IVF/ICSI助孕后早期流产患者蜕膜组织焦亡相关因子表达水平的研究

车小群　王丽莲　王笑　许丽华　马天仲　荆霞　陈碧

摘要：目的 探討体外受精（IVF）/卵胞浆内单精子注射（ICSI）助孕妊娠后早期流产患者蜕膜组织中焦亡相关因子的表达及作用。方法 选取行IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产患者102例（研究组），同期因意外妊娠行人工流产术的患者100例（对照组），收集蜕膜组织。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法及Western blot法检测蜕膜组织中焦亡相关因子Nod样受体蛋白3（NLRP3）、白细胞介素（IL）-1β、胱天蛋白酶1（Caspase1）、gasdermin D（GSDMD） mRNA及蛋白表达，TUNEL法检测蜕膜组织中细胞焦亡情况，Pearson法分析蜕膜组织中细胞焦亡率与NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白水平的相关性。结果 与对照组相比，研究组蜕膜组织中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA及蛋白水平、蜕膜组织中细胞焦亡率升高（P＜0.05）；研究组患者蜕膜组织中细胞焦亡率与NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表达水平均呈正相关（r分别为0.429、0.474、0.498、0.540，均P＜0.05）。结论 IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产患者蜕膜组织中焦亡相关因子NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD表达均升高，且与蜕膜组织细胞焦亡有关。

关键词：流产，治疗性；受精，体外；精子注射，细胞质内；蜕膜组织；Nod样受体蛋白3；白细胞介素-1β；胱天蛋白酶1；gasdermin D

中图分类号：R711.6文献标志码：ADOI：10.11958/20220918

Study on the expression of pyrolysis-related factors in the decidua tissue of patients with early abortion after IVF/ICSI assisted pregnancy

CHE Xiaoqun， WANG Lilian， WANG Xiao， XU Lihua， MA Tianzhong， JING Xia， CHEN Bi

Reproductive Center， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524001， China

Corresponding Author E-mail： chenbi9677@163.com

Abstract： Objective To investigate the expression and effect of pyrodeath related factors in decidual tissue of in vitro fertilization （IVF）/intracytoplasmic sperm injection （ICSI） assisted early postpregnancy abortion. Methods A total of 102 patients with early abortion after IVF/ICSI assisted pregnancy were selected as the research group， and 100 patients who underwent artificial abortion due to unexpected pregnancy during the same period were selected as the control group. Samples of decidua tissue were collected. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） method and Western blot assay were used to detect expression levels of Nod-like receptor pyrin domain 3 （NLRP3）， interleukin-1β （IL-1β）， Cysteinyl aspartate specific proteinase 1 （Caspase1）， gasdermin D （GSDMD） mRNA and protein in decidua tissue. TUNEL method was used to detect the cell pyroptosis in decidua tissue. Pearson method was used to analyze the correlation between pyroptosis rate and the protein levels of NLRP3， IL-1β， Caspase1 and GSDMD in decidua. Results Compared with the control group， expression levels of NLRP3， IL-1β， Caspase1， GSDMD mRNA and protein， the cell pyroptosis rate in decidua tissues were significantly increased in the research group （P＜0.05）. There was a positive correlation between cell pyroptosis rate in decidua tissue and expression levels of NLRP3， IL-1β， Caspase1 and GSDMD in the research group （r=0.429， 0.474， 0.498， 0.540， all P＜0.05）. Conclusion The expression levels of pyrolysis-related factors NLRP3， IL-1β， Caspase1 and GSDMD in decidua tissue are increased in patients with early abortion after IVF/ICSI assisted pregnancy， and which are related to the cell pyroptosis of decidua tissue.

Key words： abortion， therapeutic; fertilization in vitro; sperm injections， intracytoplasmic; decidua tissues; Nod-like receptor pyrin domain 3; interleukin-1β; cysteinyl aspartate specific proteinase 1; gasdermin D

不孕不育是与生活环境、心理压力、身体健康状况等多种因素有关的疾病，近年来其发病率不断升高，且趋于年轻化，严重影响家庭和谐［1］。体外受精（in-vitro fertilization，IVF）/卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是重要的生育辅助技术，在不孕症治疗中应用广泛［2］。研究显示，IVF/ICSI助孕妊娠可将临床妊娠率由15%～20%提高到40%～50%，但妊娠12周前患者自然流产风险仍较高，单胎活产率仅35%左右［3］。研究IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产的相关影响因素具有重要价值。妊娠的正常维持有赖于胎盘组织细胞凋亡、增殖的动态平衡，而在妊娠早期，承担着分化发育成胎盘的绒毛组织以及为受精卵提供保护、营养的蜕膜组织在维持妊娠方面发挥重要作用［4-5］。研究发现，Nod样受体蛋白3（nod-like receptor pyrin domain3，NLRP3）炎症小体介导的母胎相关炎症在复发性自然流产发病過程中发挥重要作用［6］。细胞焦亡是近年来发现的一种依赖于炎症反应的细胞程序性死亡方式［7］，但鲜见其在IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产中作用的相关研究。本研究旨在探讨IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产患者蜕膜组织中焦亡相关因子NLRP3、白细胞介素（IL）-1β、胱天蛋白酶1（Caspase1）、gasdermin D（GSDMD）的mRNA及蛋白表达水平，以期为相关研究提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年10月—2020年10月于广东医科大学附属医院生殖中心首次行IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产患者102例（研究组），年龄（32.52±8.09）岁，体质量指数（BMI）（23.64±4.05）kg/m2，孕（8.53±2.25）周。选取同期在本院妇科门诊因意外妊娠行人工流产术的患者100例（对照组），均为单胎妊娠，年龄（30.84±8.72）岁，BMI（22.89±4.26）kg/m2，孕（8.93±2.40）周。排除标准：（1）合并单侧卵巢畸形、子宫畸形、子宫内膜异位症、宫腔粘连、基础内分泌疾病、染色体异常及异位妊娠者。（2）未收集到蜕膜组织者。（3）有明显诱因流产者。（4）年龄、孕周、孕产次、基础疾病等临床资料不完整者。2组年龄（t=1.420）、BMI（t=1.283）、孕周（t=1.222）差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。收集所有患者新鲜蜕膜组织，生理盐水冲洗干净，分为2份，分别于-80 ℃冷冻保存及4%多聚甲醛固定后石蜡包埋保存。本研究获得本院伦理委员会审核批准（PJ2019105），患者或家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 SYBR One-Step实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）试剂盒（货号：abs60038）购自爱必信（上海）生物科技有限公司；NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD、GAPDH羊抗兔一抗（货号：ab263899、ab216995、ab207802、ab210070、ab9485）购自英国Abcam公司；TUNEL试剂盒（货号：T2190）购自北京索莱宝科技有限公司；StepOne Plus荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；GelDocEZ凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；SMZ745光学显微镜购自日本尼康公司。

1.3 qRT-PCR法检测蜕膜组织中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA表达水平 取部分冷冻的蜕膜组织，TRIzol法提取总RNA，使用SYBR One-Step qRT-PCR试剂盒进行qRT-PCR反应，引物序列见表1。反应体系（20 μL）：2×StarScript Ⅱ Green One Step qRT-PCR Buffer 10 μL，StarScript Ⅱ One Step Enzyme Mix 2.0 μL，ROX Reference Dy 0.4 μL，RNA模板 2.0 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH₂O 4.8 μL。反应条件：反转录 50 ℃ 10 min，预变性94 ℃ 2 min；变性94 ℃ 15 s，退火（NLRP3 57 ℃、IL-1β 60 ℃、Caspase1 55 ℃、GSDMD 58 ℃） 15 s，延伸70 ℃ 30 s，共35个循环。以GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

1.4 Western blot法检测蜕膜组织中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表达水平 取部分冷冻的蜕膜组织，冰上研碎，加预冷的RIPA裂解液，12 000 r/min离心10 min，BCA试剂盒检测上清液蛋白浓度。计算上样体积，各样品取40 μg蛋白，沸水浴变性，上样进行SDS-PAGE电泳，使用PVDF膜进行常规转膜操作，用5%脱脂奶粉常温封闭1 h，加入NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD、GAPDH一抗（均1∶1 000）4 ℃过夜，次日PBS冲洗PVDF膜，加羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育1 h，避光下滴加ECL液发光显色，凝胶成像系统拍摄图像，以GAPDH蛋白为内参蛋白，Image J软件分析条带灰度。

1.5 TUNEL法检测蜕膜组织中细胞焦亡情况 石蜡包埋的蜕膜组织切片（4 μm），使用TUNEL试剂盒进行染色操作（一抗为Caspase1抗体）。每位患者取一张切片于光镜下观察蜕膜组织染色结果，细胞核中有棕黄色颗粒者为焦亡细胞，每张切片随机抽取5个不重叠视野，统计焦亡细胞百分比，即焦亡率。

1.6 统计学方法 采用SPSS 24.0、GraphPad 7.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料采用x±s表示，2组间比较行独立样本t检验。相关分析用Pearson相关系数。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA相对表达水平比较 与对照组比较，研究组NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA相对表达水平均升高（P＜0.01），见表2。

2.2 2组NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白相对表达水平比较 与对照组比较，研究组NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白相对表达水平均升高（P＜0.01），见图1、表3。

2.3 2组患者蜕膜组织中细胞焦亡率比较 研究组蜕膜组织中细胞焦亡率（18.94%±4.08%）高于对照组（5.26%±1.33%），差异有统计学意义（t=31.907，P＜0.01），见图2。

2.4 研究组患者蜕膜组织中细胞焦亡率与NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表达的相关性 研究组患者蜕膜组织中细胞焦亡率与NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表达水平均呈正相关（r分别为0.429、0.474、0.498、0.540，P＜0.05）。

3 讨论

近年来，我国不孕不育患者的数量呈增长趋势，且一些有孕育打算的中、高年龄群体受孕概率较低，故辅助妊娠措施越来越受到重视［8］。IVF/ICSI能大大提高受孕率，缩短待孕时间，但IVF/ICSI助孕妊娠12周内容易发生早期流产［9］。因此，研究IVF/ICSI助孕妊娠后发生早期流产的机制具有重要意义。

蜕膜组织在妊娠过程中发挥重要作用，可逐渐发育为胎盘，成为母体-胎儿之间的纽带，可负责氧气、营养物质、代谢废物等的交换，而蜕膜组织由子宫内膜间质增殖、再分化形成，在胚胎着床、妊娠的建立与维持、分娩发动过程中均起重要作用。赵亚民等［10］认为，miR-575可能通过促进蜕膜细胞凋亡及炎症反应，参与自然流产反复发生过程。本研究結果显示，IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产患者蜕膜组织中细胞焦亡率较人工流产患者显著升高，表明蜕膜组织中细胞过多焦亡可能是患者IVF/ICSI助孕妊娠后早期发生流产的重要原因，探究更多关于蜕膜组织中细胞焦亡的机制具有重要意义。

焦亡严重依赖于炎症反应，发生时会导致细胞胀破、内容物外泄，引发更多的炎症反应及细胞焦亡［11］。Landi等［12］研究显示，妊娠早期失调的促炎过程可能在复发缓解型多发性硬化症女性流产中发挥重要作用。Bas等［13］研究表明，白细胞计数、血小板计数、中性粒细胞计数与淋巴细胞计算的比值等全血炎症标志物可用于妊娠自然流产的风险评估。Suttorp等［14］研究发现，感染性炎症、非感染性炎症均可导致胎盘功能障碍及妊娠并发症发生，增加怀孕小鼠流产的发生率。经典的焦亡途径依赖于Caspase1诱导的炎症反应，当外源性、内源性刺激信号经由炎症小体NLRP3激活Caspase1后，打孔蛋白GSDMD介导细胞膜孔道的形成，使得细胞肿胀破裂，胞内物质流出，刺激IL-1β等炎性因子大量合成并释放，加重炎症反应，最终诱导细胞焦亡发生［15］。秦志平等［16］研究亦显示，稽留流产患者滋养细胞细胞质中GSDMD、NLRP3、Caspase-1、IL-1β高于正常早孕女性。本研究结果显示，与人工流产患者相比，IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产患者蜕膜组织中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA及蛋白表达水平均升高，再次证实了IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产患者蜕膜组织中发生了大量的细胞焦亡。肖文霞等［17］研究发现，蜕膜组织细胞焦亡与稽留流产具有相关性。本研究结果显示，研究组患者蜕膜组织中细胞焦亡率与NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表达水平均呈正相关，表明IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产患者蜕膜组织中细胞死亡方式与细胞焦亡有关，蜕膜组织中细胞大量焦亡可能是导致患者IVF/ICSI助孕妊娠后早期发生流产的重要原因之一。

综上所述，IVF/ICSI助孕妊娠后早期流产患者蜕膜组织中焦亡相关因子NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD的mRNA及蛋白表达水平均明显上调，可能参与蜕膜组织细胞焦亡发生，进而导致患者流产。

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（2022-06-21收稿 2022-09-28修回）

（本文编辑 陆荣展）