转录组学在皮肤光老化研究中的应用

赵杰,曹文婷

皮肤光老化主要是指长期紫外线照射引起的皮肤衰老,是各种免疫性、炎症性、肿瘤性皮肤疾病的重要诱因,但是关于皮肤光老化的发生发展机制,目前国内外研究尚不完全清楚。近年来,越来越多的学者从转录组学的角度来阐述皮肤光老化的发生发展及其上下游调控机制。本文将国内外对转录组学技术应用于皮肤光老化的研究成果进行综述,旨在总结转录组学技术应用于光老化研究的优势与新发现,并且该技术正在不断革新和发展,这将进一步促进光老化的发生发展机制及防治研究。

1 转录组学的概述

转录组囊括了所有RNA的转录本,各种生物体的转录组主要通过转录组技术来进行研究。生物体通过转录表达其记录在基因组DNA中的信息,mRNA作为中介分子在转录过程中起重要作用。转录及转录前后水平的精确控制则通过非编码RNA完成［1］。转录组学技术始于20世纪90年代,至今该技术不断发展革新,目前主要包括微阵列和RNA测序(RNA- seq)两种技术,前者可以对某一组预定的序列进行定量分析;后者则通过高通量测序对所有序列进行捕获,并且因其可以对未知序列进行测序而被广泛应用。

RNA测序按照RNA类型分为:mRNA测序、LncRNA测序、microRNA(miRNA)测序和circRNA测序［2］。转录组学可以在空间和时间上量化基因的表达差异,提供基因如何被调节的信息,并揭示其生物学功能。转录组学技术使研究不同生物之间、健康个体与患病个体之间的基因表达差异成为可能,而单细胞RNA测序(scRNA-seq)使转录组分析具有前所未有的灵敏度和广度,并发现了新的RNA种类,加深了对转录组动力学的理解［3］。转录组学技术的操作流程包括:1.总RNA的提取;2.构建RNA测序文库:①RNA的分离;②将RNA切割成小片段;③RNA逆转录为cDNA;④测序;⑤通过PCR扩增文库;3.数据分析［4］。

2 转录组测序对皮肤老化发病机制的探索

皮肤老化按照其发生的机理不同,有内源性与外源性之分。随着年龄增长而自然发生的皮肤衰老现象称为内源性老化。而由于外部因素(如长时间受到紫外线照射、吸烟、接触有毒有害化学物质等)引起的皮肤老化称为外源性老化。其中由于紫外线的影响最大,紫外线所导致的光老化被认为是外源性老化中最重要的因素,也是目前研究最多的方向［5］,皮肤粗糙、深皱纹形成、色素沉着是主要表现。

有研究［6］表明,血管生成在光损伤皮肤中起重要作用,Cho等［7］对紫外线暴露和非暴露两组皮肤组织样本的RNA测序数据进行基因表达分析发现,在紫外线暴露组,基质金属蛋白酶相关基因:MMP2、MMP3、MMP8、MMP10和MMP13,参与血管发育的基因:TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、KDR、FGF2和VEGFC的表达水平均上调;参与脂质代谢,尤其是在表皮屏障功能中起作用的基因:LIPN、LIPK和SMPD3,其表达水平随着光老化发展显著下调。提示血管发育和脂质代谢相关基因可能参与皮肤光老化的发生与发展。还有研究［8-11］表明,紫外线照射可刺激血管生成因子分泌增加,从而促进黑素细胞形成黑色素,这与皮肤光老化色素沉着有关。Kim等［12］通过RNA序列分析发现,紫外线照射后内皮细胞比未照射组分泌更多的干细胞因子(SCF),抑制SCF/c-KIT信号通路后,皮肤色素沉着增加被消除,表明内皮细胞来源的SCF在紫外线诱导相关的色素沉着疾病的发展中发挥重要作用,进一步提示了血管发育基因可能是皮肤光老化中参与色素沉着进程的基因之一。综上,脉管系统相关基因的表达变化将可能是探索皮肤光老化发生机制的一个新方向。

紫外线是皮肤光老化的主要诱导因素［5］,转录组技术可用于深入分析紫外线导致皮肤光老化过程中RNA分子如何发挥作用。为了研究UVA诱导的基因改变对皮肤光老化的影响,Zheng等［13］通过对反复UVA照射和未照射的人类真皮成纤维细胞(HDF)转录组进行高通量测序,通过生物信息学分析及q-PCR对差异性表达基因进行验证:238个基因在UVA照射组表达上调,369个基因表达下调,这些差异基因主要通过编码弹性蛋白、芽蛋白、组织蛋白酶K、组织蛋白酶D、组织蛋白酶B、磷酸二磷酸激酶、磷酸葡萄糖醛酸酶等蛋白质,影响皮肤光老化的发生与发展。这些研究结果为皮肤光老化的分子机制提供了新见解。Alafiatayo等［14］应用RNA-Seq检测阐述了HDF暴露于紫外线辐射下会产生基因级联和通路间相互作用,导致MAPK/TNF-α通路激活,而抗氧化基因表达下调,导致细胞氧化应激和过早死亡。

3 转录组学参与研究非编码RNA在皮肤光老化中的作用

转录组分析可识别皮肤老化的分子生物标志物,非编码RNA被认为具有促进皮肤衰老的作用［15-16］,应用转录组测序研究非编码RNA在皮肤老化中的调控取得了突破性进展［17］。

Li等［18］通过RNA-Seq鉴定出UVB辐照和未辐照HDFs的lncRNA差异表达谱,对差异基因进行q-PCR验证及生物信息学分析,其中lncRNA RP11-670E13.6在UVB-HDF组细胞中表达显著增加,敲除lncRNA RP11-670E13.6加速了细胞衰老,细胞周期阻滞,并且RP11-670E13.6的表达可能通过激活p16-pRB衰老通路来延缓HDFs衰老,因此lncRNA RP11-670E13.6可能作为氧化应激原件对皮肤光老化进行调控,这为皮肤光老化的研究提供了新思路。Shen 等［19］通过RNA-Seq分析UVA反复照射后HDFs中lncRNA的表达变化,发现1 730个差异表达的lncRNA,其中1 494个表达上调,236个表达下调,预测的lncRNA靶点与UVA损伤机制下的组织蛋白酶D、丝裂原活化蛋白激酶、TGF-β信号通路以及胶原纤维代谢有关,这些异常表达的lncRNA可能在皮肤光老化中起重要作用。为了进一步研究lncRNA在光老化中的作用机制,该课题组又进行了miRNA测序及q-PCR检测,发现了34个差异表达的miRNA,并构建了miRNA-lncRNA-mRNA调控网络,发现TNF信号通路、甲状腺激素信号通路和溶酶体信号通路的改变,从ceRNA(competing endogenous RNAs)的角度探索皮肤光老化的发生机制［20］。

4 转录组学应用于探索药物改善光老化的药理机制

雪绒花愈伤组织培养提取物(LACCE)被认为对人类永生化表皮(HaCaT)细胞具有抗衰作用,可以改善紫外线诱导形成的皮肤皱纹等老化现象。Cho等［21］使用RNA-Seq来检测HaCaT细胞对LACCE反应的转录组变化,发现LACCE通过上调参与角化和角化的基因,保护皮肤屏障,并能下调各种应激诱导基因表达。虽然LACCE的这些效应在抗光老化中的具体作用未得到进一步证实,但是该研究发现,LACCE抑制了HaCaT细胞中COX-2的表达,而该基因编码诱导炎症反应的蛋白质,因此LACCE的抗应激、抗炎作用可能是其抗光老化的机制之一,这有待进一步研究。

皮肤光损伤引起炎症反应是光老化的发病机制之一,鉴于二甲双胍具有抗炎和细胞保护作用,Xiao［22］等采用转录组测序和多重细胞因子分析、评价体外UVB诱导的急性损伤HaCaT模型及C57小鼠光损伤模型的有效性和二甲双胍的抗炎作用,发现二甲双胍能显著抑制IL-1β、TNF-α和成纤维细胞生长因子2的转录和分泌以及转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)的表达和核易位。该研究提示二甲双胍在光损伤治疗中具有潜在价值。Kim等［23］通过转录组分析发现口服可可粉(CP)可上调丝氨酸蛋白酶 B6c,从而使组织蛋白酶G失活,调节基质生成,故能一定程度地缓解UVB导致的皮肤皱纹形成。

鸡骨胶原肽(CPs)具有典型的胶原特性,Cao等［24］发现,口服CPs对紫外线联合D-半乳糖诱导的皮肤衰老具有剂量依赖性缓解作用,通过转录组分析发现口服CPs后激活的溶酶体可能是CPs抗皮肤衰老的重要途径,但具体的分子机制有待进一步探究。

以上研究不止揭示了某种物质抗皮肤光老化的部分通路机制,其发现的作用通路/基因更是对皮肤光老化复杂分子机制的重要补充,并有望为研发新的抗光老化药物提供靶点。

5 多组学联合分析探索皮肤光老化的发生机制

转录组联合代谢组学:多项研究［25-26］表明,氧化应激反应是紫外线诱导皮肤损伤的重要原因,Narzt等［27］通过比较暴露于UVA或暴露于氧化的多不饱和模型磷脂(UVPAPC)的HaCaT细胞的转录组学、脂质组学、蛋白组学差异,发现两组中有81个共同诱导基因,其中47个为共同下调,通路分析发现,UVA和UVPAPC均显著诱导了NRF2控制的氧化应激反应,并且核蛋白1 (NUPR1/p8/COM1)作为转录因子调控着NRF2通路。Cho等［7］发现,表皮分化复合物成分(SPRR和LCE家族),脉管系统发育(TGFBR1,TGFBR2,TGFBR3和VEGFC等)和基质金属蛋白酶(MMP2,MMP3和MMP13等)被紫外线照射上调,而脂质代谢下调,再次提示脂质代谢相关基因可能通过氧化应激反应破坏皮肤屏障并加速皮肤光老化反应。转录组联合表观遗传学: Shen等［28］通过分析UVA照射后基因组、表观基因组和转录组之间的相互作用,阐明紫外线辐射影响皮肤稳态的复杂分子机制。应用RNA-seq、外显子组-seq和H3K27ac(组蛋白3赖氨酸27乙酰化) ChIP-seq 对紫外线照射后的人角质形成细胞分析,发现:UVA诱导下,H3K27ac基因突变或再分布导致了其基因子集的转录失调,导致UVA照射细胞中形成超级增强子,还发现了CYP24A1、GJA5、SLAMF7和ETV1等新的紫外线靶基因,可用于靶向预防和治疗紫外线诱导的皮肤癌。Holzscheck等［29］从转录组和表观遗传水平深入研究了健康人体皮肤重复紫外线照射后的早期分子改变,发现明显的基因表达差异和甲基化差异,再次表明了在皮肤应激反应时表观遗传和转录组的变化密切相关。

6 结语

综上,氧化应激反应、炎症反应、免疫抑制、DNA损伤、MMP表达增加等相关信号转导通路的激活是皮肤光老化形成的重要机制,对于新通路和基因的发掘以及现有通路和基因功能的进一步阐释离不开转录组学等新技术的不断发展,这些通路和基因的发现可以为皮肤光老化的预防和治疗提供新的靶点和思路。但是由于细胞异质性的存在,每个细胞间的转录组均存在差异,然而这种差异无法通过传统的转录组测序发现,进而催生出新的测序技术—单细胞转录组测序［30］。目前该技术已广泛用于对正常皮肤组织和多种皮肤疾病的研究［31-33］,Sole-Boldo等［34］已通过单细胞测序技术发现不同亚群的HDFs的数量减少、生理功能丧失与年龄相关的皮肤衰老密切相关,未来该技术势必也将更广泛地应用于皮肤光老化的研究中,并为皮肤光老化的防治带来更多新靶点。随着转录组学在皮肤光老化的分子治疗靶点中的不断应用,其也有望成为评估分子治疗效应的重要手段。另外,转录组学与其他组学的联合分析将能更全面、更准确地阐明皮肤光老化的发生、发展及预后。