病毒感染与皮肤肿瘤的相关性

孙澳,王艺萌,张春雷

病毒与肿瘤发展密切相关,据估计,全世界约有15%的肿瘤与感染相关［1］。1964年 Epsteinn等［2］在非洲伯基特淋巴瘤患者细胞系中发现了病毒颗粒,这种病毒被命名为爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus, EBV),是第一种被发现的人类肿瘤相关病毒。迄今为止,人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)、爱泼斯坦-巴尔病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus,KSHV)、默克尔细胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus,MCV)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(human T lymphotropic virus, HTLV-1)7种病毒已被国际癌症研究机构归类为1类致癌物质［3］。研究表明,HPV、EBV、KSHV、MCV、HTLV-1主要通过直接致癌作用导致皮肤肿瘤,本文将从流行病学、分子机制的角度阐述致癌病毒与皮肤肿瘤之间的因果关系,从病毒感染的角度探讨皮肤肿瘤新的诊断及治疗思路。

1 病毒导致皮肤肿瘤的作用机制

病毒介导的肿瘤发生是多种事件共同作用的结果,病毒导致肿瘤可分为直接和间接致癌模式［4］。直接致癌病毒以单克隆形式存在于肿瘤细胞内,病毒基因会整合到宿主基因组中,或成为宿主细胞内的游离基因,表达特定病毒致癌相关基因来诱导和维持肿瘤的发生和发展。病毒癌基因可以引起细胞代谢变化、细胞周期失调、灭活肿瘤抑制基因、抑制细胞凋亡、诱导血管生成,从而导致肿瘤细胞无限增殖、侵袭和转移［5］。对于大部分直接致癌病毒,仅感染病毒不足以发展成肿瘤,肿瘤的发生需要其他辅助因子,如慢性炎症、环境诱导和免疫抑制的参与［1］。HPV、EBV、KSHV、MCV、HTLV-1在皮肤肿瘤中均发挥直接致癌作用:HPV、EBV、KSHV的DNA通常不整合到宿主基因组中,而是成为宿主细胞内的游离基因;MCV的DNA克隆整合入宿主基因组中,HTLV-1将RNA基因组逆转录为DNA,并克隆整合入宿主基因组中。它们均通过表达病毒癌蛋白发挥直接致癌作用。间接致癌病毒顾名思义为不在肿瘤细胞内直接发挥作用,它们通过以下两种主要机制发挥作用:①引发慢性炎症和氧化应激持续损害局部组织;②减少或消除抗肿瘤免疫监视［4］。发挥间接致癌作用的病毒包括HBV、HCV及HIV,其中HIV感染通过引发严重免疫抑制间接促进皮肤肿瘤的发展,除最常见的卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma,KS)外,HIV感染者患其他皮肤肿瘤如皮肤淋巴瘤、皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma,MCC)的概率也会增加。

2 病毒与皮肤肿瘤

2.1HPV与cSCC HPV属于乳头瘤病毒科,迄今已发现了200多种类型,并分为5个属:α、β、γ、μ和ν,分别表现出皮肤嗜性和黏膜嗜性。绝大多数α-HPV表现出黏膜嗜性,与宫颈癌相关;而β-HPV为皮肤嗜性,与cSCC相关;γ、μ和ν属表现出皮肤嗜性并引起疣［6］。

β-HPV与cSCC之间的关联首次是在疣状表皮发育不良(epidermodysplasia verruciformis, EV)的患者中发现的,30%～60%的EV患者在良性皮肤病变发作后10～30年出现cSCC,癌症通常位于皮肤的阳光暴露部位,且90%的cSCC病变中可检测到HPV 5、8［7］。流行病学证据表明［8］,β-HPV是导致cSCC的潜在病原体:cSCC患者中β-HPV DNA阳性率、病毒载量均高于正常对照组,且患者肿瘤皮肤组织比正常皮肤HPV阳性率高。一项前瞻性研究发现［9］,β-HPV DNA阳性的受试者cSCC发病率高于DNA阴性的受试者(风险比HR=4.32,95%CI:1.00～18.66)。荟萃分析表明［10］,HPV 5、8、17、20、24 和 38 与cSCC发展风险增加之间存在显著关联。

从分子机制的角度,β-HPV编码的病毒癌蛋白E6、E7蛋白,通过改变细胞周期,抑制细胞凋亡促进cSCC的发生。Notch信号通路可以驱动角质形成细胞分化,其功能失调会导致角质形成细胞的恶性转化,E6蛋白可以与MAML1结合,从而抑制Notch信号通路功能,诱导cSCC的发生［7］。此外,E6 蛋白可以结合SMAD3并抑制TGF-β信号传导,从而导致细胞的无序增殖［11］。肿瘤抑制因子pRb1通过负调控E2F家族成员(E2F1-3)的活性,使细胞处在G0/G1期稳定状态。E7蛋白可以使pRb1通过蛋白酶体途径降解,进而释放和激活E2F、诱导细胞周期蛋白的转录,从而使上皮细胞自发跨越过G1/S检验点而发生无序增殖和永生化［12］。

在宫颈癌中,α-HPV感染持续存在,并且在所有肿瘤细胞中都可以检测到病毒基因组。相比之下,β-HPV仅参与致癌作用的发生,但不参与肿瘤维持。尽管cSCC患者皮肤HPV DNA含量增加,但肿瘤组织中HPV mRNA定量与正常皮肤组织中无明显差异,说明HPV在肿瘤组织中不活跃表达,不参与维持致癌过程［13］。日光性角化病是cSCC的癌前病变,Weissenborn 等［14］发现,日光性角化病患者的病毒载量显著高于cSCC,癌变过程中 β-HPV的丢失可能并不是偶然的,而是肿瘤进展所必需的。被β-HPV抑制的TGF-β 和 Notch 信号通路在上皮癌发生的早期阶段具有肿瘤抑制作用,但在恶性进展的后期阶段具有致癌性。因此,β-HPV仅在致癌过程的起始阶段起作用,即β-HPV具有“肇事逃逸”机制。β-HPV丢失可能重新激活TGF-β和Notch信号传导,从而促进癌症的进展［15］。

在健康的皮肤上,β-HPV的阳性率很高,因此可以推测β-HPV感染需要辅助因子来诱导致癌过程。在EV患者中观察到的cSCC大多发生在阳光照射的区域,这表明β-HPV感染和紫外线的致癌作用之间存在协同作用［13］。BAK属于促凋亡BCL2 家族成员,在紫外线照射时从线粒体中释放,促进受紫外线损伤的细胞凋亡;β-HPV E6蛋白能够通过蛋白酶体途径促进BAK的降解,从而抑制受紫外线损伤的细胞发生凋亡,导致DNA致癌突变的积累,进而导致肿瘤发生［16］。器官移植受者在免疫抑制后发生cSCC的风险增加65～250倍,且β-HPV感染的负荷增加会使器官移植受者中的cSCC发病率提升,推测免疫抑制与β-HPV可能协同诱导cSCC的发生［17］。

当前流行病学数据和癌蛋白的致癌机制支持皮肤HPV参与cSCC的发病,并且紫外线照射、免疫抑制与HPV有协同作用,但相关机制仍待进一步研究。当前针对α-HPV的二价、四价、九价疫苗已广泛应用于宫颈癌的预防,而针对β-HPV的疫苗正在开发中,Schellenbacher等［18］生产的RG1-VLP嵌合蛋白疫苗对β-HPV产生了强烈的免疫应答,目前正处于动态药品生产管理(current good manufacture practices ,cGMP)生产阶段,有望保护免疫抑制的易感人群,降低cSCC的患病率。

2.2EBV与皮肤淋巴瘤 EBV是一种普遍存在的嗜淋巴双链DNAγ疱疹病毒,可感染全世界超过90%的人。EBV与一系列淋巴组织增生性疾病有关。EBV感染的主要目标是B淋巴细胞,病毒通过病毒包膜蛋白gp350/220与B细胞表面CD21相互作用进入B细胞。除最熟知的B细胞淋巴瘤外,EBV在NK/T细胞淋巴瘤中也呈阳性。其中皮肤B细胞淋巴瘤包括EBV阳性皮肤黏膜溃疡、淋巴瘤样肉芽肿病、浆母细胞淋巴瘤等;皮肤NK/T细胞淋巴瘤包括慢性活动性EB病毒感染-种痘样水疱病样淋巴组织增生性疾病、慢性活动性EB病毒感染-严重蚊虫叮咬过敏、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤,非特指型等［19］。

EBV感染表现出潜伏感染和裂解感染两种模式。在潜伏感染期间,EBV基因组表达五种EBV编码的核抗原(Epstein-Barr nuclear antigen ,EBNA)和两种潜伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP),它们通过诱导活性氧ROS、抑制DNA修复、使细胞周期检查点失活来促进基因组不稳定性;通过下调抑癌基因的表达,激活NF-κB、MYC、BCL-2、Notch1等信号通路,促进B细胞增殖,从而诱导B细胞永生化和淋巴母细胞系的建立［20］。

目前研究集中于EBV感染B细胞的机制,而NK/T细胞的感染过程还不太确定。一种可能是NK/T细胞通过分子突触获得EBV阳性B细胞的CD21分子,从而使EBV通过细胞间感染,从B细胞感染到NK/T细胞［21］。EBV在NK/T细胞淋巴瘤中的致瘤机制可能与NF-κB通路相关。在EBV阳性B细胞淋巴瘤中,EBV通过病毒蛋白LMP1直接激活NF-κB,促进淋巴瘤的发生。Takada等［22］研究发现,在NK/T细胞淋巴瘤细胞系中,EBV感染同样通过LMP1诱导NF-κB活化,抑制受感染的细胞凋亡,使细胞永生。此外,在慢性活动性EB病毒感染患者中发现胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)高表达［23］。先前已经证实EBV感染在B细胞中诱导AID表达,从而诱导体细胞超突变和免疫球蛋白类别转换重组,导致B细胞淋巴瘤的发展,因此,可以推测EBV诱导NK/T细胞中的AID表达,导致基因突变,该推测仍需进一步研究证实［24］。强有力的证据表明EBV感染与B细胞淋巴瘤相关,但诱导NK/T细胞淋巴瘤的机制仍需进一步研究。

外周血中EBV-DNA载量有助于淋巴瘤诊断、监测和预后评估。EBV-DNA载量已被用于诊断移植后淋巴组织增生性疾病,并且美国和欧洲指南建议对同种异体造血干细胞移植后的高危人群进行EBV-DNA定量检测,从而前瞻性筛查移植后淋巴组织增生性疾病［25］。在NK细胞淋巴瘤、移植后淋巴组织增生性疾病及非霍奇金淋巴瘤中,EBV-DNA载量与治疗反应平行,在达到完全缓解的病例中检测不到EBV-DNA,而在难治性或复发性病例中,EBV-DNA载量仍很高,且EBV-DNA载量与疾病分期及LDH水平呈正相关［26］。EBV-DNA在皮肤淋巴瘤中的诊疗作用仍待进一步探究。

2.3KSHV与KS KSHV属于以淋巴细胞嗜性为特征的γ疱疹病毒亚科,KSHV的DNA序列总是存在于KS病变中,但不存在于未受影响的皮肤或大多数其他恶性肿瘤中,并且,KSHV感染通常先于KS的发生,因此KSHV是KS的致病因素［27］。除KSHV外,HIV感染是KS发展重要的辅助因素,KS发病率在一般人群中为1/100 000,但在HIV感染者中约为1/20［28］。

KS肿瘤特征细胞是内皮来源的非典型分化梭形细胞。KSHV有两种复制模式,即潜伏和裂解复制。潜伏期KSHV存在于绝大多数KS肿瘤细胞(即梭形细胞)中,表达潜伏病毒蛋白,包括潜伏期相关核抗原(latency-associated nuclear antigen ,LANA)、vCyclin、vFLIP、miRNAs以及kaposins。这些转录物赋予肿瘤生长和增殖信号、逃避细胞凋亡、促血管生成和炎症信号,以及无限的复制潜力［28］。使用潜伏病毒蛋白基因为探针进行原位杂交,可以显示大多数KS梭形细胞被潜伏感染,只有一小部分梭形细胞亚群(1%～3%)显示裂解感染［29］。尽管KSHV潜伏病毒蛋白总是在所有KS梭形细胞中表达,但与其他致癌疱疹病毒如EBV相比,KSHV潜伏期感染的细胞没有很强的永生性,因此,潜伏感染并不足以驱动KS发病［30］。传统上认为裂解感染不会直接促进肿瘤发生,因为裂解感染的细胞通常会裂解并死亡［30］。然而,临床研究表明,裂解复制在KS发展中也起着关键作用。更昔洛韦可以阻断KSHV裂解感染,而非潜伏感染。在晚期艾滋病患者中,使用更昔洛韦治疗会导致KS肿瘤的发病率迅速显著下降［31］,说明裂解感染在KS发病过程中也起到重要作用。有研究显示［28］,KS病变中的裂解感染细胞产生的细胞因子可以以旁分泌的形式,帮助驱动潜伏感染的细胞增殖。vGPCR、K1和K15等裂解病毒蛋白可以诱导旁分泌作用因子VEGF、ANGPT2、PDGF、GROa 和IL-6,来驱动潜伏感染细胞增殖、支持潜伏感染细胞的存活和免疫逃逸,还可以募集未感染细胞,诱导血管生成和炎症反应。

尽管目前艾滋病的发病率已降低,然而KS在相关疾病流行地区发病率仍然很高,目前KS的治疗方法主要包括放、化疗和高效抗反转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy, HAART),只有约50%的患者达到完全缓解。目前对KSHV诱导肿瘤发生的机制研究成果已应用于临床,潜伏病毒蛋白LANA已成为KS的决定性诊断标志物;靶向潜伏病毒蛋白及裂解病毒蛋白VEGF的药物目前正处于临床实验阶段,然而单点阻断VEGF通路治疗效果有限,将VEGF抑制剂与其他靶向药物联合可能有助于抗肿瘤治疗［32］。

2.4MCV和MCC MCV属于多瘤病毒科,是一种双链DNA病毒,它可以在大部分健康人皮肤上检测到,通常为无症状感染。MCC是一种罕见的侵袭性皮肤神经内分泌癌,其发病率为每年每10万人0.1～1.6例,具有高度侵袭性,致死率超过30%［33］。MCC可以分为 MCV+和MCV-病例,MCV-MCC细胞比MCV+MCC细胞表现出更多紫外线损伤相关基因突变。2008年Feng等［34］首次发现,80%的MCC患者可以在肿瘤皮肤组织中检测到MCV序列,而肿瘤患者的正常皮肤组织仅8%,非肿瘤患者仅16%。其中75%的MCV DNA整合到肿瘤细胞的单个位点,表明MCV感染和整合先于肿瘤细胞的克隆扩增,证明了其在MCC中有致病作用。

为证明维持MCC细胞需要致癌病毒蛋白,Houben等［35］在MCV+MCC细胞系中敲低了MCV T抗原的表达,所有MCV+MCC细胞系在T抗原敲低后都经历了生长停滞或细胞死亡,而MCV-细胞系的增殖不受影响,这证明了肿瘤的维持需要T抗原的表达,即大T抗原(large T ,LT)和小T抗原(small T ,ST)。LT和ST会被克隆整合到MCC基因组中,其中LT会发生截短突变,保留LXCXE基序而敲除解旋酶结构域,使整合进肿瘤基因组中的病毒丧失复制能力,从而使肿瘤细胞得以存活［36］。MCV LT的LXCXE 基序还可以结合并使RB1失活,进而释放和激活E2F,从而使细胞跨越过G1/S检验点而发生无序增殖和永生化［37］。

MCV+MCC 肿瘤也表达ST,且通常完整表达。MCV ST与MYC同源基因MYCL 形成复合物,并招募EP400染色质,形成ST-MYCL-EP400复合物［38］。MDM2是一种E3泛素连接酶,它特异性结合p53并促进其泛素化和随后被蛋白酶体降解。ST-MYCL-EP400 复合物增加了 MDM2的水平,从而降低p53的活性,从而抑制细胞凋亡,促进肿瘤增殖。除了MDM2,ST-MYCL-EP400 复合物增加了MDM4和CK1α的水平,它们协同激活MDM2的E3泛素连接酶活性,从而促进 p53 的降解及其功能丧失,导致细胞癌变。

目前关于MCV导致MCC尚有很多问题待进一步研究,包括确定病毒致癌的易感因素和确切机制。在临床方面,ST-MYCL-EP400复合物的下游靶标可以应用于靶向治疗的开发;此外,MCV T抗原抗体只存在于不到1%的健康个体中,而存在于52%MCC患者中,抗体滴度随时间下降的患者有97%的概率不复发;抗体滴度升高的患者有66%的复发概率［39］,因此T抗原抗体滴度可以用于跟踪疾病状态,判断疾病复发风险。

2.5HTLV-1与成人T细胞白血病/淋巴瘤 HTLV-1是逆转录病毒科Delta逆转录病毒属的成员,在人体内主要感染CD4+T细胞,全世界约有10～20万HTLV-1感染者,小于5%的感染者会发展为成人T细胞白血病/淋巴瘤(adult T cell leukemia/lymphoma, ATLL)［40］。上世纪80年代,来自美国和日本的研究人员均从ATLL细胞系中分离出来相同序列的逆转录病毒颗粒,即HTLV-1,他们发现HTLV-1逆转录形成的前病毒DNA会克隆整合入ATLL细胞的相同位点中,故证实了HTLV-1感染为ATLL的病因［41］。

Tax蛋白和HBZ蛋白(HTLV-1 basic zipper protein)为HTLV-1的两个关键病毒癌蛋白。Tax蛋白可以激活HTLV-1 5′长末端重复序列以促进病毒转录;可以激活NF-κB、AP1等信号通路从而促进T细胞生长,抑制细胞凋亡;还可以通过促进cyclin-D1表达和p53的功能影响细胞周期和细胞归巢修复机制,使受感染的T细胞存活［42］。然而同时Tax的免疫原性很强,可以触发体内细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)反应,进而介导受感染T细胞的免疫清除。最新研究表明,Tax表现为间歇性表达模式,可自发在表达和不表达之间切换,以便于在逃避免疫监视的同时促进受感染细胞持续存活［43］。HBZ是唯一在HTLV-1感染过程中持续表达的基因,它的表达可将受HTLV-1感染的细胞与未感染的CD4+T细胞区分开来。HBZ的关键作用是促进被感染细胞的存活,HBZ通过激活转录因子Jun D以及TGF-β信号通路,促进T细胞增殖［44］。HBZ的免疫原性远低于Tax,有助于HTLV-1在体内的免疫逃避［45］。Tax和HBZ在肿瘤发生发展的不同时期发挥作用,在HTLV-1感染初期,Tax可促进病毒转录及细胞转化,而在HTLV-1感染中后期,HBZ则维持肿瘤细胞增殖,二者协同促进ATLL的发生［42］。

ATLL目前主要治疗方法包括多药化疗、干扰素α联合齐多夫定、抗CCR4抗体莫加木珠单抗、来那度胺、异基因造血干细胞移植等,但ATLL预后不良,复发频繁,且针对惰性ATLL尚无有效疗法。来自日本的研究者已开发Tax多肽脉冲树突状细胞疫苗(Tax-DC),由自体树突状细胞及Tax多肽组成,可以激活Tax特异性CTL反应,可用于抗肿瘤治疗及预防。由于化疗会引起免疫抑制,故化疗不适用于惰性ATLL,而Tax-DC疫苗可尝试用于惰性ATLL的治疗。Tax-DC疫苗联合莫加木珠单抗和来那度胺可进一步增强Tax特异性CTL反应,可用于初始治疗后的维持缓解。此外,Tax-DC疫苗还可以应用于HTLV-1携带者,预防此类高危人群患ATLL［46］。

3 小结

病毒被认为是导致皮肤肿瘤的原因之一。在流行病学及分子机制方面均有证据表明,HPV和cSCC、EBV和皮肤淋巴瘤、KSHV和KS、MCV和MCC、HTLV-1和ATLL之间存在关联。然而,皮肤肿瘤是多种因素共同作用的最终结果,并且致瘤病毒通常存在于大部分人群中而不会引起疾病,因此,仍然没有足够的数据证明病毒与皮肤肿瘤的发展确切相关。病毒与皮肤肿瘤间的关系应该引起更广泛的重视,仍需进一步研究证实病毒与皮肤肿瘤之间的因果关联,探寻病毒导致皮肤肿瘤的可能分子机制,将有助于开发新的用于筛查、诊断、疾病监测的潜在标记物,以及预防、治疗病毒感染相关皮肤肿瘤的疫苗和药物。