针刺对脑梗死大鼠骨骼肌vimentin、desmin基因表达的影响*

杨光至,刘梅芳,施 静△,张如意,冯斯峰,徐连杰,赵晓庆,王 敏,王嘉辉

(1.云南省中医医院,云南 昆明 650021;2.云南中医药大学,云南 昆明 650500)

脑梗死已成为威胁人类健康的重大疾病[1],脑梗死导致的上运动神经元损害表现多样,偏身骨骼肌肌力减弱是脑梗死患者骨骼肌的变化之一,在骨骼肌收缩过程中,Vmentin及desmin在维持肌肉细胞的骨架及细胞骨架的完整程度方面亦有一定作用。有研究运用无标记质谱联用比较免疫印迹技术,能够在肌肉受损及肌肉的轻度退化中的对比鉴定出vimentin等蛋白的显著改变[2],对研究小鼠肌肉收缩功能恢复与Vmentin的关系提供了佐证。desmin为中等径细胞骨架纤维,对细胞结构的支撑、细胞形状的决定及细胞机械强度的赋予等有重要作用[3]。高张力的机械牵拉会使细胞骨架的正常结构受到影响,进而造成肌肉收缩蛋白的结构破坏[4-6]。故在本研究中选取以上2个基因观察针刺介入治疗后mRNA的表达情况。本实验在建立脑梗死大鼠模型的基础上,运用qRT-PCR检测法,观察针刺对脑梗死大鼠不同骨骼肌中vimentin及desmin基因的表达,以期进一步探讨针刺治疗脑梗死的机制。

1 资料与方法

1.1 动物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重120 g,清洁级,共100只,由浙江省实验动物中心提供,并在本中心完成动物实验,大鼠生产许可证:SCXK(浙)2014-0001;大鼠使用许可证:SYXK(浙)2014-0008,实验前适应性喂养1周,饲养于温度18～26℃、湿度55%的环境中,自然光照。对动物的各项处理方式均按当地动物管理委员会相关伦理学规定进行。

1.2 主要试剂 Trizol柱纯化总RNA试剂盒(simgen)、Fast 1st strand cDNA Synthesis Kit(with gDNase)(simgen)、2×SYBR Green PCR Mix(simgen)、50×ROX Reference Dye(simgen)。

1.3 主要仪器 水浴锅(XMTD-6000,上海宜昌仪器纱筛厂);离心机(5452,德国eppendorf股份公司);ABI PRISM®7000荧光PCR仪(7000,美国ABI公司);漩涡振荡仪(XH-C,金坛市医疗仪器厂)。

1.4 模型制备 采用孟宜良的线拴法制作大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型[7],造模后的动物在自然苏醒后,参照Zea-Longa的5级评分标准对其障碍进行评分[8],筛选合格模型进行实验。

1.5 动物分组与处理 按随机数字表法分为:A组(头部穴位组)、B组(躯体穴位组)、C组(头部+躯体穴位组)、D组(模型组)、E组(空白组),每组20只,组内再按随机数字表法分为0、24、48 h组,每组5只。五组大鼠均正常喂养。

1.6 针刺方法 取穴和针刺手法参照华兴邦等研制的《大鼠穴位图谱》[9],选取“百会”、“风府”、“大椎”、“前三里”、“后三里”等穴。针刺操作:“百会”向后斜刺2 mm,“风府”向下方斜刺2 mm,“后三里”直刺7 mm,“前三里”直刺5 mm,“环跳”直刺7 mm,“后会”斜刺2 mm,“阳陵泉”直刺5 mm。针具选用佳健牌25号1寸一次性无菌针灸针;进针后捻转1 min,平补平泻,每次留针30 min。

1.7 取材与检测方法 各组针刺治疗结束后,在对应时间点处死大鼠,取下前肢肌、腓肠肌针刺局部的骨骼肌,放入液氮中,随转移到-80℃冰箱中保存待测。采用反转录酶对提取的RNA进行反转录处理;采用聚合酶及引物对反转录的RNA进行qRT-PCR检测。

采用定量法提取大鼠骨骼肌组织进行异丙醇处理:(1)RNA提取:将大鼠骨骼肌标本按Trizol试剂盒(simgen)操作说明提取RNA。(2)合成cDNA:将提取得到的RNA,各取2μg用于反转录,按照说明操作,-20℃冻存。(3)PCR扩增:以一个样本的cDNA稀释后作为标准品做基因的定量PCR,扩增条件为95℃,1min变性,95℃,5s,60℃,33s,共40个循环,最后是72℃,10min延伸。(4)引物:vimentin正向引物5’-TGAGATCGCCACCTACAGGA-3’5’-ACAATGCTTCTCTGGCAC GTCT-3’;desmin正向引物5’-TCACTCAACGAGGAGATTGCAT-3’5’-CATTGAGACCCGGGATG GAG-3’;内参β-actin 正向引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’5’-TTTAATGTCACGCACGA TTTC-3’。(5)使用实时荧光定量PCR检测。反应结束后,根据测得的样品阈值(Ct)及标准曲线,求出待测样品的相对起始浓度,用目的基因的相对起始拷贝数除以相应的β-actin的相对起始拷贝数得到目的基因表达的相对值。

2 结果

大鼠骨骼肌中vimentin及desminA的qRT-PCR产物均出现非特异性扩增,并且扩增产物符合设计长度。以样本cDNA稀释后求得的β-actin的扩增标准曲线斜率为-3.366,相关系数为-0.996,模板浓度对数值与Ct之间呈良好的线性关系。

2.1 前肢肌中vimentin的表达 见表1,结果显示,与模型组比较,三个治疗组中vimentin的mRNA表达量均有明显变化,头部穴位加躯体穴位治疗组在0、24 h有显著性差异(P<0.001),较其余组别呈明显上调。躯体穴位组在0、24 h有显著性差异(P<0.001),表达量相对上调。

表1 前肢肌vimentin的mRNA表达比较

表2 腓肠肌中vimentin的mRNA表达的比较

2.2 腓肠肌vimentin的表达 结果显示,与模型组比较,三个治疗组中vimentin的mRNA表达量均有明显变化,头部穴位组加躯体穴位治疗组在0 h有显著性差异(P<0.001),较头部穴位组及躯体穴位组表达量相对上调。躯体穴位组在24 h有显著性差异(P<0.05),表达量明显增高。模型组在0、24、48 h有显著差异(P<0.001),表达量在48 h时呈显著上调。

2.3 前肢肌中desmin的表达 表3结果显示:三个治疗组中desmin 的mRNA表达量均有明显变化,躯体穴位组在0、24、48 h有显著差异(P<0.001),表达量呈现上调。头部穴位组在0、48 h均有显著性差异(P<0.05),表达量在0 h相对上调。模型组在0、48 h有显著差异(P<0.001),在48 h时表达量呈相对上调。

表3 前肢肌中desmin基因表达的比较

2.4 腓肠肌中desmin的表达 表4结果显示:与模型组比较,三个治疗组中desmin的mRNA表达量均有明显变化,头部穴位组加躯体穴位组在48 h有显著性差异(P<0.001),表达量较其他组别呈现相对升高。躯体穴位组在0、24 h有显著性差异(P<0.05),表达量均呈现相对上调。模型组在0、24、48 h有显著差异(P<0.001),48 h时表达量较之前明显上调。

表4 前肢肌中desmin的mRNA表达的比较

3 讨论

《素问·骨空论》曰“督脉者,起于少腹……贯脊属肾……与太阳起于目内毗,上额交巅上,入络脑……”《难经·二十八难》曰“督脉者起于下极之俞,并于脊里,上至风府,入属于脑贯脊属肾;《十四经发挥》曰“阳之海者,以人是脉络,周流于诸阳之分……而督脉为之都纲,故曰阳脉之海。”督脉是阳脉之海,能沟通阴阳,调节阳经脉气,总摄诸经,为经脉之海,且能对脑的功能起到调节作用。膀胱经、督脉经都具有通行阳气的作用。阳气在人体中起着重要的作用,循经达表,可以卫外防御邪,通达于内,濡养脏腑,温通经脉……中风病病变在脑部,以全身骨骼肌瘫痪等为临床主要症状,而瘫痪肌群是督脉和膀胱经脉所通过之处,经络所过,主治所及,故取督脉及膀胱经的腧穴能升阳通督,改善全身骨骼肌肌力。许能贵等[10-11]通过电针大鼠局灶性脑缺血模型的督脉穴大椎、百会,发现电针可纠正脑缺血后中枢单胺类递质的代谢紊乱,进而保护脑缺血性损害。易玮等[12]研究发现脑缺血大鼠在针刺大椎、百会后,局部脑血流量迅速恢复,从而保护神经元缺血性损伤。综上所述,无论是现代研究及古代的医家经验均证实了督脉经穴和膀胱经穴在中风病治疗中的重要作用,故本研究以督脉的风府,百会为主穴,观察脑梗死大鼠瘫痪骨骼肌中vmentin及desimin的mRNA表达,以研究以督脉及膀胱经穴为主治疗中风病的瘫痪骨骼肌的分子机制。

根据“治痿独取阳明”的理论。以及现代研究,宿宝贵等[13]观察到针刺足三里、曲池穴后在活体MRI下,大鼠的脑梗死区域面积较对照组明显变小,且在电镜下观察到针刺足三里可使脑梗死边缘区神经细胞的线粒体肿胀和嵴的损伤均比对照组轻微,提示针刺足三里可以对神经元提供保护作用。 故本实验选取阳明经的“前三里”和“后三里”观察针刺对脑梗死大鼠骨骼肌的分子机制。

研究结果显示:以督脉为主的头部穴位+躯体穴位组,在脑梗死大鼠的前肢肌vimentin的表达量较其他组别在0、24 h出现了相对上调,故头部穴位加躯体穴位的早期针刺介入治疗可能对脑梗死后骨骼肌的修复有一定作用;躯体穴位组较其他组别在0、24 h时desmin及vimentin的表达明显上调。提示可能以躯体穴位的局部取穴为主的针刺,在维持局部骨骼肌细胞骨架的完整性及修复细胞骨架的方面较其他针刺方式效果更明显;头针组在0、24、48 h的desmin及vimentin的表达量均呈现上调;提示针刺头部督脉经穴,可能对于提高中枢脑组织的修复具有积极的作用,脑组织的修复的同时增强了骨骼肌的肌力恢复。

在研究中,笔者也观察到,模型组在各骨骼肌肌群中,vimentin、desmin的mRNA表达量在48 h时上调的幅度相对较明显,可能说明,在无针刺介入的情况下,骨骼肌正常细胞骨架可能具有自我修复的功能,提示可能针刺介入时间越早,对于骨骼肌细胞骨架及完整性的修复更具意义。

研究结果提示针刺改善脑梗死偏瘫骨骼肌肌力的机制可能是通过针刺对外周效应器的局部刺激,在改善局部功能的同时,引起中枢脑组织的修复,从而增强了外周效应器的康复,证实外周-中枢-外周的部分作用机制。