标准盘星珊瑚的有性繁殖及早期发育

缪智渊，崔洲平，谢子强，杨小舟，王龙升，张树乐，2，陈伯贵，廖宝林，肖宝华，2

（1. 广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518120；2. 广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524088；3. 深圳市碧海蓝天海洋科技有限公司，广东 深圳 518120）

0 引言

珊瑚礁是地球上生物多样性最丰富、生产力较高的典型生态系统之一，被誉为“海洋中的热带雨林”，对调节全球气候和生态系统的平衡起着不可替代的重要作用[1］。近年来，受到海洋污染、海水变暖与酸化的影响，全球珊瑚礁生态系统退化严重[2-4］。研究表明，常规管理方式已无法逆转珊瑚礁退化的趋势[5］，需要采用珊瑚人工繁育的方式去恢复珊瑚礁生态[6］，[7］3437。珊瑚人工繁育分为无性繁殖与有性繁殖2 种方式，无性繁殖是以芽体分裂形式进行，也称断枝培育；有性繁殖以产生配子形式进行[8-9］。断枝培育因具有成本低、操作简单等优点，在珊瑚礁生态修复工作中应用较为广泛[10］。然而，单纯以无性繁殖技术开展珊瑚礁生态修复工作易造成珊瑚遗传结构单一、对环境适应能力差等问题。Edwards 等[11］发现，在自然海域移植断枝培育的珊瑚容易出现存活率低的现象。Soong等[12］发现，台湾南部海区移植的珊瑚在新环境中会出现死亡率高和生长速度慢等现象。珊瑚的有性繁殖具有遗传多样性高、繁殖力强和不伤及母株等优点[13-14］。珊瑚的有性繁殖还可用于珊瑚选择育种，提高珊瑚的抗逆性[7］3439。珊瑚有性繁殖在珊瑚礁生态修复工作中具有重要意义，而珊瑚胚胎和幼虫的存活及成功附着是有性繁殖过程中的关键环节。自20世纪80年代以来，国外关于石珊瑚的有性繁殖和早期发育的研究层出不穷。Babcock 等[15］于1981年首次揭示造礁石珊瑚的大规模产卵行为，并对澳大利亚大堡礁的32 种珊瑚的繁殖特性进行了研究。Fadlallah[16］129汇总了146种石珊瑚有性繁殖的相关研究，包括性别决定、配子发生、受精与胚胎发育等，为理解珊瑚在长期进化过程中形成的特殊生殖方式提供了重要信息。Richmond等[17］发现，不同地区的石珊瑚会根据其所在的当地环境条件调整生殖模式。目前，国外已从对珊瑚胚胎发育规律的研究转向酸化、悬浮泥沙、附着基对其发育的影响[18-20］。国内关于珊瑚有性繁殖方面的研究较少，起步较晚。2009 年，李元超等[21］56描述了佳丽鹿角珊（Aropora pulchra）的卵母细胞发育过程，并确定了排卵时间。随后，黄洁英等[22］67观察并记录了膨胀蔷薇珊瑚（Montipora turgescens）和壮实鹿角珊瑚（Acropora robusta）受精卵发育的过程。此后，三亚风信子鹿角珊瑚（Acropora hyacinthus）、黄癣盘星珊瑚（Dipsastraea favus）与肉质扁脑珊瑚（Platygyra carnosa）的胚胎及幼虫发育特征也相继被报道[23］65，[24］87。

标准盘星珊瑚（Dipsastraea speciosa）属于刺胞动物门（Cnidaria）、珊瑚虫纲（Anthozoa）、六放珊瑚亚纲（Hexacorallia）、石珊瑚目（Scleractinia）、裸肋珊瑚科（Faviina）、盘星珊瑚属（Dipsastraea），其生长形态为团块形和表覆形，群体颜色多变，是深圳附近海域常见的种类，同时，也是研究珊瑚礁生态系统健康状况的指标生物[25］。标准盘星珊瑚在2008年被列入IUCN 红色名录，虽然级别为“无忧（least Concern）”，但其种群数量呈下降趋势。目前，标准盘星珊瑚胚胎和幼虫的发育过程尚未见报道。本研究对标准盘星珊瑚胚胎和幼虫发育的过程进行了观察和描述，以便更深入了解石珊瑚胚胎和幼虫发育的规律，旨在为珊瑚礁的人工有性繁殖提供理论基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

标准盘星珊瑚母株于2018年5月在广东省深圳市大鹏新区的洋筹湾海域（114°28′45.5″N，22°29′54.9″E）采集，共采集亲本4株，每株直径为17～22 cm。

将珊瑚母株迅速运回实验室，运输过程中采取措施避光，随后在人工条件下进行暂养。对采集的珊瑚的骨骼与性腺进行形态学鉴定，筛选出性腺正在发育且尚未进行有性繁殖的样品。实验结束后，将母株珊瑚移植回海区。

1.2 设备与器材

实验开始前在室内养殖系统中暂养，室内系统条件为：水温26～28 ℃，盐度32～35，溶解氧7.71～7.84 mg·L-1，pH 8.0～8.3。

实验开始后胚胎相继在17 L 孵化桶和200 L 孵化池中发育，期间水质条件为：水温26～28 ℃，盐度32～35，pH 8.1～8.3。

1.3 实验方法

在月圆（2018年5月31日）后，每夜6：00—10：00间观察标准盘星珊瑚是否排卵。当珊瑚排卵后，采用广东海洋大学深圳研究院发明的珊瑚精卵收集装置（专利号：ZL201921469938.2）采集精卵。将精卵搅拌混合，进行人工授精。待受精卵开始分裂时，将其转移至孵化桶中，微打氧，每隔15 min搅拌水体1次。按照胚胎发育时期定期取样，使用Motic生物显微镜观察胚胎发育情况并拍照记录，从受精开始每隔1 h进行1次镜检，原肠期后，3 h进行1次镜检，发育1.5 h统计受精率。当胚胎发育至浮浪幼虫期时，将其转移到浸泡有陶瓷附着板的孵化池中附着发育。

从孵化容器中随机收集100～200粒卵，放入培养皿，利用显微镜进行观察，辨别受精与否。重复取样2次，求其平均值，统计受精卵数占取样卵数的百分比，其计算公式为

其中：R为受精率（%）；X1为受精卵数（粒）；X2为取样总卵数（粒）。

收集珊瑚卵，用2.5 mL 吸管取样1 mL，统计珊瑚卵数量，重复3 次，取其算术平均值，珊瑚排卵数计算公式为

其中：N为珊瑚排卵数（粒）；n为单位体积水珊瑚卵的平均粒数（粒·mL-1）；V为全部养殖水体的总体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 标准盘星珊瑚有性繁殖过程

标准盘星珊瑚在室内暂养1 个月，2015 年6 月3 日，发现部分标准盘星珊瑚有排卵现象，即珊瑚杯隆起，粉红色的卵包从口盘处挤出。此次排卵于月圆后3 d 开始，共持续了3 d，在最后1 d 排卵量达到最大。标准盘星珊瑚为雌雄同体，所排出的卵子呈粉红色球形浮卵，直径为（350±30）μm。在受精后1.5 h ，观察到部分受精卵开始卵裂并进入卵裂期。据统计，本次约排出珊瑚卵2.3×106粒。

2.2 标准盘星珊瑚早期发育过程

标准盘星珊瑚胚胎从受精发育至附着共历时109 h，根据形态特征可分为受精卵、囊胚期、原肠胚期、浮浪幼虫期、附着期5个阶段（表1）。

表1 标准盘星珊瑚早期发育过程

观察发现，受精1.5 h 后，标准盘星珊瑚受精卵首次发生卵裂，分裂成2 个大小相等的分裂球。此时，经过显微镜统计，发现其受精率为70%。受精2.5 h后，胚胎再次分裂进入4细胞时期。1 h后，分裂进入16细胞期，胚胎中间出现空腔（图1b）。

图1 标准盘星珊瑚早期发育过程

在受精7 h 后，标准盘星珊瑚胚胎发育至囊胚期。在囊胚早期时，形状逐渐呈虾片状，出现假胚孔（图1h）。随后，假胚孔内的凹度逐渐加大（图1i），胚胎表面变得光滑，形状由虾片状转变为圆球状。受精后13 h，进入囊胚晚期，假胚孔逐渐消失（图1j）。

受精15.5 h 后，胚胎进入原肠胚阶段。原肠早期，在胚胎表层的随机位置开始内陷，出现新胚孔。受精18.5 h 后进入原肠中期，胚胎内陷逐渐加深，内陷的细胞逐渐分化成内胚层细胞，形成双胚层。受精后22 h 进入原肠晚期（图1m），胚孔开始逐渐收缩，胚胎形状不断拉长，形状呈椭圆状。原肠末期，胚孔收缩完成，形成原口，这也标志着原肠胚阶段的结束。

受精32.5 h后，胚胎发育成为浮浪幼虫。浮浪幼虫早期，幼虫的形态保持椭圆状，外层细胞出现纤毛，初具运动能力（图1n）。浮浪幼虫晚期，内胚层的肠系膜形成，运动能力进一步增强，开始四处游动（图1o）。

受精109 h后，进入附着期。浮浪幼虫开始在孵化池内寻找适合的基质，尝试附着（图1p）。附着时，幼虫原口朝上，另一端位置向下接触基质。附着完成后，浮浪幼虫从椭圆状变为扁平的圆盘状（图1q）。

3 讨论

3.1 标准盘星珊瑚的排卵行为

珊瑚可分为雌雄同体和雌雄异体两类，大多数的石珊瑚属于雌雄同体，也就是在成熟的珊瑚单体内同时具有精巢与卵巢，如深圳附近海域常见的鹿角珊瑚属、盘星珊瑚属、角蜂巢珊瑚属珊瑚。另一些珊瑚则属于雌雄异体，深圳常见的雌雄异体珊瑚有：牡丹珊瑚属、陀螺珊瑚属、盔形珊瑚属以及滨珊瑚属珊瑚。此外，造礁石珊瑚有性繁殖策略多样，有直接排放幼虫与体外受精2 种[16］129，[26］。排幼型珊瑚会直接排出珊瑚幼虫，如星排孔珊瑚（Seriatopora stellata）、鹿角杯形珊瑚（Pocillopora damicornis）。而体外受精的珊瑚在产卵时排放的配子一般有3种[27］：雌雄同体的珊瑚种类会排出同时含有精子和卵子的卵包，如黄癣盘星珊瑚（Favia favus）、肉质扁脑珊瑚（Platygyra carnosus）与指形鹿角珊瑚（Acropora digitifera）等；雌雄异体的珊瑚种类会排出卵子与精子，如肾形陀螺珊瑚（Turbinaria reniformis）、丛生盔形珊瑚（Galaxea faseieularis）、斯氏伯孔珊瑚（Bernardpora stutchburyi）等。本研究观察到标准盘星珊瑚为雌雄同体，行体外受精，并且排放配子的形式为有精子和卵子的卵包。

通常珊瑚性成熟需要1～5 年，性成熟后的珊瑚会选择月圆之夜的前后几天进行排卵[28］。珊瑚排卵的具体时间存在种间差异，并且会受到温度、光照和潮汐等因素影响[29-30］。膨胀蔷薇珊瑚、壮实鹿角珊瑚的排卵时间为月圆后的6 d；风信子鹿角珊瑚产卵时间在月圆后2～3 d；多孔鹿角珊瑚在月圆后3～7 d。标准盘星珊瑚排卵时间会受到月光的影响，缺少月光照射会推迟排卵时间[31］。本研究中，直径为17～22 cm 的标准盘星珊瑚产卵时间为月圆后第3天，在之后2 d均有排放，在第3天排卵规模最大。

3.2 标准盘星珊瑚胚胎及幼虫发育的特点

本研究中，标准盘星珊瑚在受精2 h后，发生首次卵裂。受精7 h后，胚胎进入囊胚期，形态变为扁平的虾片状再变为圆球状。受精15 h 后，胚胎进入原肠胚期，呈椭圆状，胚孔逐渐收缩，形成原口，变为浮浪幼虫，此阶段共经历了32.5 h。受精109 h 后，浮浪幼虫开始在实验容器内寻找基底并尝试附着。受精7 d 后幼虫附着完成，由原来拉长圆柱状向基质水平面拉伸变为扁平的圆盘状，口盘朝上。标准盘星珊瑚发育至浮浪幼虫的时间相比于壮实鹿角珊瑚与黄癣盘星珊瑚要早，与蔷薇珊瑚的34 h较为接近。此外，相同水温下孵化的黄斑盘星珊瑚，胚胎发育的时间相差较大[24］89，[32］，因此，影响石珊瑚胚胎发育时间的因素需要更深入的研究。

石珊瑚可分为坚实型类群和复合型类群两类[33］。坚实型珊瑚具有坚实的骨骼结构，外观单一，以团块状与碟片状为主，如星群珊瑚科、筛珊瑚科、石芝珊瑚科及同星珊瑚科等；而复合型珊瑚骨骼钙化程度较低，形态复杂多样，如鹿角珊瑚科、菌珊瑚科、真叶珊瑚科与滨珊瑚科等[23］70。坚实型珊瑚与复合型珊瑚不仅在外观上有区别，还在系统发育进化树聚类结果与胚胎发育过程存在较大差异[34-36］。坚实型珊瑚在原肠胚期形成之前，会存在一个暂时内陷的假胚孔，假胚孔会在原肠胚形成之前消失。原肠胚期胚胎表面会出现真正的胚孔并内陷发育形成双胚层。而复合型珊瑚在原肠胚形成前不存在假胚孔。本研究发现标准盘星珊瑚胚胎的发育过程属典型的坚实型珊瑚胚胎发育类型，出现过2 个胚孔，且仅第2 次内陷与内胚层形成有关。

标准盘星珊瑚的胚胎发育以及幼虫附着的研究有助于更深入地了解我国造礁石珊瑚的有性繁殖行为及其早期幼虫的发育机制，为石珊瑚人工有性繁殖提供理论基础数据。