基于UPLC-Q-Exactive/MS技术整合网络药理学探讨柴胡桂枝汤治疗流感继发细菌性肺炎的作用机制*

韩雨秀，张静，罗竣瑜，贾艳铤，许金珂，孙启慧，王旭，杨勇，容蓉**

（1.山东中医药大学药学院 济南 250355；2.山东省疾病预防控制中心 济南 250014；3.山东中医药大学实验中心 济南 250355；4.中医药经典理论教育部重点实验室 济南 250355；5.中医药基础研究山东省重点实验室济南 250355；6.山东省中医药抗病毒工程研究中心 济南 250355）

流感是一种因流感病毒感染引起的呼吸道传染性疾病，会在全球流行，极易出现高发病率和高死亡率[1]，流感病毒感染导致的高死亡率往往与其流行期间的继发细菌感染密切相关[2]。1918年的“西班牙流感”是历史上最严重的流感大流行，近5000万患者死亡，其中90%以上存在由肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等引起的继发细菌感染[3]。流感继发细菌性肺炎临床表现为反复感冒、咳嗽、痰喘、哮鸣[3]，病情时缓时著，中医认为该病为表未尽而正已虚，枢机失利，病在少阳兼及太阳，可采用柴胡桂枝汤（CGD）和解表里，调和营卫，疏利枢机法论治[4]。CGD由小柴胡汤和桂枝汤加减而来，由柴胡、桂枝、芍药、黄芩、半夏、甘草、大枣、党参、生姜等9种药材组成[5]，临床常用于治疗太少同感[6-7]、发热[8]、咳嗽[9]等。现代药理学研究表明CGD具有抗呼吸道病毒[10]、抗炎退热[11]、免疫调节[12]等作用，现代临床研究也证实CGD对治疗呼吸道感染引起的肺炎有效，用于治疗反复呼吸道感染的患者，可使其临床症状减轻[13]。戴思思等[14]采用CGD治疗呼吸道病毒感染患者，结果治疗组的总有效率为98.20%，优于对照组的88.00%。于小红等[15]研究发现，CGD联合替加环素对鲍曼不动杆菌肺炎有一定的干预效果，可以减少大鼠肺组织炎性损伤程度及细菌数量。然而CGD治疗流感继发细菌性肺炎的作用机制和物质基础尚不清楚。网络药理学从系统生物学和多向药理学演变而来，将“一个药物、一个靶标、一种疾病”的模式转变为“网络靶标-多组分治疗”的模式，从而使揭秘活性成分与靶点之间的复杂关系成为可能[16-17]，但未见中医药治疗流感继发细菌性肺炎相关研究报道。

本研究通过UPLC-Q-Exactive/MS分析鉴定CGD中的主要化学成分，结合网络药理学探究其干预流感继发细菌性肺炎的可能机制，并采用分子对接及动物实验进行验证。

1 实验材料

1.1 药材

柴胡（批号：17090609）；桂枝（批号：17092603）；黄芩（批号：17041516）；党参（批号：17071565），均产自山西；白芍（批号：17072801产地安徽）；姜半夏（批号：17071501产地贵州）；炙甘草（批号：17082005产地内蒙）；大枣（批号：17081603产地新疆维吾尔自治区）；生姜（批号：17030803产地云南）。

1.2 试剂

肉桂酸（≥98%，批号AA0807DA14）；芍药苷（≥98%，批号27F8C0162）；黄芩苷（≥98%，批号D23S7F21640）；甘草苷（≥98%，批号D25J7F18328）；没食子酸（≥98%，批号Y19M8C36143）；芍药内酯苷（≥98%，批号Y25F8H30152）；苯甲酸（≥98%，批号Z18S7H21155）；香豆素（≥98%，批号Y24O7C23495）；(-)-甘草素（≥98%，批号W22A7K13544）；槲皮素（≥98%，批号C20J6Y1722）；黄芩素（≥98%，批号1209A022）；甘草酸（≥98%，批号P04N7F24311）；邻甲基肉桂醛（≥98%，批号P04S7F23015）；千层纸素（≥98%，批号Q-020-161121）；汉黄芩素（≥98%，批号P04A7F18933）以上标准品均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈色谱级购自Merck，Germany；甲酸色谱级购自Tedia，USA；无水乙醇购自中国医药集团化学试剂公司。甲型流感病毒H1N1/PR8株（于山东中医药大学抗病毒协同创新中心-80℃保存），尿囊液（在9日龄SPF鸡胚中扩增得到，以测定血凝效价）；金黄色葡萄球菌（保存于山东中医药大学抗病毒创新中心）；达菲（上海罗氏制药有限公司，批号：M1050）。

1.3 仪器

Thermo Fisher UltiMate 3000液相色谱系统（美国，Thermo fisher公司）；Thermo Fisher Q Exactive高分辨质谱仪（美国，Thermo fisher公司）；十万分之一电子分析天平（BT125D，赛多利斯科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪（EYELAN-1100，日本东京理化器械株式会社），荧光定量PCR仪（伯乐公司，型号：CFX Connect，美国）。

1.4 数据库与软件

Swiss Target Prediction平台（http://www.swiss target prediction.ch/）；DisGeNET平台（https://www.disgenet.org/）；OMIM平台（https://www.omim.org）；Cytoscape3.8.0软件；Metascape数据库（https://metascape.org/gp/index.html）；Uniprot数据库（https://www.uniprot.org），Xcalibur3.0软件。

1.5 实验动物

雄性BALB/c小鼠32只，体重（19±1）g。饲养于山东中医药大学抗病毒协同创新中心【SYXK（鲁）2017-0022】。饲养期间各组大鼠自由饮水，饲喂普通维持饲料由济南朋悦实验动物繁育有限公司【SCXK（鲁）2018-0003】提供。饲养环境：昼夜各半循环照明，湿度恒定，温度控制在22-25℃。所有操作山东中医药大学实验动物福利伦理审查委员会审查通过。

2 方法

2.1 CGD治疗流感继发细菌性肺炎的疗效

2.1.1 CGD样品制备

分别称取桂枝、黄芩、党参、白芍、生姜、大枣各4.5 g，甘草3 g，柴胡12 g，姜半夏7.5 g，加入水，30 min浸泡，（每次40 min，3次）煎煮，过滤后，浓缩至生药材0.5 g·mL-1，冷冻干燥，得CGD冻干粉相当于生药材10 g·g-1。

2.1.2 动物造模、分组及给药

将小鼠按体重随机分成4组，为正常组、模型组、达菲组、CGD组，每组8只。各组小鼠在异氟烷麻醉下，第0天正常组滴鼻生理盐水，其余组滴鼻0.25 TCID50的H1N1/PR8，每只20 µL并移至另室饲养。第3天模型组、达菲组、CGD组滴鼻金黄色葡萄球菌2.5×107CFU，每只20 µL。第1天达菲组（达菲，19.5 mg·kg-1），柴胡桂枝汤组（6.2 g·kg-1）灌胃给药。观察实验动物状态、每天记录生存率、体重。取肺、脾、胸腺，计算脏器指数。取20 mg肺组织采用涂布法对细菌载量进行检测。

2.1.3 RT-qPCR检测肺组织中M mRNA的相对表达量

15-20 mg肺组织加入300 µL RL裂解液，研磨成匀浆，按照动物组织总RNA提取试剂盒方法操作，测定总RNA浓度，反转录得到cDNA。建立20 µL的RT-qPCR反应体系，放入荧光定量PCR仪中扩增，95℃预变性15 min，95℃变性10 s，40个循环，66℃退火/延伸32 s，40个循环。实验后记录Ct值，通过计算2-ΔΔCt得到mRNA的相对表达量。流感病毒M基因引物序列F：5’-CTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’，R：5’-CGTCTACGCTGCAGTCCTC-3’，产物长度227 bp。内参基因PPIA引物序列F：5’-CGCTTGCTGCAGCCA TGGTC-3’，R：5’-CAGCTCGAAGGAGACGCGGC-3’，产物长度86 bp。

2.2 基于网络药理学CGD治疗流感继发细菌性肺炎的机制

2.2.1 CGD的化学成分表征

色谱条件：Halo C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，2.7 µm），流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：乙腈，梯度洗脱条件：0-3 min，5% B；3-10 min，12% B；10-18 min，23% B；18-23 min，23% B；23-50 min，28% B；50-60 min，62% B；60 min，100%B；进样体积：5.0 µL；流速：0.3 mL·min-1，柱温：35℃。

质谱条件：离子源：ESI，毛细管温度：350℃，毛细管电压：3500 V，鞘气45 arb，辅助气10 arb，源内温度350℃，分辨率为70 000，质谱采集范围50-1500 m·z-1。

通过文献检索，建立复方中生物碱、皂苷、有机酸、黄酮等类型化学成分数据库。使用Xcalibur3.0软件，结合本实验已有对照品的LC-MS数据，对获取的质谱数据进行分析。

2.2.2 网络药理学研究CGD治疗流感继发细菌性肺炎的机制

（1）CGD治疗流感继发细菌性肺炎的潜在作用靶点的筛选

基于LC/MS分析鉴定出的化学成分作为目标成分，利用Swiss Target Prediction平台预测出CGD的靶点。以“Pneumonia, Viral”，“Pneumonia and influenza”，“Secondary bacterial pneumonia”，“Staphylococcus Aureus Pneumonia”，“Pneumonia due to influenza”，“Pneumonia”，“Pneumonia caused by influenza”作为关键词，通过DisGeNET平台进行检索，以“influenza”为关键词，通过OMIM平台检索流感继发细菌性肺炎相关靶点。

（2）PPI网络的构建

利用string平台将共有靶点进行拓扑，设置蛋白最低置信度为0.400，将下载的TSV文件利用CytoScape3.7.2软件构建蛋白相互作用的PPI网络并进行拓扑分析。

（3）KEGG富集分析

采用Metascape数据库，以P＜0.01、最小计数为3且富集因子＞1.5为筛选条件对潜在靶点进行KEGG通路富集分析，对排名前19的KEGG条目进行可视化处理。

（4）GO富集分析

采用Metascape数据库对潜在靶点进行GO功能富集分析，以P＜0.01、最小计数为3且富集因子＞1.5为筛选条件，对排名前10的GO条目进行可视化处理。

（5）“成分-靶点-通路”网络的构建

利用CytoScape 3.7.2软件将“成分-靶点-通路”图可视化。

2.3 靶点验证

2.3.1 CGD主要成分-流感继发细菌性肺炎靶点的分子对接

利用AutoDockTools-1.5.6软件将“成分-靶点-通路”网络Degree值最高的3个成分：千层纸素A-7-Oβ-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、汉黄芩素与TNF、PTGS2、EGFR靶点逐一进行对接。

2.3.2 RT-qPCR检测肺组织中核心靶点mRNA的相对表达量

实验方法如3.1.3所示，EGFR基因引物序列F：5’-TCCTGATTGGTGCTGTGCGATTC-3’，R：5’-CAACTG CTCGGATGGCTCTGTAAG-3’，产物长度133 bp。PTGS2基因引物序列F：5’-CTGGTGCCTGGTCTGATG ATGTATG-3’，R：5’-GGATGCTCCTGCTTGAGTATGT CG-3’，产物长度83 bp。TNF-α基因引物序列F：5’-AAGCATGATCCGAGATGTG-3’，R：5’-CCGAAGTTC AGTAGACAGAA-3’，产物长度150 bp。

2.4 数据处理

以平均值±标准误（xˉ±SEM）表示各样本数据，用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析及LSD组间比较。以P＜0.05表示差异具有显著性。

3 结果

3.1 CGD对流感-金黄色葡萄球菌的干预作用

正常组的小鼠饮水量和饮食量正常，毛发光滑，反应灵敏，体重持续上升；模型组小鼠在第4天体重开始下降，蜷卧懒动、反应迟钝、毛色黯淡、体形消瘦；CGD组小鼠表现出一定的回调。模型组生存率为50%，达菲组和CGD组生存率为87.5%。与模型组相比CGD组小鼠胸腺指数显著升高（P＜0.05），与模型组相比CGD组小鼠肺指数、MmRNA的相对表达量、细菌载量显著降低（P＜0.05）表明CGD对流感继发细菌性肺炎有较好的治疗作用（图1-3）。

图1 各组小鼠生存率和体质量变化

图2 各组小鼠脏器指数变化

图3 各组小鼠M基因相对表达量和细菌载量变化

3.2 基于网络药理学CGD治疗流感-金黄色葡萄球菌的机制

3.2.1 CGD的UPLC-Q-Exactive/MS分析结果

采用UPLC-Q-Exactive/MS技术，检测得到CGD复方中各化学成分的总离子流图见图4；结合对照品及建立的化学成分库进行化学成分表征，鉴定了51个化合物，结果见表1。

图4 CGD UPLC-Q-Exactive/MS分析的负离子模式总离子流图

3.2.2 CGD治疗流感继发细菌性肺炎的潜在作用靶点

利用Swiss Target Prediction平台预测出CGD靶点463个。通过DisGeNET平台检索流感继发细菌性肺炎相关靶点，得到1042个疾病靶基因，Venn对成分和疾病靶点进行分析，共获得107个交集靶点，为CGD治疗流感继发细菌性肺炎的潜在作用靶点。

构建PPI网络并进行拓扑分析，结果见图5，排名前10位的为核心靶点：TNF、AKT1、ALB、VEGFA、MAPK3、PTGS2、STAT3、EGFR、TLR4、PPARG。

图5 CGD治疗流感继发细菌性肺炎的PPI网络

3.2.3 CGD治疗流感继发细菌性肺炎的潜在作用通路

采用Metascape数据库进行KEGG通路富集分析，结果见图6，节点越大，排名越靠前，表明存在该通路上潜在靶点数越多。排名前10通路有3条炎症、免疫相关通路：Fc epsilon RI信号通路、GnRH信号通路、NF-κB信号通路。

图6 CGD治疗流感继发细菌性肺炎的KEGG富集分析

GO功能富集分析，结果见图7。BP主要包括防御反应的调节、免疫效应过程等。MF主要涉及丝氨酸型肽酶活性、磷酸转移酶活等。CC主要涉及囊泡腔、膜面等。分析表明CGD可能通过增强免疫功能、提高防御能力、降低细菌的粘附、抵抗炎症反应等治疗流感继发细菌性肺炎。

图7 CGD治疗流感继发细菌性肺炎的GO分析

3.2.4 CGD治疗流感继发细菌性肺炎的潜在成分

构建“成分-靶点-通路”网络。图8显示千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（degree：34）、汉黄芩素（degree：33）、黄芩素（degree：33）、5,7,2’-Trihydroxyflavone（degree：32）、去甲汉黄芩素（degree：30），degree值大于30可能为CGD治疗流感继发细菌性肺炎的关键成分。

图8 CGD治疗流感继发细菌性肺炎的“中药成分-靶点-通路”

3.3 CGD治疗流感继发细菌性肺炎的潜在成分和靶点的验证

3.3.1 基于分子对接验证CGD治疗流感继发细菌性肺炎的成分

千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、汉黄芩素与PTGS2、EGFR有强亲和活性，可能为CGD治疗流感继发细菌性肺炎潜在成分，作用于关键疾病靶点PTGS2和EGFR而发挥作用。其中千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷也作用于TNF靶点发挥治疗作用。具体对接结果如表2、图9所示。

表2 TNF、PTGS2、EGFR与CGD中关键活性成分分子对接结果表

图9 分子对接结果示意图

3.3.2 基于RT-qPCR验证CGD治疗流感继发细菌性肺炎的靶点

与正常组相比，模型组TNF-α显著升高，EGFR、PTGS2显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，CGD干预后TNF-α显著降低，EGFR、PTGS2显著升高（P＜0.05）。上述结果表明CGD可能通过调节TNF-α、EGFR、PTGS2靶点来发挥治疗流感继发细菌性肺炎的作用（图10）。

图10 各组小鼠TNF-α、EGFR、PTGS2的mRNA的相对表达量结果图

4 讨论

本研究建立了流感继发细菌性肺炎模型，CGD干预共感染模型小鼠后，能改善小鼠的体重下降，提高小鼠的存活率，显著降低了肺指数，病毒M mRNA的表达量和细菌载量，起到较好的治疗作用。因此，采用UPLC-Q-Exactive/MS技术，定性了51种成分，并结合网络药理学得到了CGD可能通过千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩素、黄芩素、5,7,2’-Trihydroxyflavone、去甲汉黄芩素；TNF、AKT1、ALB、VEGFA、MAPK3、PTGS2、STAT3、EGFR、TLR4、PPARG靶点；Fc epsilon RI 信号通路、GnRH信号通路、NF-κB信号通路来发挥治疗流感继发细菌性肺炎的作用。通过分子对接和RT-qPCR技术对上述成分和靶点进行验证，对CGD中的成分千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩素、黄芩素与TNF-α、EGFR、PTGS2进行分子对接发现，上述成分和靶点有较强的亲和活性。RT-qPCR结果发现CGD可以调节共感染小鼠TNF-α、EGFR、PTGS2 mRNA的相对表达量，上述结果表明CGD可能通过千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩素、黄芩素成分，TNF-α、EGFR、PTGS2来发挥治疗流感继发细菌性肺炎的作用。

其中TNF-α、PTGS2是NF-κB信号通路的靶点。该通路是炎症的中央信号传导通路[18]、炎症等生命过程[19]。PPAR家族调控参与细胞增殖、分化、炎症和免疫相关蛋白的表达[20]。有报道[21]发现PPARγ能调控NF-κB表达，降低TNF-α水平，在流感和金黄色葡萄球菌的发生和发展中发挥重要调控作用。

CGD中千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩素、黄芩素成分可能为CGD治疗流感继发细菌性肺炎的关键成分；其中黄芩素是黄芩中含量最高的黄酮类化合物之一[22]，黄芩素广泛的用于治疗流感和金黄色葡萄球菌感染[23-25]。汉黄芩素是传统中草药黄芩的有效成分之一[26]，汉黄芩素能抑制NF-κB p65的表达,减轻炎症反应[27]。千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的代谢物千层纸素A可以发挥抗菌及抗内毒素的作用[28]。

5 结论

本研究成功建立了流感继发细菌性肺炎模型，采用CGD进行干预，发现CGD对其具有较好的治疗作用，采用网络药理学对机制进行预测，采用分子对接和RT-qPCR技术和进行验证，CGD可能通过千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩素、黄芩素成分，TNF-α、EGFR、PTGS2来发挥治疗流感继发细菌性肺炎的作用。