超声辅助提取黑芝麻油脚卵磷脂及其抗氧化活性研究

邓胜国 ,黄 艳 ,姜红宇 ,尹爱武 ,黄光文

(1.湖南科技学院 化学与生物工程学院,湖南 永州 425199; 2.湘潭医卫职业技术学院 教务处,湖南 湘潭 411104)

0 引言

卵磷脂的来源广泛,存在于动植物组织及器官中,具有延缓衰老、增强记忆力、降低胆固醇等药理作用[1],已广泛应用于食品、医药等行业[2,3].卵磷脂提取、分离制备的方法主要为酶水解提取法、膜分离法、有机溶剂萃取法等[3].超声辅助提取法具有提取温度低、提取时间短、操作简单、提取效果好等优点,在天然活性物质的提取分离中应用越来越广泛[4].目前对芝麻的研究工作主要集中于对芝麻油的开发利用,其榨油之后产生的油脚等副产品一般被当作废弃物处理,综合利用率低从而导致资源浪费和环境污染.相关研究[5]表明,芝麻油脚含有粗蛋白、磷脂、芝麻素等活性成分,如果能采用适当的技术对油脚中的活性物质进行回收利用和开发,既可有效提升黑芝麻加工附加值,又可为磷脂的开发利用提供新的植物资源.本研究拟进行超声辅助乙醇溶液提取黑芝麻油脚卵磷脂的工艺及其抗氧化活性的探讨,以期为其他天然油料作物加工副产品油脚活性成分的有效提取及应用提供一定的参考.

1 材料与仪器

黑芝麻(隆回县绿之佳粮油商贸有限公司);DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,酷尔化学科技(北京)有限公司);丙酮、无水乙醇(AR,湖南汇虹试剂有限公司);卵磷脂标准品(美国sigma 公司);维生素C(AR,天津市天力化学试剂有限公司).

DZF 电热真空干燥箱(巩义市英峪高科仪器厂);SL3-120A 超声清洗器(上海舍岩仪器有限公司);UV-2600 紫外可见分光光度计(尤尼科(上海)仪器有限公司);ZYI-9028 贝尔斯顿榨油机(德国贝尔斯顿电器有限公司);LC-RE-52A 旋转蒸发器(上海力辰仪器科技有限公司).

2 试验方法

2.1 卵磷脂标准曲线的绘制

参照文[6]和[7]方法并做适当改进.分别吸取一定体积的卵磷脂标准应用液 (浓度为5 mg/mL)于若干个50 mL 的容量瓶中,以95 %的乙醇定容,稀释制备一系列不同浓度的卵磷脂标准测试液,静置10 min 后于最佳检测波长处分别测定其吸光度,以卵磷脂标准测试液的浓度为自变量(横坐标)、吸光度为因变量(纵坐标)绘制标准曲线,如图1 所示.并通过线性拟合得其回归方程y=1.1759x-0.0038,R2=0.9990.

图1 卵磷脂标准曲线

2.2 黑芝麻油脚卵磷脂含量的测定

以压榨法制备的黑芝麻毛油为原料,采用水化脱胶处理制备获得黑芝麻油脚.准确称取定量的黑芝麻油脚,经浓缩脱水后转移至锥形瓶中,加入丙酮萃取脱油,油层分离后于残渣中加入一定体积分数的乙醇进行超声辅助提取卵磷脂,提取液进行过滤,收集滤液,残渣同法重复提取1次,过滤,滤液合并经浓缩并定容.接着取适量粗(定容)滤液置于25 mL 的比色管中,按2.1节中的方法步骤,测定样品提取液的吸光度后计算出其浓度,再按下式计算样品的卵磷脂得率:

其中C为黑芝麻油脚样品提取液中卵磷脂的浓度(mg/mL);V为黑芝麻油脚样品提取液的总体积(mL);m为黑芝麻油脚的重量(g).

2.3 黑芝麻油脚卵磷脂提取的单因素实验

准确称取黑芝麻油脚5.000g,经浓缩、萃取等预处理后进行超声辅助提取.以卵磷脂得率为考核指标,研究不同体积分数的乙醇(80%、85%、90%、95%、100%)、不同料液比(1:4、1:6、1:8、1:10、1:12)、不同温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)、不同浸提时间(20 min、25 min、30 min、35 min、40 min)对提取效果的影响,分别确定乙醇体积分数、料液比、超声温度及超声时间4 个单因素最适宜的取值.

2.4 黑芝麻油脚卵磷脂提取的正交实验

根据上述单因素试验的结果,选择采用L9(34)的正交表考察料液比(A)、乙醇体积分数(B)、超声温度(C)、超声时间(D)四个因素对卵磷脂得率的影响效果,从而确定卵磷脂的最佳提取工艺.黑芝麻油脚卵磷脂提取的正交实验因素水平见表1.

表1 黑芝麻油脚卵磷脂提取的正交实验因素水平

2.5 黑芝麻油脚卵磷脂的体外抗氧化活性实验

参照文[8]方法并做适当改进.将最优工艺条件提取制备的粗卵磷脂进行稀释得到不同浓度梯度的样品液,实验过程中采用等浓度的VC溶液进行空白对照.吸取2 mL不同卵磷脂浓度的样品液,加入2mL 65 μmmol/L 的DPPH 乙醇溶液,混匀后室温下置避光处静置30 min,于517 nm 处测其吸光度,按下式计算DPPH 自由基的清除率:

其中A0为2.0 mL DPPH 溶液+2.0 mL 95% 乙醇的吸光值;Ai为2.0 mL DPPH 溶液+2.0 mL 样品液的吸光值;Aj为2.0 mL 95% 乙醇+2.0 mL 样品液的吸光值.

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果

3.1.1 不同体积分数的乙醇对黑芝麻油脚卵磷脂得率的影响

由图2 可知,乙醇的体积分数在80%～95%的区间时,卵磷脂得率随着体积分数的增加而增加,原因可能是卵磷脂化学结构中包含有亲脂性的脂肪烃基团及亲水性的基团(磷酸和胆碱),乙醇的体积分数较低即溶液的含水量较高时,卵磷脂易吸水膨胀形成胶体物质导致其溶解性下降不易被提取,但随着乙醇的体积分数不断增加,其极性可能和卵磷脂的极性逐渐接近,故根据相似相溶原理其溶解度不断增加.当乙醇的体积分数超过95%时,卵磷脂得率反而降低的原因可能是此时萃取溶剂的特性与卵磷脂的性质偏差过大,不利于卵磷脂的提取.因此选用体积分数为95%的乙醇作为萃取剂进行卵磷脂的超声辅助提取较适宜.

图2 不同体积分数的乙醇对黑芝麻油脚卵磷脂得率的影响

3.1.2 不同料液比对黑芝麻油脚卵磷脂得率的影响

由图3 可知,随着料液比的增加即乙醇溶液用量的增加,卵磷脂得率也呈现逐渐增加的变化趋势,原因可能是增加乙醇溶液的用量之后,使得乙醇溶液与油脚的接触更加充分,故卵磷脂被提取得更加充分.但是当料液比增加到1:12 时,卵磷脂得率的增加幅度趋于平缓,表明此条件下油脚中卵磷脂的提取量已经趋于平衡达到饱和,且后续萃取剂的回收利用成本增大,综合考虑选用1:10 的料液比进行超声辅助提取油脚中的卵磷脂较适宜.

图3 料液比对黑芝麻油脚卵磷脂得率的影响

3.1.3 超声温度对黑芝麻油脚卵磷脂得率的影响

由图4 可知,以40℃为分水岭,随着温度的上升或者下降,卵磷脂得率均呈现降低的现象,原因可能是: 当超声温度较低时,分子运动较为缓慢,不利于卵磷脂从黑芝麻油脚中转移进入乙醇溶液,故其得率较低;在一定范围内随着温度的上升,分子动能增加,传质阻力下降,有效促进了卵磷脂扩散进入乙醇溶液的速率,故其得率随之提高;超声温度超过40℃,加之卵磷脂溶于乙醇系放热反应等影响,可能导致部分卵磷脂的氧化及部分乙醇挥发而改变萃取剂的极性,最终出现卵磷脂得率随温度的升高而下降的变化趋势.故黑芝麻油脚卵磷脂的超声辅助提取温度选择40℃较适宜.

图4 超声温度对黑芝麻油脚卵磷脂得率的影响

3.1.4 超声时间对黑芝麻油脚卵磷脂得率的影响

由图5 可知,超声处理时间在20～35 min 之间时,卵磷脂得率随着超声处理时间的延长而逐渐提高.究其原因可能是油脚中物质的溶解扩散进入萃取溶剂需要一定的时间,故适当延长超声处理的时间有利于乙醇溶液将卵磷脂提取出来.当超声处理时间超过35 min 时,卵磷脂得率下降的原因可能是由于处理时间过长,导致部分乙醇挥发损失改变萃取剂的特性及其他杂质溶解转入萃取剂中所致.因此,超声处理的时间不宜过长,黑芝麻油脚卵磷脂的超声辅助提取时间选择35 min 较适宜.

图5 超声时间对黑芝麻油脚卵磷脂得率的影响

3.2 正交实验结果

依表2 分析比较各影响因素的kij(正交表中第j列因素i水平所对应的试验指标值之和的平均值),实际得到卵磷脂超声辅助提取的最优工艺组合(A3B3C2D3)与由表2 直观地找出卵磷脂提取的最佳水平组合(A3B3C2D1)不一致,故需做验证实验.在实际得到的最优水平组合条件下进行验证实验,得到卵磷脂得率(取3 次平行实验结果的平均值)为11.98 %,高于表2 中A3B3C2D1的得率,表明A3B3C2D3是真正的黑芝麻油脚卵磷脂超声辅助提取的最佳制备工艺组合.

表2 黑芝麻油脚卵磷脂超声辅助提取的正交实验结果

3.3 体外抗氧化活性实验结果

由图6可知,在一定浓度范围内,卵磷脂粗提物对DPPH自由基的清除能力随着其浓度的增加而增强,半数抑制浓度(IC50)值为0.46 mg/mL,表明黑芝麻油脚卵磷脂具有一定的抗氧化能力.相较于相同浓度下对照品维生素C,黑芝麻油脚卵磷脂对DPPH 自由基的清除效果总体上较弱,其原因可能是分离制备的卵磷脂纯度不够所致.

图6 黑芝麻油脚卵磷脂对DPPH 自由基的清除作用

4 结束语

黑芝麻油脚卵磷脂超声辅助提取的最优工艺条件为: 乙醇体积分数为95%,料液比为1:12,超声温度为40℃,超声时间为40 min.在此最优工艺条件下,黑芝麻油脚卵磷脂得率为11.98%.

体外抗氧化实验结果表明,黑芝麻油脚卵磷脂对DPPH 自由基具有一定的清除效果,IC50值为0.46mg/mL,比维生素C 清除DPPH 自由基的能力略弱.