红景天苷介导p38 MAPK信号通路抑制脂多糖诱导的心肌细胞焦亡及氧化损伤*

王明燕, 宣清清, 许玲

诸暨市中医医院 1中药房, 2临床药学室(浙江诸暨 311800)

心血管疾病主要是指与循环系统有关的一系列疾病,有着高发病率和高病死率的特点,是严重威胁人类健康的重大疾病之一[1]。心力衰竭是一种多因素的全身性疾病,目前抗心力衰竭的药物很多,常规使用的有4类,但均有一定的不良反应。为此,寻找新的治疗药物是目前研究的热点之一。中医学认为心力衰竭总病机是“气虚血瘀水停”,心力衰竭治疗总原则应以益气活血利水为法[2]。红景天苷是藏药红景天的主要活性成分,其药理活性已引起广泛的研究关注[3]。氧化应激和炎症作为心力衰竭综合征的关键病理生理因素和心力衰竭进展的潜在因素引起了人们的关注。细胞焦亡是一种程序性细胞死亡,表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应[4],多种心血管疾病中已发现心肌细胞焦亡现象,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体的激活与此密切相关。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)是一种介导细胞凋亡和炎症等的信号通路,可被促炎因子、应激刺激及细菌内毒素等激活,从而导致心肌损伤的发生,而抑制p38 MAPK的活化则可一定程度上缓解心肌损伤[5]。但红景天苷是否能通过p38 MAPK信号通路对心肌细胞的焦亡和氧化损伤进行调节尚未可知。脂多糖(LPS)可刺激许多促炎标记物,从而触发多种免疫级联反应[6],由氧化应激介导的炎症途径也会受到LPS的刺激[7]。基于此,2022年2—12月本研究通过体外培养H9C2细胞,探讨红景天苷干预对LPS诱导的心肌细胞焦亡及氧化损伤的影响以及对p38 MAPK信号通路的调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 大鼠心肌细胞(H9C2)购自河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。

1.2 药品与试剂 红景天苷(纯度≥98%)、LPS(纯度≥98%)、p38 MAPK通路抑制剂SB203580(纯度≥98%)、p38 MAPK通路激活剂C16-PAF(纯度≥98%)(上海源叶生物科技有限公司),DMEM培养基、胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司),活细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(南京诺唯赞有限公司),酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(上海恒远生物科技有限公司),逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(杭州主诺生物技术有限公司),RIPA裂解液(上海生工生物工程股份有限公司),BCA蛋白试剂盒(英国Abcam公司),鼠抗人[细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-1、Gasdermin-D(GSDMD)、炎性小体(NLRP3)、p38 MAPK和p-p38 MAPK及β-actin一抗]、辣根过氧化物酶碱性磷酸酯酶标记的山羊抗鼠IgG(二抗)(英国Abcam公司)。

1.3 仪器 XSP-BM-13C型倒置荧光显微镜购自青岛明博环保科技有限公司;BPN-40RHP型二氧化碳培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪器(美国ABI公司);酶标仪(MultiskanAscent,美国Thermo公司);DYCZ-24KF型四板垂直蛋白电泳仪(北京六一生物科技有限公司)等。

1.4 方法

1.4.1 H9C2细胞培养 心肌细胞株H9C2接种于含10% FBS的DMEM培养基中,并置于5% CO2、37℃、70%～80%湿度培养箱中培养,隔2～3 d更换1次培养液,待细胞贴壁后生长密度达到80%以上时进行细胞传代选取对数期生长细胞用于实验。

1.4.2 分组与干预 将心肌细胞分为对照组、LPS组、LPS+10、20、40、80 μmol/L红景天苷组,对照组细胞不做干预,LPS组以1 μg/mL LPS刺激24 h构建体外炎症模型[8];LPS+10、20、40、80 μmol/L红景天苷组在LPS组的基础上加入10、20、40、80 μmol/L红景天苷;ELISA和CCK-8法检测出最佳红景天苷浓度后,又分组:对照组、LPS组、LPS+20 μmol/L红景天苷组、SB203580组、LPS+20 μmol/L红景天苷+SB203580组和LPS+20 μmol/L红景天苷+C16-PAF组。SB203580组加入1 μg/mL LPS+1 μmol/L SB203580;LPS+20 μmol/L红景天苷+SB203580组在LPS组的基础上,加入20 μmol/L红景天苷,同时加入1 μmol/L SB203580;LPS+20 μmol/L红景天苷+C16-PAF组在LPS组的基础上,加入20 μmol/L红景天苷,同时加入10 μmol/L C16-PAF。每组设置3个复孔。

1.5 测定指标

1.5.1 ELISA法测定H9C2细胞因子表达情况 细胞分组方法同2.2,干预24 h的细胞,取各组细胞上清液,分别遵循白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)ELISA试剂盒说明书操作步骤,测定细胞炎症因子IL-6、TNF-α、MDA和SOD的表达水平。

1.5.2 CCK-8法测定H9C2细胞活力 将细胞接种在96孔板中,每孔接种细胞悬液100 μL(含8 000个细胞),药物干预24 h后,每孔补加10 μL CCK-8溶液培养,2 h后使用酶标仪测450 nm处各孔的吸光度值(OD),计算细胞活力。细胞活力(%)=(LPS组或LPS+10、20、40、80 μmol/L红景天苷组OD值/对照组OD值)×100%。

1.5.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定H9C2细胞中Cyclin D1和Caspase-3 mRNA相对表达量 干预24 h的细胞,用Trizol试剂进行裂解和总RNA提取操作,具体步骤按照说明书进行;利用超微量分光光度计法检测提取RNA样品的浓度及纯度,取1 μg作为模板在1st cDNA合成试剂盒的帮助下由PCR仪合成模板链cDNA;然后取2 μL cDNA在SYBR qPCR MasterMix、特殊引物对的帮助下由RT-qPCR仪进行cDNA扩增和检测。每个样品设置5个复孔。以GAPDH作为内参基因,相对表达量以2-ΔΔCt法计算。引物序列见表1。

表1 Cyclin D1和Caspase-3 RT-qPCR引物序列

1.5.4 蛋白免疫印迹(WB)法检测H9C2细胞中增殖、凋亡、焦亡与p38 MAPK信号通路相关蛋白的表达水平 细胞分组同2.2,干预24 h时,收集各组细胞,提取蛋白定量后上样,跑胶后转膜,封闭2 h后参照抗体说明书加入一定稀释比例的一抗(p38 MAPK、p-p38 MAPK、Caspase-3、Cyclin D1、Caspase-1、GSDMD、NLRP3及β-actin),4℃孵育过夜,次日TBST洗涤后加入山羊抗鼠IgG二抗,孵育2 h,洗涤3次,最后加入显影液,在凝胶成像系统中对膜进行拍照,蛋白条带的灰度值用Image-J图像分析软件进行分析,并以β-actin为内参蛋白,计算目标蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 LPS诱导大鼠心肌H9C2细胞损伤模型的建立 ELISA结果见表2。与对照组相比,LPS组细胞炎症因子IL-6和TNF-α表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,加入红景天苷处理后,除LPS+10 μmol/L红景天苷组的IL-6和TNF-α含量差异无统计学意义外(P>0.05),LPS+20、40、80 μmol/L红景天苷组IL-6和TNF-α含量均显著性降低(P<0.05)。

表2 各组H9C2细胞活力及IL-6、TNF-α表达水平比较

2.2 红景天苷对LPS诱导H9C2细胞活力的影响 使用CCK-8法检测红景天苷对H9C2细胞活力的影响(表2),实验结果显示,干预24 h时,与对照组比较,LPS组细胞活力显著降低(P<0.05);与LPS组相比,LPS+20 μmol/L红景天苷组细胞活力显著升高(P<0.05),其余组差异无统计学意义(P>0.05),为排除细胞活力对后续实验的影响,所以选择与LPS组有显著差异且有较好抑炎效果的LPS+20 μmol/L红景天苷组加入p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580和通路激活剂C16-PAF进行p38 MAPK通路验证实验。

2.3 红景天苷对LPS诱导H9C2细胞氧化损伤的影响 干预24 h后,与对照组相比,LPS组细胞SOD含量显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+20 μmol/L红景天苷组和SB203580组细胞SOD含量显著升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05)。与LPS+20 μmol/L红景天苷组相比,LPS+20 μmol/L红景天苷+SB203580组细胞SOD含量显著升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05),LPS+20 μmol/L红景天苷+C16-PAF组MDA含量显著升高(P<0.05),SOD含量显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组SOD与MDA水平比较

2.4 红景天苷对LPS诱导H9C2细胞Cyclin D1和Caspase-3 mRNA和蛋白表达的影响 对增殖凋亡相关基因Cyclin D1和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平进行检测,结果见图1、表4。与对照组相比,LPS组Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平显著降低,而Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与LPS组相比,LPS+20 μmol/L红景天苷组和SB203580组Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平显著升高,而Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与LPS+20 μmol/L红景天苷组相比,LPS+20 μmol/L红景天苷+SB203580组Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平显著升高,而Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而LPS+20 μmol/L红景天苷+C16-PAF组Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平显著降低,Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。

注:A:对照组;B:LPS组;C:LPS+20 μmol/L红景天苷组;D:SB203580组;E:LPS+20 μmol/L红景天苷+SB203580组;F:LPS+20 μmol/L红景天苷+C16-PAF组

表4 红景天苷对LPS诱导的H9C2细胞增殖、凋亡相关基因表达的影响

2.5 红景天苷对LPS诱导H9C2细胞中焦亡相关蛋白表达的影响 对焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白表达水平进行检测,结果见图2、表5。与对照组相比,LPS组Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+20 μmol/L红景天苷组和SB203580组Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与LPS+20 μmol/L红景天苷组相比,LPS+20 μmol/L红景天苷+SB203580组Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白表达水平显著降低(P<0.05),LPS+20 μmol/L红景天苷+C16-PAF组Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。

注:A:对照组;B:LPS组;C:LPS+20 μmol/L红景天苷组;D:SB203580组;E:LPS+20 μmol/L红景天苷+SB203580组;F:LPS+20 μmol/L红景天苷+C16-PAF组

表5 红景天苷对LPS诱导的H9C2细胞焦亡相关蛋白表达的影响

2.6 红景天苷对LPS诱导H9C2细胞p38 MAPK通路活化的影响 为了确定红景天苷对p38 MAPK信号通路活化状态的影响,本研究检测了该通路的关键性蛋白p38 MAPK和p-p38 MAPK的表达水平见表6、图3。蛋白定量分析结果显示,各组之间p38 MAPK蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,LPS组p-p38 MAPK表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+20 μmol/L红景天苷组和SB203580组p-p38 MAPK表达水平显著降低(P<0.05);与LPS+20 μmol/L红景天苷组相比,LPS+20 μmol/L红景天苷+SB203580组p-p38 MAPK表达水平显著降低(P<0.05),LPS+20 μmol/L红景天苷+C16-PAF组p-p38 MAPK表达水平显著升高(P<0.05)。

注:A:对照组;B:LPS组;C:LPS+20 μmol/L红景天苷组;D:SB203580组;E:LPS+20 μmol/L红景天苷+SB203580组;F:LPS+20 μmol/L红景天苷+C16-PAF组

表6 红景天苷对LPS诱导H9C2细胞p38 MAPK通路活化的影响

3 讨论

心力衰竭是常见的心血管疾病,目前抗心力衰竭的药物很多,但该病仍不能被治愈,患者生活质量和寿命未有显著提升,国家医疗支出不断在增加,给患者家庭和社会造成了巨大的负担及经济压力[8]。为此,寻找新的治疗药物尤为重要。近年来,中医领域在心力衰竭的防治领域有深入的研究,中医学将心力衰竭归为“痰饮”“怔忡”“水肿”“喘证”等范畴。红景天苷作为中药红景天的主要有效成分之一,具有活血化瘀、扶正固本、通脉止痛的功效,特别是在心血管系统方面,红景天苷可减弱心脏缺血/再灌注损伤,增加心肌存活率,减少心肌凋亡[9]。万云茹[10]研究表明,红景天苷可通过诱导抗凋亡蛋白的表达,抑制促凋亡蛋白水平,进而抑制心力衰竭,起到心脏保护作用。谭洪玲等[11]分析了红景天苷对心肌缺氧/复氧损伤的保护作用,发现红景天苷增加了缺氧/复氧损伤下心肌细胞的活力,对缺氧诱导的心肌细胞损伤有保护作用。以上研究表明,红景天苷对心肌细胞有一定的保护作用。本研究发现,与对照组相比,LPS诱导大鼠心肌H9C2细胞后炎症因子IL-6和TNF-α表达水平显著升高,细胞活力显著降低,提示LPS诱导大鼠心肌损伤细胞模型构建成功。与LPS组相比,加入20、40和80 μmol/L红景天苷后IL-6和TNF-α表达水平显著降低,LPS+20 μmol/L红景天苷组细胞活力显著升高,说明20 μmol/L红景天苷可以抑制LPS诱导的H9C2细胞炎症,提高细胞的活力,因此选择20 μmol/L红景天苷进行后续通路验证实验。

由Gasdermin蛋白介导的促炎性细胞死亡称为细胞焦亡,其中以NLRP3炎症小体最受关注。NLRP3炎症小体广泛分布于免疫细胞和非免疫细胞中,由凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、NLRP3受体和pro-caspase-1组成,参与机体的炎症反应。细胞焦亡与心血管疾病相关的心肌损伤中发挥重要角色,且氧自由基(ROS)增多、离子稳态失衡等都会诱导心脏炎症反应[12]。干预NLRP3炎症小体是许多中药发挥心血管保护作用的重要机制之一。研究发现,参葵通脉颗粒能降低心脏组织中IL-1β、Caspase-1的蛋白水平,通过调控心肌细胞焦亡,显著改善慢性心力衰竭大鼠模型心功能[13]。此外,红景天苷也被发现通过调控腺苷酸活化蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白(AMPK-mTOR)途径诱导血管内皮细胞自噬,保护其免受氧化应激引发的凋亡[14]。Xing等[15]发现,红景天苷可通过抑制NLRP3炎症小体活性,减轻Caspase-1介导的GSDMD剪切作用,从而抑制血管内皮细胞焦亡,发挥改善动脉粥样硬化的作用。而红景天苷对心肌细胞的焦亡及氧化应激损伤是否起到一定的保护作用尚未可知。本研究结果表明,与对照组相比,LPS诱导心肌细胞损伤后,MDA含量、焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD和NLRP3表达均显著升高,而SOD含量显著降低;与LPS组相比,LPS+20红景天苷组和SB203580组的MDA含量、Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白表达显著降低,SOD含量显著升高,提示红景天苷对LPS诱导的心肌H9C2细胞的氧化应激、焦亡有保护作用,并且可能与p38 MAPK信号通路有关。有研究表明,MAPK在损伤的心肌细胞中被激活,是心肌损伤的主要调节剂[16]。其中,p38 MAPK可以由ROS激活,它可以导致线粒体内ROS水平升高,造成线粒体损伤[17]。有报道指出,抑制p38 MAPK信号通路激活可缓解I/R所致的小鼠心肌损伤[18]。但红景天苷是否通过p38 MAPK信号通路对心肌细胞焦亡和氧化应激起保护作用尚未可知。本研究结果表明,与对照组相比,LPS诱导心肌细胞损伤后,细胞凋亡相关基因及蛋白Caspase-3表达显著升高,而增殖相关基因及蛋白CyclinD1的表达显著降低;与LPS组相比,LPS+20红景天苷组和SB203580组的Caspase-3 mRNA及蛋白表达和p-p38 MAPK蛋白表达显著降低,CyclinD1蛋白表达显著升高,提示红景天苷对心肌H9C2的增殖、凋亡的作用机制可能与p38 MAPK信号通路有关;与LPS+20 μmol/L红景天苷组相比,LPS+20 μmol/L红景天苷+SB203580组的Caspase-3 mRNA及蛋白表达、Caspase-1、GSDMD、NLRP3和p-p38 MAPK蛋白表达显著降低,CyclinD1蛋白表达显著升高,而LPS+20 μmol/L红景天苷+C16-PAF组则显著扭转了上述指标,表明红景天苷可促进LPS诱导的心肌H9C2细胞增殖,抑制其凋亡、焦亡并对氧化应激损伤有一定的保护作用,可能是通过负调控p38 MAPK信号通路发挥作用。

综上所述,红景天苷可促进大鼠心肌H9C2细胞增殖、抑制凋亡和焦亡,对氧化应激损伤有一定保护作用,其作用机制可能与负调控p38 MAPK信号通路有关,能够为红景天苷通过调控p38 MAPK信号通路对心力衰竭的治疗提供理论支持。但不足的是,红景天苷在心力衰竭中是否存在其他信号通路的调控机制等,仍需要进行进一步研究。

利益相关声明:文章所有作者无利益冲突。

作者贡献说明:王明燕负责实验设计及论文审核修改;宣清清负责细胞处理及实验;许玲负责数据整理与论文撰写。