中西药治疗糖尿病视网膜病变db/db小鼠的研究进展*

何润西，黎晓冬，张梅，谢学军

（1.成都中医药大学眼科学院 成都 610075；2.成都中医药大学药学院 成都 611137；3.成都中医药大学附属医院 成都 610072）

糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy，DR）是一种与糖尿病相关的致盲性眼病。由于患者视力进行性下降甚至丧失，可能加重经济负担，同时影响心理健康，因此，是目前亟待解决的公共卫生问题。国际糖尿病联盟发布的最新数据显示，2019年全球约4.6亿成人患有糖尿病，其发病率在全球范围呈上升趋势[1]。而我国成人DM患者约达1.2亿，位居全球第一，其中2型糖尿病并发DR的患者比例高达30.1%[2]。DR被定义为高度组织特异性的神经血管并发症、神经病变和胶质细胞活化是DR的主要发病机制[3-4]。目前，DR的西医治疗包括激光治疗、玻璃体内注射抗血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）等局部或全身治疗，疗效显著，但存在诸多并发症[5-6]。DR属于中医学的“消渴目病”范畴，基本病机为本虚标实，早期是阴虚燥热，随着病情发展，逐渐气阴两虚，最后阴阳两虚，气滞、痰湿、血瘀作为致病因素及病理产物在本病的发生发展中起重要作用[7]。已有大量研究证实了单味中药提取物、中成药以及中药复方在防治DR发生发展的确切疗效[8-10]，但具体作用机制仍需要进一步研究。

目前研究糖尿病及其并发症的动物模型主要包括实验性、自发性、转基因糖尿病动物模型3类。其中，自发性疾病动物模型是在自然情况下发生的疾病，未经人工处置或通过遗传育种培养而保留，病理生理与人类某种疾病有相似之处，因此，常用于研究糖尿病的病因和发病机制，是公认的糖尿病模型。其中，ob/ob、db/db和Obese Zucker是美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）糖尿病药物研发指南所述的2型糖尿病常用动物模型，国外开发口服降糖药及并发症的新药多选用此类动物。ob/ob小鼠为瘦素基因突变，4周时可发生轻度肥胖，表现出高胰岛素血症和糖耐量受损，但直至15周才发生严重的肥胖和糖尿病。由于ob/ob小鼠不具有血液高凝状态，与人类2型糖尿病不同，因此，不能用于糖尿病脑血管和心血管并发症方面的研究。1966年美国Jackson实验室在C57BL/Ks小鼠中发现了糖尿病突变基因（db），是位于小鼠4号染色体的瘦素受体基因发生突变所致，主要表现为下丘脑缺陷，对饱感物质（瘦素）缺乏反应。db/db小鼠就是利用此突变基因成功造出的自发性的糖尿病动物模型，命名为db/db小鼠动物模型[11]。由于db/db小鼠遗传背景明确、模型稳定，其症候特点是肥胖、持续性高血糖、胰岛素抵抗和血脂异常，也可表现出如糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变与DR等糖尿病并发症，与人类2型糖尿病极为相似[12]。因此，db/db小鼠是研究DR的理想动物模型。

本文整理了以db/db小鼠为模型开展的DR中西药治疗相关研究，并总结db/db小鼠DR的症状表现以及药物干预研究，以期为今后DR的防治提供思路。

1 db/db小鼠的症状和病理表现

1.1 全身表现

T2DM属中医学肥胖、消渴等范畴，病位在五脏，以胃、脾、肾为主，实则阳明、虚则太阴是T2DM的基本病机[13]。早期以多食、多饮、多尿为主要临床特征，随着疾病进展，血糖升高、尿微量白蛋白排泄（UAE）增加，身体逐渐消瘦[14]。db/db小鼠在10-14天出现高胰岛素血症，4周左右贪食、肥胖，4-8周时因β细胞障碍，开始出现高血糖。在3-4个月达到血糖高峰期，并始终维持着较高的血糖和体质量水平。血清胰岛素、总胆固醇和甘油三酯水平均明显高于对照组正常小鼠[15]。与普通小鼠相比，db/db小鼠透射电镜下肾小球基底膜增厚，足细胞数量减少，足突增宽、融合[16]。足底热敏反应时间显著增加，血清中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及背根神经节中Toll样受体4（TLR4）、核转录因子-κB（NF-κB）p65等的表达水平也显著增强[17]。

1.2 眼部表现

db/db小鼠角膜染色后呈点状着色、上皮细胞形态异常、神经密度降低及知觉减退，与糖尿病角膜病变特征相吻合[18]。db/db小鼠模型很好地复制了DR的血管改变及神经退行性等特征，包括视网膜内皮细胞/周细胞功能异常、神经节细胞（RGC）凋亡及胶质细胞增生[19]。

对DR视网膜组织形态学异常时间顺序的研究发现，与正常小鼠相比，db/db小鼠的RGC数量从12周开始明显减少，视网膜厚度增加，视网膜各层松散无序[20]。18周时内丛状层肿胀、毛细血管充血扩张、走向极不规则、内皮细胞增生、微血管壁增厚、周细胞明显减少[21]。34周时在神经节细胞层（GCL）和内核层（INL）中出现视网膜层级的排列紊乱，Müller细胞变形及数量明显减少[22]；荧光素眼底血管造影显示：28周龄db/db小鼠视网膜有血管反光增强（荧光素管壁着染）、静脉串珠样等血管病变表现[23]；34周时，db/db小鼠视网膜血管通透性增加，有荧光素渗漏现象，在一定程度上反映了DR的微血管病变特点[22]；光学相干断层扫描发现：28周龄db/db小鼠的视网膜总厚度显著降低，尤其是颞侧象限显著变薄[24]。而34周龄db/db小鼠其GCL和INL厚度显著降低[22]，这与视网膜组织形态学的观察相吻合；视网膜电图检查发现，db/db小鼠在第5周时b波振幅值开始降低，在第8周振荡电位Ops总波振幅显著降低[25]。而b波及Ops总波振幅的降低是诊断早期DR的敏感指标。表明db/db小鼠可出现早期DR的神经病理改变[26]；对db/db小鼠的视觉诱发电位检查发现，22周时N1-P1峰幅差异比正常小鼠降低了3倍，28周时N1、P1和P2波振幅较正常小鼠也显著降低[23,27]。表明db/db小鼠的RGC对光刺激的反应敏感性降低，这也是DR早期神经病变的表现之一。

1.3 中医证候

研究发现，阳明热盛证是8-14周龄db/db小鼠的主要证候，兼有痰湿、气虚证表现。db/db小鼠早期脾胃功能旺盛，概气盛有余，故而善纳能化、进食量不断增加、体质量逐渐上升。脾气亏虚、痰湿蕴阻证是14-16周龄db/db小鼠的主要证候。长期多食、饱食可损伤脾胃功能，而胃主受纳，脾主运化和升清。脾失健运，胃失和降，故而纳食减少。气阴两虚、脾肾亏虚证是16-20周龄db/db小鼠的关键证候，兼有肾阳虚、痰湿证。脾肾亏虚是DN的基本病机，一方面导致清浊不分，藏纳失常，精微下注为浊，表现为UAE、ACR、Scr逐渐增加；另一方面，脾气亏虚，纳少日久，生化乏源，肌肉失养，阴虚之本显现，故而身体逐渐消瘦[14]。

2 药物干预研究

DR是高糖条件下多种病理因素综合导致的致盲性眼病，其发病机制复杂且相互关联。通过不同的西药、中药单体提取物及中药复方干预db/db小鼠的实验研究发现，不同的药物防治DR具有相同或不同的药理分子机制与治疗靶点，同一药物也可能靶向于不同的信号通路，调控多种分子。其给药途径多种多样，可分为滴眼液形式经巩膜途径（局部给药）、静脉注射、口饲、灌胃（全身给药）等。西药和中药干预db/db小鼠的药理机制及主要治疗靶点见表1。

表1 利用db/db小鼠模型研究治疗DR的中药与西药相关药理机制及靶点

2.1 西药治疗

2.1.1 生长抑素

神经病变是DR的重要发病机制，因此，有效预防和治疗DR神经病变，对于延缓DR的进展具有重要意义。生长抑素是视网膜色素上皮合成最重要的神经保护剂之一，对于DR状态下小胶质细胞介导的炎性反应具有保护作用，且对DR早期电生理改变具有改善作用[28]。研究发现，在db/db小鼠模型中局部施用生长抑素，干预2周后，生长抑素可通过抗炎作用，预防DR视网膜神经功能障碍和神经变性[29]。而生长抑素神经元的缺失，可导致下丘脑炎症的加重，从而使小鼠再现DR表型[30]。

2.1.2 胞磷胆碱

胞磷胆碱是一种内源性化合物，在细胞膜磷脂的生物合成途径中起重要作用，特别是磷脂酰胆碱水平，能够增加中枢神经系统中神经递质的水平。研究发现，胞磷胆碱局部给药可通过激活神经胶质、减少细胞凋亡、增加突触素、下调NF-κB和TNF-α来预防糖尿病小鼠的视网膜神经变性[31]。

2.1.3 波生坦

实验表明，内皮素（ET）-1是一种有效的血管收缩肽，在糖尿病微血管异常和神经病变的发病机制中起着重要作用[3,32]。内皮素受体阻断可防止糖尿病和半乳糖喂养大鼠视网膜中细胞外基质成分mRNA表达增加和毛细血管基底膜增厚，而内皮素双受体拮抗剂可影响链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠视网膜中VEGF水平的变化[33-34]。波生坦是一种双重内皮素受体拮抗剂，Bogdanov等[35]将波生坦作用于10周龄db/db小鼠，每天给药2次，连续给药14天，发现db/db小鼠视网膜中ET-1及其受体A（ETA）和B（ETB）上调，糖尿病小鼠反应性神经胶质增生显著减少，赋形剂治疗的糖尿病小鼠视网膜神经节细胞的减少和视网膜血管中TNF-α的上调被显著抑制，提示波生坦可有效预防糖尿病视网膜神经变性。

2.1.4 胰高血糖素样肽-1

慢性高血糖导致的氧化应激在DR等糖尿病并发症中起着关键作用[36]。氧化应激不仅能促进糖尿病视网膜病变的发展，还会导致对血糖控制的抵抗[37]。研究表明，胰高血糖素样肽1（GLP-1）在实验性DR中发挥着有益作用。不仅可以下调VEGF、促炎细胞因子和促凋亡信号传导、还可以减少谷氨酸介导的兴奋性毒性，并通过减少神经细胞凋亡和胶质细胞活化来抑制神经损伤[37-40]。GLP-1局部治疗21周龄db/db小鼠3周后，发现GLP-1可以增加糖尿病视网膜中谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶和CuZnSOD和MnSOD的蛋白水平来保护免受氧化应激，从而调节糖尿病视网膜中的抗氧化防御系统，并有利于DNA的修复和保护神经元细胞的增殖[41]。

2.1.5 C1q/TNF相关蛋白-9

C1q/TNF相关蛋白-9（CTRP9）是一种脂肪细胞因子，具有抗炎、抗氧化、血管舒张和抗动脉粥样硬化的作用，在葡萄糖代谢和血管保护中发挥着有益作用，可降低糖尿病小鼠血糖[42]。研究发现，将表达CTRP9的腺病毒载体静脉注射到12周龄的db/db小鼠中，15天后发现CTRP9抑制白细胞介素-1β、TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1和粘附分子在db/db小鼠视网膜中的表达。CTRP9还能抑制db/db小鼠视网膜中NF-κB的激活，并防止db/db小鼠视网膜中BRB的分解和紧密连接蛋白的下调，定性和定量地减轻早期糖尿病视网膜血管渗漏，保护血视网膜屏障[43]。

2.1.6 非诺贝特

非诺贝特属于贝特类，非诺贝特酸是其活性代谢物，是过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）的激动剂[44]。PPARs可调节脂质代谢和葡萄糖稳态，为视网膜脂质代谢和神经元存活所必需[45]。将非诺贝特喂食于8周龄db/db小鼠12周，发现与常规食物喂养的db/db小鼠相比，非诺贝特喂养小鼠视网膜数量下降得到缓解，视网膜线粒体呼吸率降低，糖酵解减少，并对内皮细胞产生PPARα依赖性的保护作用[46]。

2.1.7 羟苯磺酸钙

羟苯磺酸钙一水合物（CaD）具有全身抗炎和抗氧化作用，常用于糖尿病视网膜病变的治疗。在预防DR早期进展方面效果明显，但其在DR中的作用机制仍有待阐明[47]。对db/db小鼠进行每天口服CaD（200 mg·kg-1）或赋形剂治疗15天，免疫组织化学分析检测视网膜中氧化应激（二氢乙锭、丙二醛）、NF-κB和促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1）水平。结果 发现，CaD显著降低了db/db小鼠视网膜中氧化应激生物标志物，并通过抑制HRECs中IKKB-α的磷酸化来抑制IL-1β诱导的NF-κB的激活，并剂量依赖性地减少TNF-α诱导的IL-6和IL-18的上调[48]。

2.1.8 叶酸

叶酸（FA）即维生素B9，参与一碳代谢，DNA合成、DNA修复、甲基化和氨基酸代谢等多种生物过程均需要FA的参与。机体无法合成FA，因此必须从饮食中补充[49]。Lei等[50]将FA作用于db/db小鼠。结果 表明，虽然FA无法改善db/db小鼠高血糖症状，但FA在其DR早期对视网膜变薄起到保护作用。此外，与盐水治疗的对照组相比，FA治疗的db/db小鼠视网膜血管生成（CD31和VEGFR）、炎症（IL-1β和NLRP3）和氧化应激（3-NT、4-HNE、Vav2和NOX4）的表达水平以及对应指标的血清水平显著下调，血清同型半胱氨酸水平也显著降低。FA通过对血管生成、炎症和氧化应激的潜在抑制作用，针对DR发展中多个级联的潜在信号来改善DR的视网膜病变。

2.1.9 氟苯尼酮

DR是导致视力下降的疾病之一，约75%的糖尿病患者在发病后15年内出现视网膜病变的临床症状[51]。DR由血管变化引起的缺血性和炎性疾病的恶化引起，白斑病的发展、基底膜的增厚、视网膜新血管形成和玻璃体视网膜界面处的纤维血管组织形成，是成人视力丧失的最主要原因[52]。Xiong等[53]将5周龄db/db小鼠用每日剂量的氟苯尼酮或安慰剂进行治疗，持续治疗18周。结果 发现，与非糖尿病对照组相比，转录因子Islet-1和VEGF在db/db小鼠视网膜中的表达上调，视网膜血管渗漏增加和紧密连接蛋白水平降低。氟苯尼酮治疗后，Islet-1和VEGF在视网膜中的表达下调。表明氟非尼酮系统给药可恢复db/db视网膜组织中闭锁蛋白的表达，保护视网膜紧密连接并减少视网膜血管渗漏。

2.2 中医治疗

2.2.1 小檗碱

小檗碱是从黄连、黄柏等根茎提纯出来的异喹啉类生物碱，是一种广谱抗菌药物，具有抗氧化、抗菌及抗炎等多重功效[54]。《伤寒论》中记载：“伤寒胸中有热，胃中有邪气，腹中痛，欲呕吐者，黄连汤主之”，“热利下重者，白头翁汤主之”，因此其被长期应用于多种细菌引起的消化系统疾病[55]。Yin等[56]将小檗碱灌胃给药db/db小鼠10周，发现小鼠空腹血糖、总胆固醇和甘油三酯水平降低。同时，小鼠视网膜中TNF-α和IL-1β的含量降低，VEGF、VEGF受体2、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和NF-κB p65蛋白表达下调。表明小檗碱可通过调节糖脂代谢和抑制HIF-1α/VEGF/NF-κB通路改善糖尿病视网膜病变的发展。

2.2.2 人参皂苷

人参皂苷Rg1（GRg1）是一种甾体皂苷，在人参、三七和西洋参中含量丰富，其滋阴补肾、补气养血，具有很强的抗氧化、降血糖和抗凋亡活性。Gao等[57]将GRg1口服给药22周龄db/db小鼠2个月，发现GRg1可降低血糖、血脂和HbA1c水平，改善糖尿病诱导的视网膜通透性，防止视网膜神经节细胞层（GCL）和内核层（INL）损伤，减少视网膜GCL和INL细胞凋亡。

2.2.3 三七皂苷

三七皂苷R1（NGR1）是从五加科植物三七的根茎中提取的有效成分，其活血祛瘀、通脉活络，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等特性[58]，可治疗糖尿病性脑病和改善微循环障碍。Zhou等[59]将5月龄db/db小鼠通过管饲法给药12周后，发现db/db小鼠的视网膜血管变性、视网膜厚度减少和视网膜功能受损显著减弱。而NGR1预处理的高葡萄糖（HG）的大鼠视网膜Müller细胞（rMC-1）和db/db小鼠的视网膜凋亡、VEGF表达以及氧化应激和炎症反应显著下调，PEDF表达显著增加。表明NGR1可通过降低细胞凋亡预防DR的进展。

2.2.4 红芪多糖

红芪为豆科植物多序岩黄芪的干燥根，红芪多糖是红芪的主要活性成分，现代药理学研究发现，红芪多糖具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗肿瘤等作用[60-61]。VEGF在DR的发生发展过程作用重大，其机制涉及内皮细胞增殖、血管通透性增高和细胞外基质改变等诸多方面。汝亚琴等[62]对11周龄db/db小鼠给予红芪多糖治疗8周后发现，红芪多糖可有效抑制db/db小鼠视网膜VEGF基因表达和蛋白合成，从而改善DR的发展。

2.2.5 糖宁通络胶囊

糖宁通络胶囊主要由科夭罗曲、车前草、仙鹤草和山银花组成。主治生津止渴，活血通络，清热泻火，用于气阴两虚所致的消渴病。以往研究表明，糖宁通络胶囊可通过减少1型糖尿病小鼠视网膜中炎症巨噬细胞释放MIP1γ，导致内皮细胞失活，是适用于糖尿病视网膜病变治疗的潜在新型抗炎药物[63]。卢珊等[64]采用不同剂量糖宁通络胶囊灌胃治疗8周龄db/db小鼠，给药20周后，发现其空腹血糖值显著下降，糖耐量明显提高，糖化血红蛋白水平明显降低，视网膜微血管瘤的数量显著减少。

2.2.6 渴络欣胶囊

渴络欣胶囊（KLX）是国内临床用于糖尿病肾病（微血管病变）治疗的复方中药制剂，具有益气养阴、活血化瘀的功效[65]。罗云等[23]将低、中、高剂量渴络欣胶囊灌胃治疗db/db小鼠，连续给药20周后，发现渴络欣胶囊低、中剂量组能显著改善神经节细胞层和内网状层厚度，且显著优于阳性药羟苯磺酸钙。并可改善db/db小鼠视网膜早期微血管病变和视网膜功能。

3 小结

DR是2型糖尿病中严重的视网膜神经血管单元并发症，也是当前致成年人失明主要的眼底疾病。当非增殖性糖尿病视网膜病变（Non proliferative diabetic retinopathy，NPDR）进展为增殖性糖尿病性视网膜病变（Proliferative diabetic retinopathy，PDR），治疗方法有限且不理想，患者多接受反复治疗（如激光光凝或玻璃体腔注射抗VEGF药物等），造成沉重的社会经济负担[66]。因此，新药研发对于防治DR的发生发展非常关键。动物模型是药物研发的有力工具，db/db小鼠作为瘦素受体基因db突变引起的T2DM小鼠，其在不同生长时期的临床表现以及出现的严重的高血糖及肾损伤进展与人体极为相似，因此成为当前T2DM研究中应用较为广泛的动物模型。

西药治疗db/db小鼠DR常作用于视网膜神经、血管以及小胶质细胞，通过下调视网膜ET受体、抑制视网膜神经变性和VEGF表达、阻止视网膜细胞凋亡、抗氧化、减少糖酵解以及逆转紧密连接来延缓DR进程。中药治疗db/db小鼠DR常通过抑制氧化应激、炎症反应、增强线粒体自噬、调节糖脂代谢、降低血管通透性、保护视网膜微血管功能、增加糖耐量、降低神经元细胞损伤、改善神经传导、改善微循环来改善DR。中西药治疗DR方法多样，疗效显著，既有不同治疗机制，但其亦有共同的治疗靶点。同时发现，随着db/db小鼠症候的演变，其病机在不同阶段亦有所不同。然而，目前对其治疗研究仅着眼于指标变化，未结合其中医症候进行深入探讨。因此，结合其症候，深入探讨不同药物对同一症候，以及相同药物对不同症候的疗效，得到更精准的结果，将是今后db/db小鼠DR治疗的研究方向之一。

综上所述，db/db小鼠作为研究DR发病机制及新药研发的动物模型优势明显，但目前该模型主要用于NPDR阶段的研究[67]。西医和中医在DR的治疗中各有侧重，但亦有共同治疗靶点。本文在概述糖尿病动物模型db/db小鼠主要特点以及病变评估的基础上，对其在DR的发病机制及药理研究方面的相关中西药治疗进展进行总结，以期为中西医结合防治早期DR提供一定的参考依据。