儿童特应性皮炎中医辨证分型特点及各证型的免疫表型研究*

翟盼盼，黄岩杰，**，梅晓峰，李佳佳，李秀敏，张霞，翟文生，任献青，丁樱，薛晨红，钱革，苗明三

（1.河南中医药大学第一附属医院 郑州 450000；2.河南中医药大学 郑州 450000；3.纽约医学院微生物学与免疫学系 纽约 10595；4.河南省人民医院 郑州 450000；5.河南省儿童医院 郑州 450000）

特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一种高度异质性的慢性炎症性皮肤病，可间断急性发作，主要以剧烈瘙痒、反复湿疹样皮损和皮肤干燥为主要特征，并伴有鼻炎或哮喘等过敏病史[1]。近几十年来，随着环境污染的加重，本病的发病率在逐年增高[2]，据报道，90%的AD患儿在5岁之前发病[3]。本课题组前期总结了AD的中医病机主要在于肺脾阴阳失调，津液输布失常，心火湿热搏于肌肤，寒热错杂[4]。中医治疗可调节机体的阴阳失衡状态，远期疗效满意，安全性高，易于被家长接受。然而儿童AD的中医证型分布是否具有独特性？本文采用2013年中华中医药学会皮肤科专业委员会制定的《特应性皮炎中医诊疗方案专家共识》[5]中的辨证分型标准，进一步总结儿童AD的中医证型分布特点。

免疫异常是AD的关键发病机制，儿童AD存在T细胞亚群的异常激活，T细胞过度分化为Th2细胞，产生白细胞介素4（Interleukin-4，IL-4）和白细胞介素5（Interleukin-5，IL-5）等Th2细胞因子，并诱导免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE）合成，肥大细胞活化和外周血嗜酸性粒细胞（Eosinophil，Eo）增多[6]。随着免疫学研究的逐步深入，有报道Th17细胞产生的白细胞介素17（Interleukin-17，IL-17），以剂量依赖性方式降解皮肤中紧密连接的关键成分claudin-1和claudin-4蛋白，从而破坏AD患者的皮肤屏障[7]。目前疾病管理并没有充分考虑上述免疫功能的紊乱在儿童AD的不同证型间是否存在差异，忽略了基于不同证型的针对性治疗。为阐明这一科学问题，本研究深入探索了不同证型AD儿童Th1/Th2/Th17的免疫表型，对于揭示儿童AD不同证型的免疫表型特点，探寻疗效评价的客观指标和制定个体化的靶向治疗具有重要价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

通过对2018年4月—2020年12月就诊于河南中医药大学第一附属医院、河南省儿童医院、河南省人民医院的门诊及住院病例进行筛选，最终纳入159例AD患儿，年龄在6月-14岁。所有患儿西医诊断均符合Williams诊断标准[8]，中医辨证分型参照《特应性皮炎中医诊疗方案专家共识》[5]中的证型判定标准。100例正常对照组儿童来自河南省内自愿参加本研究的同龄儿童。本研究经河南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，取得了参与者或其监护人（家长）的书面知情同意。收集所有受试者的性别、年龄、个人及家族过敏史以及近3月的用药明细。

1.2 诊断标准及中医辨证分型标准

西医诊断标准参照Williams诊断标准[8]。中医辨证分型参照《特应性皮炎中医诊疗方案专家共识》中的证型判定标准[5]，具体如下：心脾积热证：脸部红斑、丘疹、脱屑或头皮黄色痂皮，伴糜烂渗液，有时蔓延到躯干和四肢，哭闹不安，可伴有大便干结，小便短赤。指纹呈紫色达气关或脉数；心火脾虚证：面部、颈部、肘窝、腘窝或躯干等部位反复发作的红斑、水肿，或丘疱疹、水疱、或有渗液，瘙痒明显，烦躁不安，眠差，纳呆，舌尖红，脉偏数；脾虚蕴湿证：四肢或其他部位散在的丘疹、丘疱疹、水疱，倦怠乏力，食欲不振，大便溏稀，舌质淡，苔白腻，脉缓或指纹色淡；血虚风燥证：皮肤干燥，肘窝、腘窝常见苔藓样变，躯干、四肢可见结节性痒疹，继发抓痕，瘙痒剧烈，面色苍白，形体偏瘦，眠差，大便偏干，舌质偏淡，脉弦细。

1.3 纳入及排除标准

纳入标准：①按照Williams诊断标准[8]确诊为AD；②年龄在6月-14岁；③患儿及家长自愿参加临床试验且依从性好，并签署知情同意书。排除标准：①呼吸道感染；②近1个月内服用抗生素、激素等药物；③肝肾功能异常或患有严重系统性疾病、先天性疾病、免疫性疾病者；④排除接触性湿疹、药物诱发的湿疹样皮损、原发性牛皮癣等。

1.4 脱落及剔除标准

筛选合格入组的临床病例，在研究过程中，患儿因哭闹严重，无法完成抽血，或家长拒绝留取标本，无法完成相关评估项目者，应予以剔除。

1.5 观察指标及检测方法

取被检者静脉血2 mL，用电阻抗法在Pentra MS CRP全血细胞检测仪（法国）上检测外周血Eo计数。血清总IgE检测采用免疫比浊法在IMMAGE 800特定蛋白分析仪（Beckman美国）上检测。采用多微球流式免疫荧光仪（美国BD FACSCanto II）测定血清细胞因子，包括干扰素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）、IL-4、IL-5、IL-17（瑞斯凯尔公司，货号：190603）。

1.6 统计方法

采用SPSS 24.0统计软件对收集到的数据进行统计分析。计量资料釆用均数±标准差（±s）或中位数（M）和四分位数（P25，P75）描述，计数资料用频数和构成比描述。计量资料符合正态分布并且方差齐者，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，并采用LSD检验进行两两比较分析；计量资料不符合正态分布或方差不齐者，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。计数资料率和构成比采用χ2检验。采用双侧检验，P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 儿童AD的中医证型分布特点

对159例AD患儿进行中医证型辨证分析，心火脾虚证有61例，占比最高（38.4%），其次为血虚风燥证（22.0%）、心脾积热证（20.1%）、脾虚蕴湿证（19.5%）。皮尔森卡方检验未发现正常对照组与4个证型之间的性别构成差异，提示AD患儿的中医证型分布不受性别因素影响。与正常对照组儿童比较，4个证型中，心脾积热证AD患儿发病年龄最低（均数：2.80 vs. 4.64，P＜0.05）。与心脾积热证AD儿童比较，脾虚蕴湿和血虚风燥证AD儿童的发病年龄较大，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 不同组别的基线资料比较（n，±s）

表1 不同组别的基线资料比较（n，±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与心脾积热证比较，#P＜0.05。

组别正常对照组心脾积热证AD心火脾虚证AD脾虚蕴湿证AD血虚风燥证AD例数（%）100 32（20.1%）61（38.4%）31（19.5%）35（22.0%）性别（男/女）53/47 20/11 33/28 18/14 21/14年龄（岁）4.64±3.15 2.80±2.79*4.03±3.46 4.33±2.63#5.29±3.07#

2.2 不同证型AD患儿的细胞因子比较

与正常对照组比较，4个证型的AD患儿血清中Th1型细胞因子IFN-γ的水平均无统计学差异（图1A）。与正常对照组0.31±0.23 pg·mL-1比较，血清中Th2型细胞因子IL-4的水平在心脾积热组1.82±1.49 pg·mL-1、心火脾虚组1.23±1.34 pg·mL-1、脾虚蕴湿组1.43±1.21 pg·mL-1和血虚风燥组1.97±1.60 pg·mL-1患儿中均显著升高（P＜0.05）（图1B）；与正常对照组1.27±1.30 pg·mL-1比较，血清中Th2型细胞因子IL-5的水平在心脾积热组3.29±2.16 pg·mL-1和血虚风燥组2.57±1.59 pg·mL-1患儿中显著升高（P＜0.05）（图1C）；与正常对照组0.53±0.33 pg·mL-1比较，血清中Th17型细胞因子IL-17的水平在心脾积热组3.46±3.75 pg·mL-1、心火脾虚组2.08±1.84 pg·mL-1和血虚风燥组2.42±1.16 pg·mL-1患儿中显著升高（P＜0.05）（图1D）。

图1 不同组别细胞因子的比较

2.3 不同证型AD患儿的外周血Eo计数和血清总IgE水平

与正常对照组儿童比较，心火脾虚证、脾虚蕴湿证和血虚风燥证AD患儿外周血Eo计数均明显升高（P＜0.05），心脾积热证AD外周血Eo计数有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常对照组儿童比较，心火脾虚证AD患儿血清总IgE水平明显升高（P＜0.05），脾虚蕴湿证和血虚风燥证AD血清总IgE水平有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 不同组别的外周血Eo计数和血清总IgE水平比较[n/M（P25，P75)]

3 讨论

AD是慢性复发性疾病，近几十年来，AD患病率逐渐增加，世界范围内儿童AD患病率可达15%-20%[9]，已成为全球社会共同面临的健康问题。一项关于用中药治疗AD小鼠的系统回顾和荟萃分析表明，中药能明显改善AD小鼠的皮肤炎症反应和瘙痒症状[10]。2020年中国AD诊疗指南中已明确将中医药纳入AD的治疗措施中，并重视对AD的辨证论治[11]。因此，总结儿童AD的常见证型分布，厘清病机演变对儿童AD的治疗尤为重要。本研究发现AD患儿以心火脾虚证型最多见，占比38.24%，说明本病的发病与心、脾两脏关系密切。这有别于成人AD以脾虚湿盛证（39.47%）和血虚风燥证（31.58%）多见[12]。黄楚君等[13]基于30部古代经典著作，筛选出48条包含AD病因病机条文，结论也显示AD的核心病机为心火及脾虚，病性属本虚标实，临床以健脾清心祛邪为治则进行论治。林银哲等[14]调查了广州市112例AD患儿，将其分为心火脾虚、阴阳失调、脾虚失运、脾虚湿困、脾虚血燥、血虚风燥、风湿热症等7个证型进行了辨证研究，也发现心火脾虚证为儿童AD最常见的证型（28.6%），这与我们的结果一致。本研究还发现儿童AD的中医证型分布受年龄影响较大，在（2.80±2.79）岁以下的AD患儿中，心脾积热证是主要证型，提示幼儿阶段，部分AD患儿可因“心常有余”、胎热湿毒和喂养过度致使脾胃积热，心火内生，抟结于肤，发为皮疹，常见于AD急性期，为实证。因此，临床辨证论治时还需考虑年龄特点。心为阳中之太阳、属热属火，小儿心常有余，易受内外因之干扰，扰动心阳，脾常不足，脾胃之体成而未全，脾胃之气全而未壮，若家长缺乏育儿知识，喂养不当，损伤脾胃，易助湿生热。且心主血脉，其华在面，心经火热与脾经湿热同气相求，火性燔灼上炎于头面，郁炽于血脉，热盛肉腐，则可发为皮疹，这与临床上婴幼儿期皮疹主要始发于面颊部、额部和头皮，逐渐发展至躯干和四肢伸侧的发病特点相符。

在儿童AD的辨证分型中引入现代免疫学指标有利于中医辨证分型的标准化，寓证于病，从病识证，融会贯通，采取微观与宏观相结合、中医和西医相融合的诊断模式，从而为儿童AD的诊疗提供更有效的临床策略，为下一步开发研制出针对不同证型的药物提供研究证据。本研究发现4个不同证型的AD患儿均存在Th2免疫失衡。Th2免疫失衡是AD中最早被发现的免疫失衡机制，多项临床研究和动物模型已证实Th2细胞的标志性细胞因子IL-4和IL-5在AD中普遍升高[15-16]。IL-4是B细胞的生长因子，是免疫球蛋白向IgE发生类别转化的起始因子。动物实验发现DNCB刺激的AD小鼠模型，血清中IL-4明显升高，而IFN-γ变化不大且没有差异[15]。IL-4受体拮抗剂度普利尤（Dupilumab）在临床用于治疗AD，疗效显著，进一步支持了AD中Th2型免疫途径的重要性[17]。IL-5能够刺激Eo增殖、分化及活化，不仅使Eo的数量增加，而且能增强其功能。IL-5受体拮抗剂美泊利珠单抗（Mepolizumab）在中重度AD治疗中的有效性和安全性目前尚在临床研究中[18]。近年有多项研究报道，中药可通过调节细胞因子的表达水平来调节机体的免疫机能[19-20]。当归补血汤可有效减轻AD模型小鼠的皮肤炎症、减少肥大细胞、嗜酸性粒细胞的浸润，并可显著降低血清IgE水平及Th2型相关细胞因子IL-4、IL-5水平[21]。本课题组既往研究发现由乌梅丸化裁而成的FAHF-2复方制剂既能直接抑制小鼠肥大细胞和嗜碱性细胞的脱颗粒，降低IL-5水平，又能增加IFN-γ和IL-10的分泌[20]。因此，在准确辨证的基础上，中药具有可靠的多靶点调节免疫功能的优势。

尽管所有的AD亚型都有Th2激活[22]，但针对Th2免疫失衡治疗的dupilumab单抗仅对约三分之一的AD患者治疗有效[23]，因此，需要额外的靶向治疗来解决AD不同亚型的免疫失衡问题。研究表明，与欧洲AD患者相比，中国AD患者皮损中Th17表达更高，而IFN-γ等Th1相关的细胞因子水平较低[24]。Th17细胞因子IL-17不仅可以通过抑制AD患者皮肤中丝聚蛋白的表达而加重表皮屏障的缺陷，还可扰乱编码角质形成细胞黏附分子的基因的调节[25]，在AD病变皮损中的表达水平显著升高，且与疾病严重程度相关[26]。因此，升高的IL-17可能是导致AD皮损加重的主要病理因素。本研究发现心脾积热证、心火脾虚证和血虚风燥证AD患儿以Th2/Th17免疫失衡为主，提示这3种证型存在更严重的T细胞活化和分化的功能紊乱。除上述T细胞因子失衡外，本研究还观察到心火脾虚证、脾虚蕴湿证、血虚风燥证均可见外周Eo计数升高，其中，心火脾虚证还同时伴有血清IgE水平升高，表明心火脾虚证AD患儿存在更严重的免疫失衡，这也与心火脾虚AD患儿虚实夹杂、寒热错杂、阴阳失衡的中医病机特点非常契合。因此，临床上可通过中药泄实补虚、平衡阴阳的辨证施治，达到调节AD患儿免疫紊乱的作用，并可用Eo和IgE作为疗效评估指标。

综上所述，在不同证型的AD儿童中，心火脾虚证型最多见，但在（2.80±2.79）岁以下，以心脾积热证为主要证型。此外，本研究初步探索了不同证型AD患儿的免疫失衡特点，发现4个不同证型AD均存在Th2免疫失衡；心火脾虚、血虚风燥和心脾积热证同时存在Th2/Th17免疫失衡，升高的IL-17可能是导致这3个证型皮损加重的主要病理因素。在未来的研究中，通过探索不同证型AD的免疫机制，了解AD不同证型的免疫表型特点，为进一步制定更有针对性的中西医结合治疗方案提供指导，也为初步探索中医药辨证治疗AD的分子生物学机制提供思路。