m6A 甲基化调控蛋鸡卵泡发育的研究进展

赵海艺，谢佳乐，段晓燕，张立永，刘宇

（河北北方学院，河北 张家口 075000）

N6-甲基腺苷（m6A）修饰是真核生物中最常见最丰富的RNA 修饰， 是RNA 分子腺苷酸第六位氮原子处发生甲基化。 Desrosiers 等在多种真核生物中都检测到了m6A 甲基化的存在。m6A 甲基化修饰调节转录、 转录后和翻译机制，是存在于真核生物细胞内最丰富的转录组学修饰之一。 文章主要对m6A 甲基化修饰的生物学功能及其在家禽生长发育、 繁殖等方面的调控作用展开综述。

1 m6A 甲基化

迄今为止， 已经发现了160 多种RNA 修饰，但N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物所有转录后表观遗传修饰中最丰富的RNA 修饰。 除了信使RNA, m6A 在多种非编码RNA （ncRNA）中也发挥重要作用， 如增强子RNA 和小核仁RNA，可以调节RNA 的选择性剪接、定位、翻译效率和稳定性。 m6A 倾向于在同一基序上进行修饰，即RRACH （R = G 或A；H = A, C, or U）。 目前的研究表明，m6A 的修饰广泛调控生物代谢、生长发育、炎症、癌症等一系列生命过程。

m6A 相关酶是由RNA 甲基转移酶、 去甲基化酶和甲基化阅读蛋白组成。m6A 修饰是动态可逆的，这是由于RNA 甲基转移酶和去甲基化酶的调控。 甲基化阅读蛋白识别m6A 修饰的RNA以展示其生物学功能。

1.1 甲基转移酶

m6A 甲基转移酶，主要包括METTL3、METTL14、肾母细胞瘤抑制WT1 相关蛋白（wilms tumor 1-associating protein， WTAP）和甲基转移酶样蛋白16 （methyltransferase like 16， METTL16） 等。 m6A 通过一个复合物添加到靶点RNA，起到催化m6A 甲基化修饰的作用。

METTL3 主要发挥催化活性，是一种活性腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine， SAM） 。 而METTL14 不具有催化活性， 主要功能不是催化甲基转移，而是支持METTL3 识别RNA 底物的必要成分， 并能与METTL3 结合形成的METTL3-METTL14 复合物， 这种复合物具有更高的催化活性。 WTAP 是一种广泛表达的核蛋白，不具有催化活性， 是因为其缺失保守的催化甲基化结构域， 但WTAP 可以作为衔接蛋白[8]。WTAP 缺失会导致无法形成正常的m6A 修饰，这是由于其缺失会使METTL3、METTL14 无法定位到核斑点上。 因此，三者相互作用共同参与m6A 甲基化修饰过程。

METTL16 是METTL3 的同源物， 是近几年新发现的另一种m6A 甲基转移酶， 可以独立发挥其甲基化功能。 与METTL3/METTL14 不同的是依赖于METTL16 的m6A 标记存在于内含子和内含子-外显子边界。METTL16 还可与核糖体RNA、 mRNA 和lncRNA 结合。 METTL16 作用的发挥主要是通过调控编码SAM 合成酶的Mat2a mRNA ，对着床期胚胎发育至关重要。 目前研究表明METTL16 参与癌症发病机制。METTL16 水平下降与内分泌系统肿瘤患者较低的生存率有关；而METTL16 水平上升与乳腺癌患者生存率较低相关。

1.2 去甲基化酶

m6A 去甲基化酶， 主要负责甲基化的消除。很早之前，METTL3 已被确定是重要的甲基化转移酶，具有转移甲基生物学特性。 但去甲基化酶的身份一直没有阐明，直到2011 年，JIA 等发现了FTO 具有m6A 去甲基酶活性，随后ALKBH5也被鉴定为去甲基化酶。m6A 的调节作用依赖于去甲基化酶，去甲基化酶的发现也证实了mRNA转录后的可逆修饰。

FTO 和ALKBH5 是以α-酮戊二酸依赖性的方式催化m6A 去甲基化。 最早被发现的m6A的去甲基化酶是FTO， 在脑中高表达， 可介导5%～10%的mRNA 去甲基化。而存在于大部分组织的细胞核中的ALKBH5， 是第二个鉴定出的m6A 去甲基化酶， 是高级真核生物中mRNA 最普遍的内部修饰。 FTO 和ALKBH5 的去甲基化机制不同，FTO 需要经过氧化过程，先氧化形成hm6A 或f6A，接着将其转变为未修饰的腺嘌呤。ALKBH5 仅催化m6AssRNA 和ssDNA N-去甲基化，且可将m6A 转换为hm6A，不需要经过氧化过程， 也不需要任何中间体。 Xu C.等的研究表明，敲除ALKBH5 会造成精子畸变，进而导致不育。 而FTO 基因与肥胖和体重指数密切相关。

1.3 甲基化阅读蛋白

m6A 甲基化阅读蛋白， 主要包括YTH 结构域蛋白 （YTHDC1、YTHDC2）、YTH 同源结构域蛋白家族（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3）、异质核糖核蛋白 （HNRNPA2B1、HNRNPC） 和HNRNPG。 m6A 修饰生物学功能的实现依赖于对m6A 结合蛋白的识别和结合。

YTHDF1/2/3 参与mRNA 的剪接与翻译。YTHDC1/2 主要作用部位在细胞核内。YTHDC1 是核m6A 读码器，YTHDF1/2/3 和YTHDC2 是细胞质m6A 读码器。 YTHDC1 可以通过特异性识别并结合存在m6A 修饰的RNA，对RNA 进行可变剪接。

HNRNP 家族成员， 能与异质核RNA（heterogeneous nuclear RNA， HNRNA）形成复合体，也是富含核糖核蛋白的前体RNA 结合蛋白。 包括HNRNPA2B1、HNRN- PC、HNRNPG 等。

2 m6A 甲基化修饰的功能

2.1 m6A 修饰与动物繁殖

已有研究表明，m6A 甲基化修饰是影响生殖功能的重要因素，在调控动物精子发生、卵母细胞的减数分裂过程、 在早期胚胎发育过程中均呈现出动态变化。 敲除METTL3 和METTL14基因后会抑制精原干细胞增殖分化以及减数分裂的起始过程， 使小鼠的生殖细胞m6A 水平下降，最终使精子发生受阻，雄性小鼠不育。 敲除ALKBH5 基因， 会引起m6A 甲基化修饰水平的上升，精细胞会发生凋亡，最终导致小鼠发生生殖功能障碍。 敲除YTHDC2 基因后会使小鼠出现精子发生障碍，进而导致不育。因此，m6A 甲基化修饰与精子的发生和发育密切相关。

有研究证实， 与m6A 相关的酶， 如KIAA1429、METTL3、YTHDF2 和YTHDC1 是卵母细胞生长和成熟所必需的， FTO 参与卵巢衰老。在猪腔卵泡发育过程中， 动态变化的m6A 修饰mRNA 参与了甾体生成、颗粒细胞增殖和卵泡发育。此外，m6A 相关酶参与哺乳动物胚胎发育，在小鼠中，m6A 读取器hnRNPA2/B1 的敲低会阻碍胚胎发育。

2.2 m6A 修饰与疾病

m6A 甲基转移酶METTL3 被鉴定为肝细胞癌不良预后的生物标志物。WTAP 也被证明在恶性肿瘤中高表达， 增强胶质母细胞瘤细胞的增殖、 迁移、 侵袭和致瘤性。 m6A 结合蛋白YTHDF2 与胶质母细胞瘤密切相关， YTHDC1促进AML 的发生发展。有研究表明，METTL3 对维持心肌组织的稳态有很大作用， 其过表达可导致心肌肥厚，其敲减则能有效抑制心肌肥厚。也有研究表明， 甲基转移酶METTL3 在糖尿病患者的肝脏中高表达， 而且与胰岛β 细胞的功能和胰岛素的敏感性密切相关。 在动物实验中也发现， 高脂小鼠中敲减METTL3 会抑制脂肪酸的代谢，可以改善胰岛素抵抗。 了解m6A 修饰的动态调节在基因表达调控中的作用， 有助于为疾病的研究与治疗提供新的思路。

3 m6A 修饰与家禽卵泡发育的研究

家禽的卵泡发育依次经过小白卵泡、 大白卵泡、小黄卵泡和等级卵泡的发育过程，开产时卵巢上形成3～5 个等级卵泡后发生排卵产蛋。在卵泡的发育过程中常会伴随着卵泡闭锁的现象，这主要是由于颗粒层细胞的凋亡所引发的。鸡的卵巢包含数千个静止的原始卵泡， 数百个正在发育的等级前卵泡， 几个黄色的大卵泡和几个排卵后卵泡缺乏卵母细胞。 每天从等级前卵泡队列中选择一个特定的卵泡进入排卵期前队列，开始快速生长直到排卵。 卵巢卵泡的选择与卵巢体细胞的快速增殖和分化紧密相关。 m6A甲基化在鸡卵巢内卵泡的选择过程中起到了十分重要的作用。 Fan Y.等首次报道了鸡基因组内存在着广泛的m6A 修饰，利用MeRIP 技术绘制了鸡卵巢组织m6A 修饰谱。 转录本的总体数量在鸡的卵母细胞选择过程前后维持稳定，而m6A 修饰的转录本比例增加； m6A 在选择前卵泡中在CDS 区域更多， 而m6A 在选择卵泡中，出现更长的外显子片段， 且富集在起始密码子和终止密码子区域。 这种不同的变化示意动态变化的m6A 参与调控卵泡的选择过程

在鸟类和哺乳动物中， 颗粒细胞从未分化状态向分化状态的转变与卵泡选择直接相关。在m6A 修饰的基因中，FGF2 mRNA 随着m6A 逐渐甲基化， 而其表达水平在卵泡选择过程中下降。这表明FGF2 的下调可能是颗粒细胞分化和卵泡选择所必需的。 并且在卵泡选择过程中分析了鸡卵泡中的m6A 甲基组， 提出m6A 修饰可能在调节卵泡发生的基因中起主要作用。

4 结语

m6A 修饰受到研究者的广泛关注，越来越多的m6A 调控酶被发掘， 对于m6A 机制本身的研究也在不断更新。 m6A 修饰在卵泡选择、生长发育以及疾病等方面都发挥重要作用。 在这种情况下， 对于m6A 修饰调控模式的研究在畜牧业具有十分重要的意义。 但是目前对于蛋鸡卵泡发育过程中相关基因的m6A 甲基化水平以及由此引发的相关基因表达变化的研究相对欠缺。随着相关研究的深入，利用m6A 的调控作用，对于提高蛋鸡繁殖性能， 发展蛋鸡产业具有重要意义。