高效液相色谱法测定血液透析器中聚乙烯吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮溶出量

2023-11-09陈华燕黄麒谕徐苏华

化学分析计量 2023年10期

陈华燕，黄麒谕，徐苏华

（广东省医疗器械质量监督检验所，国家药品监督管理局体外循环器械重点实验室，广州市生物医用血液净化材料研究与开发重点实验室，广州 510663）

血液透析器是血液与透析液进行交换的管路与容器，是血液净化治疗所需的重要医疗器械。血液透析器外壳多使用聚碳酸酯树脂，中空纤维膜则常用聚砜膜、聚醚砜膜、聚酰胺膜等材料[1]。聚砜型中空纤维膜，是以聚砜为成膜聚合物，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为致孔剂，N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)为溶剂，采用浸没沉淀相转换法制备而成[2]。水溶性PVP 的加入，一方面有利于膜丝致孔时相分离[3]，保证制备的纤维膜丝有理想的孔径；另一方面PVP 能有效提高纤维膜丝的亲水性，从而改善膜材的血液相容性。虽然PVP在生理上是惰性的，它不刺激皮肤和眼睛，也不会使皮肤过敏，但在第三类医疗器械透析器中的溶出限量应该予以监控[4]。DMAC 作为一种重要的工业溶剂，用于中空纤维血液透析膜的合成中，一般通过呼吸道或皮肤进入机体，对神经系统、肝脏、肾脏和心脏等多器官造成损害[5-6]。相关研究表明，NMP能导致出生缺陷和潜在的生殖毒性，对人体消化系统和中枢系统也具有刺激作用[7-10]。由于制备工艺的特征，PVP、DMAC 和NMP 会不可避免地残留在纤维膜中，随血液透析过程直接进入血液中，对人体造成损害，因此对这三种物质的溶出量进行测定监控很有必要。

PVP 是以上三种物质中相对分子质量较大的，可以借助大分子常用的分离手段凝胶渗透色谱法[11-12]分离，或衍生成有色物质后利用紫外分光光度法[13-15]进行含量测定。由于以上两种方法灵敏度不高，方法条件复杂，徐萍华等[4]建立了高效液相色谱法测定隐形眼镜护理液中PVP 含量。DMAC 与水混溶，沸点较高，较难用溶剂或其它方法提取，一般采取气相色谱法测定[16-17]，但利用直接进样方式测定时，存在色谱峰形不佳、色谱柱易受污染和损坏、需要有机溶剂稀释等不足。气相色谱-质谱联用(GC-MS)法则存在样品处理过程复杂等问题[18]，在纺织品和环境检测中有采用液相色谱法测定DMAC 的文献报道[10,19]，液相色谱法则可以很好的解决上述两种方法存在的问题。目前尚无高效液相色谱法测定血液透析器中PVP 和DMAC 的报道。NMP 的测定方法主要有气相色谱-质谱联用(GCMS)法[20]、液相色谱-质谱联用(LC-MS)法[21]，高效液相色谱(HPLC)法[10,22]等。目前尚无利用高效液相色谱法同时测定血液透析器中PVP、DMAC、NMP 三种残留物的报道。

笔者以超纯水作为浸提溶剂，模拟临床使用条件，浸提出血液透析浓缩器中的PVP、DMAC 和NMP，并采用高效液相色谱法测定其含量。该方法制样简单，灵敏度高，准确度好，适用于对血液透析器中上述三种溶出物的风险评估。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：LC-20AT 型，配光电二极管阵列紫外可见光检测器(SPD-M20A)，岛津企业管理(中国)有限公司。

滚压泵：JHBP-200B 型，广州市暨华医疗器械有限公司。

数显电子恒温水浴锅：BL810C型，雅马拓科技贸易(上海)有限公司。

电子天平：MSA225S-1CE-DU 型，感量为0.01 mg，赛多利斯(上海)贸易有限公司。

PVP对照品：质量分数大于97%，中国食品药品检定研究院。

DMAC、NMP 对照品，质量分数均大于99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

乙腈：色谱纯，德国默克公司。

血液透析器样品：样品1 为中空纤维血液透析器，样品2为一次性使用空心纤维血液透析器，膜材质均为聚醚砜膜。

实验室用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Inertsil® ODS-SP柱[250 mm×4.6 mm，5 μm 岛津企业管理(中国)有限公司]；检测波长：205 nm；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL；流动相：乙腈-水溶液(体积比为5∶95)；洗脱方式：等度洗脱；流动相流量：1.0 mL/min。

1.3 实验步骤

1.3.1 系列混合对照品工作溶液配制

用分析天平分别精密称量100 mg PVP、20 mg DMAC、20 mg NMP，混合后用水溶解并定容至200 mL，摇匀，配制成混合对照品溶液。用水逐级稀释混合对照品溶液，配制成系列混合对照品工作溶液，其中PVP 的质量浓度分别为PVP 5.0、10.0、30.0、60.0、100.0 μg/mL，DMAC 和NMP 的质量浓度均分别为0.2、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL。

1.3.2 样品溶液制备

参考临床中血液透析器的使用过程，取一套管路与透析器连接，取500 mL 水作为浸提溶剂，用恒流泵于(37±1) ℃下使溶剂以200 mL/min 的流量循环冲洗血室6 h，同时用水充满透析液室，循环结束后，把血室和透析液室内的溶液全部吹出，收集全部液体，冷却至室温25 ℃，作为样品溶液。

取同体积水，不装血液透析器，同法制备空白溶液。

血液透析器浸提示意图如图1所示。

图1 血液透析器浸提示意图

1.3.3 测定方法

以0.45 μm膜过滤样品溶液和系列混合对照品工作溶液，分别取20 μL注入液相色谱仪测定，利用色谱峰面积标准曲线法计算样品中PVP、DMAC、NMP的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择

PVP、DMAC、NMP 的紫外最大吸收波长分别为220、205、200 nm，最大吸收波长相差不多且有浮动范围，因此选择205 nm作为检测波长。乙腈和甲醇均为常用的液相色谱流动相，甲醇在此吸收波长内有紫外吸收，干扰测定，故选择乙腈作为流动相，能够避免此种干扰。PVP、DMAC、NMP 均为极性物质，参考文献[2]、[4]的流动相配比，选择乙腈-水(体积比为5∶95)为流动相。

2.2 浸提条件选择

PVP、DMAC、NMP 均易溶于水，选择水作为浸提溶剂即环保又能避免其它有机溶剂溶出的干扰，所获浸提液可直接进样，方便快捷，易于操作。血液透析器的临床使用时间最长可达6 小时，因此选择循环时间为6 小时。根据临床使用时人体的体温，选择循环温度为(37±1) ℃。

2.3 专属性试验

分别取空白溶液、混合对照品溶液和样品溶液，在1.2色谱条件下进行测定，色谱图如图2所示。结果表明，PVP、DMAC、NMP 色谱保留时间分别为5.211、6.490、7.738 min，理论塔板数分别为13 852、16 098、17 065，分离度分别为8.052、6.700、5.660，目标物色谱峰与基质峰无干扰，可用于准确定量，方法专属性良好。

图2 空白溶液、混合对照品溶液及样品溶液色谱图

2.4 线性方程与检出限

按照1.2 色谱条件分别测定系列混合对照品工作溶液，以各组分色谱峰面积(y)为纵坐标，对照品质量浓度(x，μg/mL)为横坐标进行线性回归，计算得PVP、DMAC、NMP 的线性回归方程分别为y=466.173x+554.707，y=8 755.9x+1 436.21，y=61 480.5x+674.819，线性相关系数分别为0.999 7、0.999 9、0.999 9。结果表明，PVP、DMAC、NMP 的质量浓度分别在5.0～100.0、0.2～20.0、0.2～20.0 μg/mL 范围内与色谱峰面积线性关系良好。

取PVP、DMAC、NMP混合对照品溶液，按要求用水等比稀释，在1.2色谱条件下测定低浓度混合对照品溶液，以信噪比大于等于3 对应的质量浓度作为方法检出限，得PVP、DMAC、NMP的检出限分别为1.461、0.011、0.019 μg/mL。

2.5 加标回收与精密度试验

分别取样品1、2浸提液各6份，共12份，以样品浸提液作为基底，分别加入适量的混合对照品溶液，制备成样品加标溶液，在1.2色谱条件下分别进行测定，计算平均回收率和测定结果的相对标准偏差，结果列于表1。

表1 加标回收与精密度试验结果

根据中华人民共和国药典(2020年版)9101分析方法验证指导原则，当样品质量浓度为10 μg/mL时，回收率应在85%～115%范围内，测定结果的相对标准偏差应不大于5%；当样品质量浓度为1 μg/mL 时，回收率应在75%～120%范围内，测定结果的相对标准偏差应不大于5%。由表1可知，两种样品中PVP 的回收率分别为103.99%、102.69%，测定结果的相对标准偏差分别为0.67、0.23；DMAC回收率分别为99.83%、95.13%，测定结果的相对标准偏差分别为0.08、0.08；NMP 回收率分别为98.35%、100.05%，测定结果的相对标准偏差分别为0.14、0.10，均符合中国药典的相关要求。