灌溉与生物质炭对土壤硝化反硝化功能微生物的影响

2023-11-09刘杰云邱虎森张文正胡壮壮吕谋超王钰

农业环境科学学报 2023年10期

刘杰云，邱虎森，张文正，胡壮壮，吕谋超，王钰

（1.中国农业科学院农田灌溉研究所农业农村部节水灌溉工程重点实验室，河南新乡 453002；2.宿州学院环境与测绘工程学院，安徽宿州 234100；3.宿州市农业科学院，安徽宿州 234100）

硝化和反硝化作用是土壤氮循环中的重要过程，二者均受到土壤微生物的调控。硝化作用将在土壤中移动性较小的铵根离子转化为移动性较强的硝酸根离子，有利于补充根区氮素，便于植物吸收利用。氨氧化作用是土壤硝化作用的第一步，也是其限速步骤[1]。氨氧化作用主要由具有编码氨单加氧酶基因amoA的氨氧化微生物参与完成，包括氨氧化细菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）和氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA）。氨氧化细菌在中性或碱性及富氮环境中占主导地位，而氨氧化古菌则在酸性及养分含量较低的环境中占主导地位[2]。反硝化作用是在嫌气条件下，硝酸盐在反硝化微生物的作用下，还原为N2、N2O 或NO 的过程，又被称为脱氮作用，它是在由nar、nir、nor、nos等基因编码的一系列还原酶的作用下完成的。土壤硝化作用及反硝化作用受土壤水分、养分、氧气、pH、温度等的影响。

灌溉可通过改变土壤水分状况及理化性质、微生物数量及活性、土壤中气体扩散速率等影响土壤氮转化过程[3]。不同灌溉方式下土壤水分含量及分布有较大差异，因而其对土壤氮转化过程的影响差异也较大[4-5]。滴灌采用滴灌带，通过少量多次灌水，在不破坏土壤结构条件下，将水肥精确施到根系周围，为根际创造良好的生长条件。喷灌灌水过程类似天然降雨，水分以微小液滴的形式逐渐且均匀地降落并渗入土壤，减少了表层土壤紧实度和板结，从而提高了土壤孔隙度和通气性。微喷灌是通过微喷带将水喷射到空中，散成细小雾滴，喷洒到根区的一种节水灌溉技术。节水灌溉方式因其较高的水分利用效率，可有效降低灌水量。土壤水分含量的改变势必影响土壤微生物群落及功能菌群的作用。如充足的水分条件可以提高微生物的丰富度和均匀度[6]；与AOB相比，干燥的土壤环境更有利于AOA丰度的提高[7]。土壤水分含量的增加会促进微生物反硝化过程[8]，在降低土壤铵态氮含量的同时会增加硝态氮的迁移与淋失风险。韩冰等[9]的研究结果表明滴灌和渗灌较沟灌降低了土壤反硝化细菌丰度，进而降低N2O 排放。不同灌溉方式是否可通过改变土壤湿润体的大小，影响土壤氮形态，尤其是无机氮的形态以及其微生物过程，有待于进一步研究。

生物质炭作为一种碱性、多孔性、高比表面积和含有大量表面电荷及高电荷密度的材料，施入土壤后能够在改变土壤pH、吸附固定土壤无机离子及各种极性和非极性化合物的同时，一定程度上改变土壤结构和微环境，如土壤通气性等[10]，从而对土壤硝化及反硝化过程产生影响。Xiao 等[11]的研究发现，生物质炭通过改善土壤孔隙结构和通气状况，增加溶氧量来改变AOA 和AOB 的活性，从而促进土壤硝化作用。Song 等[12]通过12 周的培养试验发现，4～6 周内生物质炭对土壤氨氮的吸附作用促进了氨氧化作用。生物质炭可促进土壤pH 的升高和土壤硝化速率的提升，有利于提高NO-3-N 含量[13-14]。王晓辉等[15]将稻秆生物质炭施入到酸性土壤中，结果发现，土壤中AOB 的丰度和pH 均增加，进而增加了土壤的硝化潜势。生物质炭带入的电子供体，可降低NO-3-N 含量，促进N2O 排放，而对铵根离子和硝酸根离子的吸附作用和生物质炭的强碱性引起的氨挥发却不利于反硝化过程的进行[16]。

目前，灌溉方式与生物质炭互作对土壤氮转化的影响研究主要集中在氮形态、氮素损失、氮素利用率等方面。Wang 等[17]的研究表明，与畦灌相比，膜下滴灌可降低土壤矿质态氮含量及N2O 排放，在各灌溉方式下（畦灌、地表滴灌、膜下滴灌），添加生物质炭均可降低土壤N2O 排放和NH3挥发，增加土壤NO-3-N 含量及植物对氮素的吸收利用。节水灌溉模式与生物质炭互作可降低土壤NO-3-N的淋溶损失，与漫灌、畦灌相比，喷灌条件下，土壤淋洗液中NO-3-N分别降低了37.51%和34.29%，生物质炭与漫灌、畦灌互作对NO-3-N 淋失均没有影响，但喷灌条件下添加生物质炭可显著降低NO-3-N 淋失[18]。此外，灌溉和生物质炭均可通过影响土壤微生物的活动而影响土壤矿质态氮的迁移转化。蔡九茂等[19]的研究发现，参与土壤矿质态氮转化的关键功能菌群不受滴灌方式（地表滴灌和插入式滴灌）的影响，但受生物质炭的调控，生物质炭削弱了地表滴灌与插入式滴灌非根际土壤硝态氮的差异，促进了同种滴灌方式下非根际土壤NO-3-N的积累。综上所述，不同灌溉方式及生物质炭均可影响矿质态氮的迁移转化，但不同灌溉方式与生物质炭互作如何影响土壤硝化及反硝化微生物，进而影响土壤矿质态氮的转化，目前尚不清楚。基于此，本研究采用田间小区试验，通过在4 种不同灌溉方式下（常规地表漫灌、滴灌、喷灌和微喷灌）添加不同量生物质炭（0、10、20 t·hm-2），研究灌溉方式与生物质炭互作对土壤硝化及反硝化作用相关功能微生物的影响，拟探明灌溉方式与生物质炭互作对土壤矿质态氮转化影响的微生物学机制，以期为华北地区节水灌溉方式及生物质炭的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试土壤与生物质炭

试验小区位于河南省新乡县七里营镇中国农业科学院新乡综合试验基地（35°08′N，113°45′E），海拔73.2 m。本区域多年平均气温为14.1 ℃，多年平均降水量为582 mm，且多集中在7—9 月（占全年降水量的70%～80%），无霜期为210 d，多年平均蒸发量为2 000 mm，光热资源丰富，农作物种植制度以冬小麦-夏玉米轮作为主。供试土壤类型为潮土，土壤质地为粉壤土。生物质炭产自河南商丘三利新能源有限责任公司，为花生壳在500 ℃左右条件下制成，为粉末状。供试土壤和生物质炭的基本理化性质见表1。

表1 供试土壤（0～20 cm）及生物质炭基本理化性质Table 1 Basic properties of soil and biochar

1.2 试验设计

本试验小区面积为49 m2（7 m×7 m），小区之间设置2 m 宽保护行。选取4 种灌溉方式：传统漫灌（F）、滴灌（D）、喷灌（S）和微喷灌（I）。因本研究土壤为碱性土壤，为避免生物质炭对碱性土壤的pH影响过大，每种灌溉方式设置3 个较低量的生物质炭处理：①无生物质炭添加（CK）；②添加10 t·hm-2生物质炭（LB）；③添加20 t·hm-2生物质炭（HB）。生物质炭在2018年10 月冬小麦种植前添加，具体施用方法：前茬玉米收获后，采用移动式喷灌方式灌水，待土壤湿度适宜后，用旋耕机旋耕，为保证灌水均匀度，再用激光平地仪平整土地。人工划定小区后，按照不同处理将基肥、生物质炭先后人工均匀撒施入土壤，然后翻耕（为避免翻耕对不同生物质炭处理造成影响，按照生物质炭处理纵向直线翻耕），以免灌水时出现生物质炭漂浮损失。翻耕后人工起田埂（高20 cm 左右），起埂所用土壤来自保护行。灌水时，虽然有少量生物质炭漂浮现象，但由于田埂的保护，避免了不同处理间的影响及生物质炭的损失。每个处理3 个重复，小区分布见图1。

图1 田间小区分布示意图Figure 1 The distribution diagram of field plots

供试冬小麦品种为矮抗207，2018 年10 月11 日种植，行间距20 cm，2019 年6 月8 日收获，小麦产量等作物生长情况详见文献[20]。氮肥施用量按照当地常规施肥，总施氮量为202.5 kg·hm-2，分2 次人工撒施入土壤，小麦播种前施用750 kg·hm-2含钾二铵复合肥（N、P2O5、K2O 质量比为15∶39∶8）作为基肥（以N 计为112.5 kg·hm-2），返青期施用600 kg·hm-2尿素作为追肥（以N 计为90 kg·hm-2），施肥后灌水。灌溉用水来自地下水，符合灌溉用水水质标准，根据作物需水规律灌水4 次：2018 年11 月12 日采用移动式喷灌方式灌越冬水；2019 年2 月25 日、4 月17 日、5 月20日分别进行灌水，漫灌为灌足水，每次灌水定额约为90 mm（每次每个小区灌水量为4.4 t），滴灌、喷灌、微喷灌根据当地降水量及作物需水量来确定，设定每次灌水定额为45 mm（每次每个小区灌水量为2.2 t）。每个小区一个水表和阀门，单独控制。整个小麦生育期漫灌、滴灌、喷灌和微喷灌的总灌水量分别为360、225、225 mm 和225 mm。农田病虫害防治等田间管理均采用当地常规管理模式：12 月下旬喷施除草剂，4 月初及4 月底分别喷施防治病虫害（蚜虫、白粉病、黄锈病）药剂1 次，同时添加磷酸二氢钾增加作物营养。

1.3 土壤样品采集与测定

于冬小麦拔节期（2019 年4 月2 日）采集土壤样品。在每个小区内按照“S”形取5个点，采集0～20 cm耕层土壤，混合后作为1 个样品。将土壤样品中的根系、石子等挑出，并将其充分混匀，实验室4 ℃保存。另取其中200 g 左右样品迅速用锡箔纸包好，放入灭菌的袋子，投入到液氮中，运送至实验室，-80 ℃冰箱保存备用。

取50 mL 的0.5 mol·L-1K2SO4加到10 g 土中，振荡1 h后过滤。滤液用连续流动分析仪（AA3，德国）测定土壤中的-N 和-N 含量；矿质态氮（Nmin）为-N 和-N 含量之和。土壤pH 值测定：蒸馏水（土水比为1∶2.5）浸提30 min，用Mettler-toledo320 pH 计测定。

1.4 硝化/反硝化微生物功能基因丰度测定

土壤中微生物的总DNA用DNA提取试剂盒（PowerSoilTMDNA Isolation Kit，Mo Bio Laboratories Inc.，CA）提取，使用Nanodrop2000核酸分析仪测定DNA浓度和纯度后，将提取的总DNA置于-20 ℃保存。

AOA-amoA、AOB-amoA、nirK和nosZ基因标准曲线的构建参见Chen 等[21]的方法：首先构建克隆文库，然后选择阳性克隆子，吸取10µL菌液于5 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃摇床培养10 h，提取重组质粒，测量OD 值，换算成拷贝数。10 倍梯度稀释作为标准曲线的模板。标准曲线的范围为102～108。拷贝数计算：拷贝数（µL）=6.02×1023×质粒浓度（ng·µL-1）×10-9/（插入片段长度×660）。

实时荧光定量PCR（qPCR）分析：所用仪器为ABI 7500 荧光定量PCR 仪（Applied Biosystem）。AOA-amoA、AOB-amoA、nirK和nosZ基因的反应体系为：1µL DNA 模板，0.8µL 上游引物（Arch-amoAF[21]，AmoA-1F，nirK-FlaCu[22]，nosZ-1126F[23]），0.8µL 下游引物（Arch-amoAR，AmoA-2R，nirK-R3Cu，nosZ-1381R），10µL 2X Taq Plus Master Mix，补充ddH2O 至20 µL。AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ的扩增程序相同：95 ℃预变性5 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，35 个循环；72 ℃1 min。nirK扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，35个循环；72 ℃1 min。

1.5 数据分析

运用SPSS 20.0 分析软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA，置信水平为95%）和双因素方差分析；利用R 语言分析软件分析土壤性质与功能基因丰度之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 灌溉方式及生物质炭添加对土壤性质的影响

由双因素方差分析的结果（表2）可知，灌溉方式可显著影响土壤-N、-N、Nmin和pH（P＜0.01），生物质炭添加可显著影响土壤-N（P＜0.01）、Nmin（P＜0.05）和pH（P＜0.01），但对土壤-N 含量影响不显著（P＞0.05）。灌溉方式与生物质炭互作可显著影响土壤-N（P＜0.01）、Nmin（P＜0.01）和pH（P＜0.05），但对土壤-N含量影响不显著（P＞0.05）。

表2 灌溉方式及生物质炭对土壤性质影响的双因素方差分析Table 2 Two-way ANOVA analysis for the effects of irrigation types and biochar on soil properties

由图2 可知，无论添加生物质炭与否，D、S 和I 处理均较F处理显著降低了土壤-N 含量（P＜0.05）。在F 及I 处理条件下，添加生物质炭对土壤-N 含量无显著影响（P＞0.05）。与D+CK 处理相比，D+LB和D+HB 处理显著降低了土壤-N 含量（P＜0.05）。在S处理条件下，仅S+HB处理较S+CK处理显著降低了土壤-N 含量（P＜0.05）。在CK 处理中，D+CK较I+CK 显著增加了土壤-N 含量（P＜0.05），其他处理之间差异不显著（P＞0.05）。在LB 处理中，D、S与I 处理均较F 处理显著增加了土壤-N 含量（P＜0.05），且S处理显著高于D 和I处理（P＜0.05）。在HB处理中，I 较F、D 和S 处理显著增加了土壤-N 含量（P＜0.05）。F 处理条件下，添加生物质炭对土壤-N 含量影响不显著（P＞0.05）。D+HB 较D+CK 处理显著降低了土壤-N 含量（P＜0.05）。在S 处理条件下，各生物质炭处理之间差异均显著（P＜0.05），其土壤-N 含量从大到小依次为S+LB＞S+CK＞S+HB。土壤Nmin含量变化与-N 含量变化较一致，即无论添加生物质炭与否，D、S 和I 处理均较F 处理显著降低了土壤Nmin 含量（S+LB 除外，P＜0.05）。在F 及I 处理条件下，添加生物质炭对土壤Nmin 含量无显著影响（P＞0.05）。D处理条件下，D+LC和D+HC处理较D+CK 处理显著降低了土壤Nmin 含量（P＜0.05）。S处理条件下，S+HB较S+CK处理显著降低了土壤Nmin 含量（P＜0.05）。在CK 和HB 处理中，S 和I处理较F和D处理显著降低了土壤pH（P＜0.05），而在LB 处理中，各灌溉方式之间差异不显著（P＞0.05）。在S及I 处理条件下，生物质炭添加对土壤pH 影响不显著。F 处理条件下，各生物质炭处理之间差异显著（P＜0.05），其大小顺序表现为F+HB＞F+CK＞F+LB。D 处理条件下，D+HB 处理的土壤pH 显著高于D+CK和D+LB处理（P＜0.05）。

图2 灌溉方式及生物质炭添加对土壤性质的影响Figure 2 Effects of irrigation types and biochar amendment on soil properties

2.2 灌溉方式及生物质炭添加对土壤硝化/反硝化功能基因丰度的影响

由双因素方差分析结果（表3）可知，灌溉方式可影响土壤AOA-amoA、AOB-amoA、nirK和nosZ的基因丰度（P＜0.01）。生物质炭添加量可显著影响土壤AOB-amoA、nirK和nosZ的基因丰度（P＜0.01），但灌溉方式与生物质炭互作仅对土壤nosZ基因丰度有显著影响（P＜0.01）。

表3 灌溉方式及生物质炭对土壤硝化/反硝化功能基因丰度影响的双因素方差分析Table 3 Two-way ANOVA analysis for the effects of irrigation types and biochar on the abundances of nitrification and denitrification functional genes

灌溉方式及生物质炭对土壤硝化/反硝化功能基因丰度的影响见图3。在CK 处理中，各灌溉方式的土壤AOA-amoA基因丰度之间均有显著差异（除S 处理外，P＜0.05），其大小依次为I＞S＞D＞F。在LB 和HB处理中，I处理较F、D 和S处理显著增加了土壤AOAamoA基因丰度（P＜0.05）。F、D 及S 处理条件下，添加生物质炭均未显著影响土壤AOA-amoA基因丰度（P＞0.05），但在I 处理条件下，添加生物质炭较CK 处理显著增加了土壤AOA-amoA基因丰度（P＜0.05）。无论添加生物质炭与否，D、S、I 处理均较F 处理增加了土壤AOB-amoA基因丰度，且大小依次为I＞S＞D＞F。具体表现为：在CK 处理中，仅I 处理较F 处理显著增加了土壤AOB-amoA基因丰度（P＜0.05）；在LB 处理中，S和I处理均显著高于F处理（P＜0.05）；在HB处理中，各灌溉方式之间差异均显著（P＜0.05）。F 和D 处理条件下，添加生物质炭对土壤AOB-amoA基因丰度无显著影响（P＞0.05），但在S和I处理条件下，LB处理显著增加了土壤AOB-amoA基因丰度（P＜0.05）。在CK 和LB 处理中，各灌溉方式下土壤nirK基因丰度均无显著差异（P＞0.05），但在HB 处理中，I 处理条件下土壤nirK基因丰度显著高于D 和F 处理（P＜0.05）。D和F 处理条件下，添加生物质炭对土壤nirK基因丰度无显著影响（P＞0.05），但在S 和I 处理条件下，HB处理较CK 和LB 处理显著增加了土壤nirK基因丰度（P＜0.05）。在CK 处理中，D、S 和I 处理均较F 处理显著降低了土壤nosZ基因丰度（P＜0.05），但D、S 和I 处理之间无显著差异（P＞0.05）。在LB和HB处理中，各灌溉方式的土壤nosZ基因丰度差异均显著（P＜0.05），其大小顺序分别为F＞D＞I＞S 和D＞F＞I＞S。在F、D 和I 处理条件下，添加生物质炭显著增加了土壤nosZ基因丰度（P＜0.05），但在S 处理条件下，与CK 相比，LB 显著降低了土壤nosZ基因丰度（P＜0.05），但HB显著增加了土壤nosZ基因丰度（P＜0.05）。

图3 灌溉方式及生物质炭添加对土壤硝化/反硝化功能基因丰度的影响Figure 3 Effects of irrigation types and biochar amendment on soil nitrification and denitrification functional genes abundances

2.3 土壤性质与硝化/反硝化功能基因丰度的关系

由相关性分析结果（图4）可知，土壤AOA-amoA基因丰度与土壤-N 含量、pH 呈极显著负相关（P＜0.01），与Nmin 含量呈显著负相关（P＜0.05），但与-N含量呈显著正相关（P＜0.05）。土壤AOB-amoA基因丰度与土壤-N 含量、Nmin 含量及pH 呈极显著负相关（P＜0.01），与-N 含量及AOA-amoA基因丰度呈极显著正相关（P＜0.01）。土壤nirK基因丰度与土壤AOA-amoA基因丰度呈极显著正相关（P＜0.01），与AOB-amoA基因丰度呈显著正相关（P＜0.05）。土壤nosZ基因丰度与土壤-N 含量和AOB-amoA基因丰度呈显著负相关（P＜0.05），与土壤pH呈极显著正相关（P＜0.01）。

图4 土壤性质与参与土壤硝化/反硝化作用关键功能基因丰度的相关性Figure 4 The correlations among soil properties and the abundances of functional genes involving soil nitrification and denitrification

3 讨论

3.1 灌溉方式及生物质炭对土壤硝化功能微生物的影响

硝化反应是土壤氮循环中的重要过程，受到土壤微生物的调控。水分是影响土壤微生物活动的重要因子，而灌溉方式的改变及生物质炭添加带来土壤含水率及其分布的显著变化，势必会对土壤硝化作用产生影响。

本研究中，滴灌、喷灌和微喷灌等节水灌溉方式的灌水量约为常规地表漫灌的50%，因此，灌水后，滴灌、喷灌和微喷灌条件下的土壤孔隙含水率低于漫灌，因此会产生有利于硝化反应而抑制反硝化反应的环境，从而加速了硝化微生物对土壤-N 的消耗，产生更多的-N。在本研究中，AOA-amoA、AOBamoA基因丰度均与土壤-N 含量呈显著负相关，而与土壤-N 含量呈显著正相关（图4），说明与常规漫灌相比，节水灌溉方式可通过促进土壤硝化微生物活动，调节土壤矿质态氮形态之间的转化。

与漫灌相比，滴灌可增加土壤硝化微生物AOAamoA、AOB-amoA的基因丰度（图3），促进土壤硝化作用的进行。滴灌条件下滴头滴水量小，水滴缓慢进入土壤，在毛管力和重力作用下分布于作物根系周围[24]，且在此区域中硝化作用高于反硝化作用[25]，因而可增加土壤AOA-amoA、AOB-amoA的基因丰度。此外，与漫灌相比，滴灌灌水强度较低，土壤孔隙水流速较慢，土壤结构破坏程度较小，因此可降低由于灌溉而造成的土壤密实，使土壤保持相对疏松和较高的通透性[24]，有利于硝化微生物的生长。同时，疏松的土壤结构有利于作物根系活力的提高[26]，促进根系向土壤中释放含碳、氮等物质的分泌物，为硝化反应及反硝化反应提供底物，从而促进硝化微生物的生长及活性的提高。但在漫灌和滴灌条件下，添加生物质炭并没有显著影响土壤硝化微生物的基因丰度，这可能与生物质炭添加在一定程度上降低了土壤NO-3-N 含量有关（图2），其内在机制需要进一步研究。

喷灌较漫灌显著增加了土壤硝化微生物AOAamoA、AOB-amoA的基因丰度（图3），表明与常规漫灌相比，喷灌可促进土壤硝化反应。喷灌过程类似天然降雨，水分以微小液滴的形式均匀地降落并渗入土壤，减少了表层土壤的板结，减小了土壤紧实度，从而使土壤孔隙度和通透性均高于漫灌[27-28]，有利于提高硝化微生物的活动。微喷灌是在滴灌和喷灌的基础上发展而来的一种新型节水灌溉方式，兼具二者的优点，它采用微喷带将水均匀地喷洒到田间，灌溉均匀度较高[29]，同时还可降低土壤容重[30]。在本研究中，无论添加生物质炭与否，土壤AOA-amoA、AOBamoA的基因丰度均表现为微喷灌＞喷灌＞滴灌＞漫灌，表明微喷灌较其他灌溉方式更能有效促进土壤硝化作用。在喷灌和微喷灌条件下，生物质炭对硝化微生物的促进作用较为明显。AOB 在中性或碱性及富氮环境中占主导地位，而AOA 则在酸性及养分含量较低的环境中占主导地位[2]。有研究认为，当土壤氨氧化功能微生物中AOA 占主导地位时，生物质炭会抑制土壤氨氧化作用；但当AOB 为主要功能菌群时，生物质炭则会促进土壤氨氧化作用[31]。本研究土壤偏碱性（表1），AOB 占主导地位，生物质炭添加可促进土壤氨氧化作用。王晓辉等[15]的研究表明，生物质炭的孔隙结构及水肥吸附能力，可为好氧的AOB 和AOA 提供良好的栖息环境，故而促进其生长繁殖。喷灌及微喷灌条件下，添加生物质炭可进一步改善土壤结构，增加土壤通气性，有效促进氨氧化微生物的生长。化能自养型的氨氧化微生物AOA-amoA、AOB-amoA的基因丰度、组成及结构受土壤氮有效性的影响[32-33]。-N 是氨氧化过程的底物，其含量大小可直接影响氨氧化微生物的活动。但在本研究中，各灌溉方式下，生物质炭均在一定程度上降低了-N 含量（图2），这也说明生物质炭促进了氨氧化作用的进行，使土壤-N 向-N 转化，这与蔡久茂等[19]的研究结果一致。

3.2 灌溉方式及生物质炭对土壤反硝化功能微生物的影响

与漫灌相比，滴灌、喷灌及微喷灌等节水灌溉方式下，土壤水分含量较低，不利于厌氧的反硝化微生物生长。在本研究中，与漫灌相比，无论添加生物质炭与否，滴灌、喷灌、微喷灌均降低了土壤nosZ基因丰度，即抑制了土壤N2O向N2的转化。然而，滴灌、喷灌、微喷灌条件下，反硝化反应被抑制，土壤硝酸盐向亚硝酸盐、NO 及N2O 转化降低，因而，节水灌溉条件未必会造成N2O 排放增加。但在20 t·hm-2生物质炭处理中，滴灌却较漫灌显著增加了nosZ基因丰度，这可能是由于高量生物质炭可作为电子穿梭体，促进土壤中电子向反硝化微生物转移[34-35]，从而增加了nosZ基因的丰度和活性，促进了N2O 向N2的转化[36]。在各灌溉方式下，与不添加生物质炭处理相比，生物质炭（尤其是高量生物质炭添加）增加了土壤nosZ基因丰度（S+LB 处理除外），这可能与生物质炭为微生物生长提供了碳源有关。Xiao 等[11]通过Meta 分析研究发现，生物质炭添加增加了narG、nirS、nirK和nosZ的基因丰度，且作物残体（如秸秆）等原料制备的生物质炭对反硝化基因的促进作用更明显，尤其是nirK和nosZ基因，且认为这是由于这类生物质炭中溶解性有机碳的含量比木材等制备的生物质炭高，这些可利用性有机碳驱动了土壤微生物中碳和氮的周转，进而刺激微生物的生长，促进反硝化微生物活性的提高。本研究采用的生物质炭原料为花生壳，将其添加到土壤中可能会提高土壤可溶性有机碳含量[37]，进而促进土壤反硝化微生物的生长。此外，pH 是影响土壤微生物活动的关键因子[38]，在漫灌和滴灌条件下，高量生物质炭添加增加了土壤pH，促进了nosZ基因丰度的增加。生物质炭的石灰效应可为土壤微生物生长提供适宜的环境，进而提高反硝化功能微生物的丰度[39]。

微喷灌提高了灌溉水在土壤中的分布均匀系数，创造了均衡适宜的土壤水分条件，这不仅有利于硝化作用的进行，同时，由于反硝化过程由兼性厌氧细菌主导，微喷灌还可在一定程度上促进反硝化反应。微喷灌条件下20 t·hm-2生物质炭处理的nirK基因丰度显著高于其他灌溉方式，这可能是由于在高量生物质炭添加条件下，微喷灌的土壤-N 含量显著高于其他灌溉方式（图2），这与党建友等[40]的研究结果一致。在好氧条件下，氧气含量是反硝化作用的主要限制因素，但在厌氧条件下-N 含量则是反硝化作用的限制因素[41]。土壤-N 的增加为反硝化反应提供了底物，可促进反硝化作用，而nirK基因编码的亚硝酸还原酶是反硝化反应的限速酶，因此，微喷灌较其他灌溉方式可显著提高土壤nirK基因丰度。且微喷灌条件下，生物质炭添加显著增加了土壤NO-3-N含量，进而提高了nirK基因丰度，进一步促进了反硝化作用。