参芪蛭龙汤对膜性肾病小鼠肾组织凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的影响

薛丕良,李星宇,王向伟,王文文,庄 岩

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

膜性肾病(membranous nephropathy,MN)是以肾小球基底膜上皮细胞下弥漫的免疫复合物沉积伴基底膜弥漫增厚为主要病理表现,以肾病综合征或无症状性蛋白尿为主要表现的慢性肾脏疾病。研究表明,足细胞凋亡在MN发生发展中发挥重要作用,足细胞的损伤或凋亡是MN及蛋白尿发生发展的关键[1-3],因此,预防和治疗膜性肾病,抑制足细胞凋亡可能是其关键手段之一[4]。随着激素和免疫抑制剂临床严重不良反应的增多[5],中药治疗膜性肾病逐渐得到认可和应用[6]。参芪蛭龙汤是黑龙江省中医药科学院治疗MN的有效处方[7-8]。本研究拟建立膜性肾病小鼠模型,探讨参芪蛭龙汤对膜性肾病小鼠肾脏的保护作用及其对Bcl-2、Bax、Caspase-3信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验药物 参芪蛭龙汤组方中药(党参、黄芪、当归、川芎、水蛭、地龙、僵蚕、虎杖等)饮片均由黑龙江中医药大学附属第一医院提供,经黑龙江中医药大学基础医学院田明教授鉴定均为真品;以上药味,加10倍量水(约1 800 mL)浸泡1 h,煎煮1 h后,滤过,药渣再加10 倍量水(约1 800 mL),煎煮1 h,滤过,合并2 次滤液,浓缩至1.2 g/mL(按生药总量计),分装后,-80 ℃冰箱冻存。雷公藤多苷片:湖南千金协力有限公司,批号:1901113B,规格:10 mg/片。

1.3 试剂 阳离子牛血清白蛋白(c-BSA):美国Chondrex公司;ECL发光液:沈阳万类生物科技有限公司;TRIpure:北京百泰克生物技术有限公司;BeyoRT II M-MLV反转录酶:上海碧云天生物技术有限公司;RNase inhibitor:北京百泰克生物技术有限公司;2×Taq PCR MasterMix:北京索莱宝科技有限公司;SYBR Green:北京索莱宝科技有限公司。一抗(Caspase-3、Bax、Bcl-2):沈阳万类生物科技有限公司;二抗羊抗兔IgG-HRP:沈阳万类生物科技有限公司;过碘酸-雪芙(PAS)染色试剂盒:上海碧云天生物技术有限公司。

1.4 仪器 H-2050R超速冷冻离心机:湖南湘仪离心机仪器有限公司;ELX-800酶标仪:美国BIOTEK;Exicycler 96荧光定量PCR仪:韩国BIONEER;DYY-7C型电泳仪:北京市六一仪器厂;IX53显微镜:日本OLYMPUS。

1.5 实验方法

1.5.1 动物造模、分组及给药 小鼠适应性喂养3 d后,将160 mgC-BSA冻干粉溶于30 mLPBS磷酸缓冲液中,与等量的不完全弗氏佐剂混合后,超声使其完全乳化。在小鼠腋窝和腹股沟区域内的6处进行皮下注射,每处皮下注射量不超过0.05 mL,每只0.3 mL[9]。预免疫1 周后,对造模小鼠尾静脉注射乳化液,注射量为16 mg/kg,每周注射3 次。在6 周内将注射量逐渐增加至25 mg/kg。于造模第3周,测定小鼠24 h尿蛋白定量(UTP),若超过20 mg即为造模成功。

将造模成功的小鼠40只按体质量随机分为模型组,参芪蛭龙汤高剂量(24 g/kg,成人临床等效剂量0.5 倍,按体表面积法换算而得)、低剂量组(12 g/kg,成人临床等效剂量的0.25倍),雷公藤多苷片组(阳对组)(14 mg/kg),每组10只,另取10只未造模的小鼠作为正常组。正常对照组和模型对照组小鼠灌胃等体积生理盐水,各给药组小鼠灌胃相应药物10 mL/kg,每日1 次,连续给药4 周后处死小鼠。

1.5.2 观察指标及测定

1.5.2.1 肾脏病理学观察

七哥不帅，但五官很立体，皮肤微黑，不多言。搞户外的没有小白脸，肌肉线条不用说，让女生见了就忍不住流口水。

HE 染色:取小鼠肾组织放置于组织包埋盒中,福尔马林固定,石蜡包埋后制成4 μm切片,苏木素、伊红染色,封片。在光学显微镜200 倍视野下观察各组病理变化。

Masson 染色:切片脱蜡入水,苏木精染液5 min,充分水洗后1%盐酸乙醇分化,经丽春红染色5 min,2%冰醋酸水溶液浸洗1 min,冲洗后滴加1 %磷钼酸溶液分化5 min, 随后用苯胺蓝液复染5 min,再用2%冰醋酸处理1 min,之后脱水、透化、中性树胶封片固定,显微镜下观察组织形态。

PAS染色:石蜡切片常规脱蜡后蒸馏水洗涤,过碘酸溶液平衡至室温后滴加100 μL,在湿盒中避光反应10 min后,去除过碘酸溶液,蒸馏水中洗涤5 min。滴加100 μLSchiff试剂,放入湿盒中,置于37 ℃烘箱避光染色1 h。去除染色液,蒸馏水中洗涤5 min。滴加100 μL苏木素染色液,染色30 s。去除染色液,蒸馏水漂洗两次以上,每次3 s,直到浮色洗去。使用盐酸乙醇分化液分化30 s,自来水返蓝5 min。中性树胶封片,显微镜下观察和拍照。

1.5.2.2 RT-PCR检测肾组织Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA表达

肾组织加入TRIpure裂解液、氯仿、异丙醇等提取样本总RNA。酶标仪检测RNA浓度稀释至100 mg/L。

反转录得到对应的cDNA后进行实时荧光定量分析,反应体系为1 μLcDNA模板,上下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μL,10 μLSYBR GREEN mastermix,用ddH2O补足至20 μL。扩增条件为94 ℃、5 min,94 ℃、10 s,60 ℃、20 s,72 ℃、30 s,40 个循环; 溶解曲线分析94 ℃、10 s,台阶采样,台阶温度0.5 ℃。引物序列见表 1。结果采用 2-△△ CT方法进行分析。

表1 实时荧光定量PCR引物

1.5.2.3 Western-blot检测肾组织Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达

将小鼠肾组织用裂解液裂解后,离心取上清后进行蛋白定量,上样量为40 μg。制备聚丙烯酰胺凝胶,5 %的浓缩胶,10 %～12 %的分离胶。转膜后,脱脂奶粉封闭,1∶(500～1000)稀释一抗,4 ℃过夜,二抗避光孵育2 h,ECL化学发光。将PVDF膜进行扫描,用凝胶成像处理系统分析目标条带的光密度值,以各组光密度与空白组光密度的比值计算蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理

数据统计采用 SPSS 26 统计软件进行分析,单因素方差分析方法分析多组间差异,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肾组织病理学变化

HE染色可见正常组小鼠肾小球结构完整,模型组小鼠肾小球体积增大,肾小球毛细血管袢扩张,血细胞溢出,空泡、变性等,肾小球系膜增厚,局部肾小囊腔壁上皮严重破损。与模型组比较,参芪蛭龙汤高剂量组肾小球体积减小,仅有炎性细胞浸润减少。Masson 染色可见蓝色胶原纤维组织,与模型组比较,各给药组可见肾小球体积有所减小,基底膜增厚及组织纤维化有所减轻。PAS染色发现,模型组小鼠基底膜增厚明显,皱缩,出现钉突样及空泡状改变,各给药组基底膜病变状态较模型组显著减轻,参芪蛭龙汤高剂量组并未出现明显基底膜增厚等改变。见图1。

图1 各组小鼠肾组织病理变化(20×)

2.2 各组小鼠肾组织Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA表达的RT-PCR检测结果 见表2。

表2 各组小鼠肾组织Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达的比较

2.3 各组小鼠肾组织Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的Western-blot检测结果 见图2,表3。

注:A.模型组;B.正常组;C.参芪高剂量组;D.参芪低剂量组;E.雷公藤组图2 各组小鼠肾组织Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达的Western blot 检测结果

表3 各组小鼠肾组织Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相对表达量比较

3 讨论

膜性肾病在古代中医典籍未有相关的论述,根据其具有水肿、大量蛋白尿的临床特征,可将其归属于中医“水肿”“尿浊”范畴。目前大多数医家认为正气不足是膜性肾病的基本病机,属本虚标实证;以气(阳)亏虚为主,主要累及肾、脾两脏,与肺、肝相关,水湿、湿热、瘀血等在病机演变过程中既是病理产物,又是病情加重、缠锦难愈的重要因素。以脾肾亏虚为本,湿浊瘀血为标。

参芪蛭龙汤是本院治疗膜性肾病的经验方,方中以党参、黄芪、淫羊藿为君药,其中黄芪补气升阳、利水消肿,适用于气虚失运、水湿停聚引起的肢体面目浮肿、小便不利;党参补中益气,为脾胃气虚之要药;淫羊藿补益肾阳、鼓舞肾气;当归、川芎、水蛭、地龙、僵蚕为臣药,其中当归、川芎活血化瘀;水蛭、地龙、僵蚕虫类药入络、化瘀消癥;虎杖、凤尾草活血化瘀、利水消肿为佐药。全方共奏补益脾肾、化瘀利湿之效。

肾小球滤过膜主要由毛细血管内皮细胞、肾小球基膜和脏层上皮细胞组成。脏层上皮细胞又称足细胞,是肾小球滤过膜的最后一道防线。足细胞的损伤程度及数量变化直接导致肾小球滤过功能不可逆性的受损,是膜性肾病发生发展的关键因素,因而抑制足细胞的凋亡,保护足细胞数量及结构正常是治疗膜性肾病的关键[10-13]。研究表明,Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,Caspase-3激活后将启动细胞凋亡[14];抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax 同属于Bcl-2家族,二者可形成更加稳固的Bax-Bcl-2异源二聚体抑制细胞凋亡[15],Bcl-2/Bax比值是衡量细胞凋亡的重要指标,可决定Caspase-3激活状况和细胞凋亡的严重程度。本实验显示,经参芪蛭龙汤治疗的MN小鼠肾组织Bax、Caspase-3蛋白表达比模型组下降显著,Bcl-2蛋白表达比模型组升高显著,提示凋亡减少。表明参芪蛭龙汤抑制MN小鼠鼠肾脏足细胞凋亡可能与调节Bcl-2、Bax、Caspase-3信号通路有关。

因此,参芪蛭龙汤可明显改善MN小鼠肾组织的病理状态,Bcl-2、Bax、Caspase-3信号通路可能是参芪蛭龙汤改善膜性肾病小鼠肾组织细胞凋亡的作用靶点。