的日增重和饲料利用效率。此外，本研究发现所有处理组的育肥湖羊采食量和日增重与前人研究相比均处于较低水平[17]，可能是由于本试验为探究日粮添加尿素对瘤胃发酵参数的动态变化，选用了瘘管羊进行试验，瘤胃瘘管的安装以及频繁采样导致了湖羊的应激，从而对其生长性能造成了一定的负面影响。先前的研究表明，尿素的最适添加剂量为1%，此时具有最高的经济效益[18]。本试验结果也表明，使用1%的尿素或1.1%缓释尿素均可替代等氮含量的豆粕，但目前缓释尿素价格高于普通尿素和豆粕，因此在反刍动物养殖中普通尿素可能是更好的选择。

3.2 日粮添加缓释尿素对湖羊瘤胃发酵的影响

要提高反刍动物对尿素氮的利用率，必须维持瘤胃内适宜的氨浓度，促进日粮能氮的同步释放。Hailemariam等[19]综述前人研究发现，控制日粮中尿素水解产氨速率可以有效提高瘤胃微生物利用尿素氮合成菌体蛋白的效率。本研究发现，相比于普通尿素，在晨饲后前2 h缓释尿素的水解产氨速率更低，说明缓释尿素在瘤胃内具有降低氨释放速率的缓释作用。同时饲喂缓释尿素维持了晨饲后2～4 h瘤胃内的高氨浓度，此时日粮中可发酵碳水化合物大量发酵，维持瘤胃内氨浓度的稳定更有助于微生物的合成[20]。此外，3个处理的日粮粗蛋白水平接近，但日粮添加普通尿素和缓释尿素均提高了瘤胃氨浓度，这可能是由于部分蛋白质饲料(DDGS等)没有在瘤胃中分解，而尿素是百分百的瘤胃可降解蛋白，导致普通尿素组和缓释尿素组氨浓度的升高。大部分研究认为瘤胃最适氨浓度应处于8～32 mg/dL之间[21-23]，本研究的尿素添加剂量与前人研究得出的最适尿素添加剂量相同[24]，故3个处理组的氨浓度均在最适氨浓度之间。

健康的反刍动物瘤胃pH值通常接近中性，保持动态平衡，以保证瘤胃内微生物、酶活性处在正常状态[25]。本研究中3个处理组的瘤胃pH值均在6.2～6.4之间，且无显著差异，表明各组瘤胃内环境都处于稳定状态。在本研究中除日粮氮源不同外，严格控制采食时间、动物年龄和日粮营养成分、精粗比保持一致，且试验过程中各组瘤胃pH值相近，瘤胃菌群结构没有显著差异，这可能导致不同氮源对总挥发性脂肪酸、乙酸和丙酸的合成均无显著影响。本研究发现普通尿素组的丁酸浓度显著降低，丁酸除供能外，还用于脂肪组织和乳腺组织的脂肪酸合成，利用效率可达80%以上[26]。这可能是由于普通尿素在瘤胃内快速降解，造成晨饲后0～4 h瘤胃氨浓度剧烈变化，抑制了瘤胃内产丁酸菌的繁殖，从而降低了丁酸水平，后续可通过细菌定量进行进一步探究。因此普通尿素组湖羊日增重在数值上降低的部分原因可能是瘤胃丁酸水平较低。

3.3 日粮添加缓释尿素对湖羊血液生化的影响

血浆代谢物的浓度综合反映了机体对营养物质的吸收利用和机体的健康情况[27]。在本试验中，不同处理组间湖羊的各项血液生化指标均在健康羊的标准范围内，这说明所有处理均没有对试验羊的代谢和健康产生负面影响[28]。肝脏是尿素循环的主要场所，血浆中的氨在肝脏转化为尿素，后经肾脏随尿液排出或回到瘤胃用于合成微生物蛋白。瘤胃氨浓度过高会导致氨穿过瘤胃上皮进入血液中，升高血氨浓度，加重肝脏工作负担。在本研究中，缓释尿素组的血尿素水平有降低的趋势，与Holder等[29]得出的结果一致，这表明与普通尿素比，饲喂缓释尿素的中毒风险更低。反刍动物的血糖浓度与机体的糖异生作用密切相关，而生糖前体物含量的多少决定了机体糖异生作用的强弱[30]。在反刍动物体内，丙酸是唯一的生糖挥发酸，由于不同处理组育肥湖羊瘤胃内丙酸浓度相近，所以两者之间血糖水平也没有显著差异。血浆内白蛋白和总蛋白的水平反映了动物机体体液免疫和蛋白质合成的能力[31]。在本试验中，不同处理组间育肥湖羊的血浆总蛋白和白蛋白浓度均无显著，且3组育肥湖羊的血液总蛋白和白蛋白浓度均处于正常范围内，说明湖羊免疫功能正常，日粮添加普通尿素和缓释尿素均不会对机体产生不利影响。

3.4 日粮添加缓释尿素对湖羊瘤胃菌群结构的影响

本研究高通量结果显示，不同处理没有影响瘤胃细菌的丰富度指数和多样性指数，与Ishaq等[32]在羔羊日粮中添加尿素得到的结果相同，这表明因日粮中尿素的种类对瘤胃菌群多样性和丰富度均无显著影响。此外，PCoA分析结果显示，不同处理组间瘤胃细菌群落并未显著分开。本试验中湖羊瘤胃菌群的α、β多样性均无显著差异，这与之前Guo等[33]借助人工瘤胃装置评价缓释尿素得出的结果一致，说明日粮添加缓释尿素并不会改变瘤胃细菌菌群的组成和结构。本研究相对丰度结果显示，不同处理的育肥湖羊瘤胃优势菌门均为Bacteroidetes和Firmicutes，这与前人[34-36]的研究结果相一致。瘤胃内Bacteroidetes和Firmicutes协同参与碳水化合物和蛋白质的消化代谢[37]，在瘤胃营养物质消化代谢过程中共同发挥着重要作用。而在属水平，本研究发现Prevotella、Christensenellaceae_R-7 group、Rikenellaceae_RC9 gut group和Ruminococcus为优势菌属。这些细菌都属于核心菌属，在所有反刍动物中均有发现，并且他们在瘤胃菌群的代谢和功能中起着至关重要的作用[38]。Prevotella和Ruminococcuss是纤维素和半纤维素降解的优势菌种[39]，Christensenellaceae_R-7 group被认为是潜在的益生菌，同时是肠道疾病的潜在生物标志物[40]。在一项针对肉羊的研究中发现，Rikenellaceae_RC9 gut group的丰度与肉中脂肪含量、丁酸和异丁酸呈现显著正相关，这表明Rikenellaceae_RC9 gut group可能具有通过调控丁酸合成促进脂肪沉积的作用[41]。在本研究中，虽然不同处理组间Rikenellaceae_RC9 gut group的相对丰度没有显著差异，但相比于普通尿素，饲喂缓释尿素显著提高了丁酸浓度，并且在数值上提高了日增重，说明日粮添加缓释尿素可能促进了Rikenellaceae_RC9 gut group的生长，需要进一步通过细菌定量进行确定。此外，在本研究中发现在晨饲后0 h和4 h，普通尿素组湖羊瘤胃Succiniclasticum的相对丰度显著低于其余两组。Succiniclasticum可以利用其他瘤胃微生物发酵产生的二次产物琥珀酸，并将其转化为乙酸和丙酸，这可能是日粮添加缓释尿素在数值上提高了乙酸浓度的原因。