基于慢病毒介导的NLRP3过表达对艾灸调控实验性RA家兔关节滑膜液anti-CCP、RF水平的影响*

杨馨，王燚，杨慎峭，马文彬，吴菲，席东来，路晓清，陈俊，周海燕**

（1.成都中医药大学养生康复学院 成都 610075；2.成都中医药大学针灸推拿学院 成都 610075；3.成都中医药大学外语学院 成都 610075）

类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是以关节滑膜持续慢性炎症、进行性软骨和骨破坏、自身抗体产生为特征的自身免疫性疾病[1]，炎症就是剧烈免疫反应的结果。现代研究证实，机体的固有免疫和适应性免疫均在RA发病中起着重要作用[2]。RA是一种严重的慢性疾病，发病率在0.4%-1.3%之间[3]。在RA中，持续性滑膜炎症的存在最终导致肌腱、关节囊、软骨和骨出现进行性和不可逆性破坏以及功能障碍[4]。艾灸作为一种无明显毒副作用的中医外治疗法，被广泛用于RA的治疗并取得较好的临床效果[5-8]。NOD样受体相关蛋白3（NOD-like receptor associated protein 3，NLRP3）炎症小体是先天性免疫的主要组成，而抗环瓜氨酸多肽抗体（anti-cyclic citrulline peptide，anti-CCP)和类风湿因子（Rheumatoid factor，RF）的产生是RA自身免疫失常的特征之一[9]；NLRP3作为炎性细胞因子的触发器，与其下游的白细胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）的活化与释放相关，而IL-18对RA的发生发展具有全局性的影响。我们的前期研究已经证实艾灸能够抑制NLRP3 mRNA的表达和炎性细胞因子的释放，从而减轻滑膜的炎症。因此，鉴于NLRP3炎症小体在“炎症-免疫”反应中的纽带作用，在人体先天性免疫中的关键调节作用，本实验通过慢病毒载体来介导NLRP3在实验性RA家兔体内的过表达，居于艾灸的抗炎效应，观察其对膝关节滑膜液免疫效应因子anti-CCP、RF，炎性细胞因子IL-18含量的影响，讨论NLRP3在艾灸调整RA免疫，实现其抗炎效应中的作用，探索艾灸对实验性RA异常免疫功能的影响，进一步探讨其NLRP3调控机制。

1 实验材料与实验方法

1.1 实验动物

1.1.1 动物

日本大耳白兔30只，2.0 kg≤体质量≤3 kg，雌雄各半，成都中医药大学实验动物研究中心（许可证编号：SYXK（川）2019-049）提供。动物于实验前进行适应性驯养，时长为1周。普通动物饲养条件。

1.1.2 分组

原则：按体质量、性别分层，30只家兔随机分为空白对照组（简称空白组）、RA模型组（简称模型组）、艾灸治疗组（简称艾灸组）、艾灸+NLRP3过表达组（简称NLRP3过表达组）、艾灸＋NLRP3阴性对照组（简称NLRP3阴性对照组），6只/组。

1.1.3 动物处置

遵循《关于善待实验动物的指导性意见》（国科发财字〔2006〕398号）；成都中医药大学实验动物研究中心批准，伦理审核申请备案编号为2018-22。

1.2 主要试剂药品及仪器

1.2.1 试剂

①福氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant，FCA），美国Sigma公司，批号：F5881；②NLRP3过表达慢病毒载体LV-NLRP3（22143-1）：2E+8TU·mL-1，上海吉凯基因公司，批号：GCD0220715；③Rabbit CCPAb ELISA KIT/ Rabbit RF ELISA KIT/Rabbit IL-18 ELISA KIT，上海茁彩生物科技有限公司，批号：ZC-54615/ZC-54611/ZC-52384。

1.2.2 药品

小艾柱（4×10 mm），济南欧脉医疗器械有限公司，批号：09000314471。

1.2.3 仪器

①SpectraMAX Plus384酶标仪，美谷分子仪器有限公司；②UPH-Ⅱ-10T优普超纯水制造系统，成都超纯科技有限公司；③移液枪，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；④枪头，美国Axygen公司；⑤EP管，美国Axygen公司；⑥软皮尺，精度：1MM。

1.3 造模方法

1.3.1 RA模型塑造

模型组、艾灸组、NLRP3过表达组、NLRP3阴性对照组各家兔双后腿膝关节剃毛、消毒后，将FCA平均注入兔双膝关节腔内（0.5 mL·kg-1，穿刺点：髌骨下缘、膑韧带外侧凹陷），空白组同法注入等量无菌生理盐水作对照。该模型为实验性RA的经典模型[10]，课题组在既往研究中反复多次塑造获得成功，并观察到实验性RA动物模型在造模后滑膜组织发生明显的炎性反应。

1.3.2 慢病毒介导NLRP3炎症小体过表达模型塑造

在体操作之前，先进行感染效率验证（体外分离、培养兔滑膜细胞并转导NLRP3过表达慢病毒载体Lv-NLRP3-GFP，Western blot和RT-PCR检测NLRP3蛋白及mRNA表达情况-由上海吉凯基因化学技术有限公司完成）。根据文献[11]，造模后第3天和开始治疗后第10天共进行两次NLRP3过表达慢病毒载体在体操作，应用微量注射器将NLRP3过表达慢病毒载体溶液0.34 mL（Lv-NLRP3-GFP（滴度5.0×1011TU·mL-1）10 µL+生理盐水）平均注入NLRP3过表达组兔双后膝关节腔内，在关节处用手轻揉5 min，帮助注入慢病毒的扩散。LvGFP同法等量注入NLRP3阴性对照组作对照，无菌生理盐水同法等量注入空白组、模型组、艾灸组作对照。

1.4 治疗方法

造模后第7天，用兔架固定艾灸组、NLRP3过表达组、NLRP3阴性对照组家兔，小艾柱灸双侧“肾俞”、“足三里”（定位：《实验针灸学》[12]=）穴各五壮/1次/日（治疗穴位部位剃毛2 cm×2 cm），6天为1个疗程，总共3疗程，每疗程之间停1天。空白组和模型组动物同法固定作参照。

1.5 指标及检测方法

1.5.1 膝关节周长测定

测定各组家兔后腿左、右膝关节周长（时间节点：造模前，治疗后第6、12、18、21天）。

1.5.2 滑膜液抽取

实验结束后，耳缘静脉空气注射处死实验动物，同法取双侧滑膜液：膝关节腔注入1 mL生理盐水（轻微活动膝关节混匀滑膜液）并回抽0.4 mL注入Eppendorf管，-80℃保存备用。

1.5.3 anti-CCP、RF、IL-18检测操作

将CCP-Ab、RF、IL-18抗体包被于微孔板中，制成固相载体后，进行加样、配液、洗涤、显色、终止，最后用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

1.6 统计学处理

统计分析采用SPSS 19.0软件。数据以均数±标准差（±s）表示，组间采用单因素方差分析，方差齐，选用LSD检验；方差不齐，选用Tamhane’s T2检验。统计学意义标准：P＜0.05为有差异。

2 结果

2.1 艾灸对实验性RA家兔膝关节周长的影响

结果参照表1、表2及图1、图2。根据结果可以看出，各组家兔左、右后膝关节周长在造模前无明显差异（P＞0.05），提示各组实验动物可以进行比较；模型组较空白组家兔左、右后膝关节周长在治疗后第6、12、18、21天均显著增长（P＜0.01），炎症反应持续存在，提示实验性RA模型塑造成功；艾灸组较模型组在治疗后第6、12、18、21天测得左、右后膝关节周长明显下降（P＜0.01）；NLRP3过表达组较艾灸组在治疗后第6、12、18、21天测得左、右后膝关节周长明显增长（P＜0.05），NLRP3过表达阴性组较艾灸组在治疗后各个时间点左、右膝关节周长无明显差异（P＞0.05），提示仅有空病毒注射不会对实验动物产生影响，慢病毒介导的NLRP3在体过表达塑造成功，在NLRP3炎症小体过表达的情况下，艾灸治疗RA的抗炎消肿作用有明显抑制。

图1 各组家兔在造模前及治疗后各个时间段左膝关节周长变化图

图2 各组家兔在造模前及治疗后各个时间段右膝关节周长变化图

表1 各组家兔左后膝关节周长比较（±s，n=6）

表1 各组家兔左后膝关节周长比较（±s，n=6）

组别空白对照组RA模型组艾灸治疗组NLRP3过表达组NLRP3过表达阴性组造模前（cm）9.870±0.216 9.830±0.206 9.913±0.146 10.000±0.245 9.900±0.200治疗后第6天（cm）9.960±0.232 10.960±0.288·10.300±0.107◆10.811±0.136▼10.330±0.164治疗后第12天（cm）10.010±0.166 10.970±0.258·10.263±0.200◆10.767±0.16▼10.050±0.127治疗后第18天（cm）10.020±0.199 11.100±0.249·10.100±0.131◆10.544±0.230▼10.060±0.212治疗后第21天（cm）9.990±0.145 10.910±0.160·10.025±0.175◆10.333±0.166▼10.040±0.217

表2 各组家兔右后膝关节周长比较（±s，n=6）

表2 各组家兔右后膝关节周长比较（±s，n=6）

组别空白对照组RA模型组艾灸治疗组NLRP3过表达组NLRP3过表达阴性组造模前（cm）9.990±0.173 9.930±0.183 9.925±0.191 9.989±0.242 9.860±0.178治疗后第6天（cm）9.920±0.193 11.050±0.259·10.263±0.160◆10.800±0.166▼10.320±0.175治疗后第12天（cm）9.990±0.223 11.070±0.245·10.250±0.160◆10.767±0.1942▼10.050±0.143治疗后第18天（cm）10.030±0.164 11.370±0.221·10.163±0.119◆10.511±0.169▼10.100±0.194治疗后第21天（cm）10.070±0.125 11.210±0.179·10.013±0.113◆10.311±0.190▼10.010±0.202

2.2 艾灸对实验性RA家兔滑膜液anti-CCP含量的影响

结果见表3及图3。根据结果可以看出，模型组较空白组anti-CCP含量明显升高（P＜0.01）；艾灸组较模型组anti-CCP含量明显降低（P＜0.01），NLRP3过表达组较艾灸组anti-CCP明显升高（P＜0.05）；提示通过艾灸治疗可降低RA家兔双侧膝关节滑膜液中anti-CCP的含量，但在NLRP3过表达的情况下其作用明显降低；与艾灸组比较，NLRP3过表达阴性组anti-CCP含量无明显差异（P＞0.05），提示仅有空病毒注射不会对实验动物产生影响，慢病毒介导的NLRP3在体过表达塑造成功。

图3 基于NLRP3过表达的艾灸对实验性RA家兔滑膜液anti-CCP水平的影响

表3 基于NLRP3过表达的艾灸对实验性RA家兔滑膜液anti-CCP水平的影响（±s，n=6）

表3 基于NLRP3过表达的艾灸对实验性RA家兔滑膜液anti-CCP水平的影响（±s，n=6）

组别空白对照组RA模型组艾灸治疗组NLRP3过表达组NLRP3阴性对照组anti-CCP（ng·mL-1）8.898±3.000 14.370±2.837·9.897±2.223◆13.793±3.170▼9.395±1.786

2.3 艾灸对实验性RA家兔滑膜液RF含量的影响

结果见表4及图4。根据结果可以看出，模型组较空白组RF含量明显升高（P＜0.01）；艾灸组较模型组RF含量明显降低（P＜0.01），NLRP3过表达组较艾灸组RF含量明显升高（P＜0.01），提示通过艾灸治疗可降低RA家兔双侧膝关节滑膜液中RF的含量，但在NLRP3过表达的情况下其作用明显降低；与艾灸组比较，NLRP3过表达阴性组RF含量无明显差异（P＞0.05），提示仅有空病毒注射不会对实验动物产生影响，慢病毒介导的NLRP3在体过表达塑造成功。

图4 基于NLRP3过表达的艾灸对实验性RA家兔滑膜液RF水平的影响

表4 基于NLRP3过表达的艾灸对实验性RA家兔滑膜液RF含量的影响（±s，n=6）

表4 基于NLRP3过表达的艾灸对实验性RA家兔滑膜液RF含量的影响（±s，n=6）

组别空白对照组RA模型组艾灸治疗组NLRP3过表达组NLRP3过表达阴性组RF（ng·mL-1）0.322±0.122 0.587±0.108·0.320±0.115◆0.662±0.152▼0.495±0.091

2.4 艾灸对实验性RA家兔IL-18含量的影响

结果见表5及图5。根据结果可以看出，模型组较空白组IL-18含量明显升高（P＜0.01）；艾灸组较模型组IL-18含量明显降低（P＜0.01），NLRP3过表达组较艾灸组IL-18含量明显升高（P＜0.01），提示通过艾灸治疗可降低RA家兔双侧膝关节滑膜液中IL-18的含量，但在NLRP3过表达的情况下其作用明显降低；与艾灸组比较，NLRP3过表达阴性组IL-18含量无显著差异（P＞0.05），与艾灸组比较，NLRP3过表达阴性组IL-18含量无明显差异（P＞0.05），提示仅有空病毒注射不会对实验动物产生影响，慢病毒介导的NLRP3在体过表达塑造成功。

图5 基于NLRP3过表达的艾灸治疗对实验性RA家兔滑膜液IL-18含量的影响

表5 基于NLRP3过表达的艾灸治疗对实验性RA家兔滑膜液IL-18含量的影响（±s，n=6）

表5 基于NLRP3过表达的艾灸治疗对实验性RA家兔滑膜液IL-18含量的影响（±s，n=6）

组别空白对照组RA模型组艾灸治疗组NLRP3过表达组NLRP3过表达阴性组IL-18（ng·mL-1）10.278±0.899 13.360±1.246·10.087±0.683◆12.428±1.440▼9.877±0.502

3 讨论

免疫反应与炎症在组织、细胞、分子信号水平关系密切，适度的免疫反应对机体有利，但过度的免疫反应却会对机体产生伤害，导致机体内环境的稳态被破坏而致病[13]，免疫功能失调就是RA发病的主要原因。NLRP3炎症小体是机体先天性免疫系统的关键调节者，是调控炎性细胞因子产生的最主要途径[14-15]，近来研究发现，先天性免疫失调会促使大量炎性细胞因子的释放[16]，而炎性细胞因子的分泌在NLRP3相关通路传导受抑制的情况下可有效减少，RA的发展进程得到控制[17-18]。NLRP3作为炎症小体的主要组成部分，能识别体内多种危险信号，通过结合ASC，形成具有促炎活性的Caspase-1，进而诱导IL-18的生成引起炎症反应，在机体免疫炎症中发挥关键作用[19]。IL-18是NLRP3炎性小体的下游效应分子，在RA的发病过程中十分关键，对RA的发生具有全局性影响，能诱导其它炎症因子、黏附分子及炎症介质的分泌与合成[20-21]。

研究表明NLRP3与RF等自身抗体具有显著相关性[22]。anti-CCP、RF等免疫分子的异常增多与RA的发生发展密切相关[23]。基于anti-CCP在RA中的高度特异性[24-25]，RF在RA中的高度敏感性，2010年ACR和欧洲抗风湿联盟（European League Against Rheumatism，EULAR）制定的新RA分类标准增加了anti-CCP指标[26]。以往anti-CCP、RF等联测模式多用于提高诊断[27-30]的准确性，实际上，anti-CCP、RF的量化能够敏感地反映RA免疫反应的程度：RF含量与自身免疫反应剧烈程度呈现正相关，随病情发展增加[31]，与病情处于活动期、病程长有关，剧烈的免疫反应会加快炎症的进程。当病情得到控制后，RF滴度降低，其含量变化对判断RA预后具有重要意义。另外，滑膜液中的RF还会与变性IgG结合，形成中等大小的免疫复合物后沉积于关节滑膜，从而导致慢性、免疫炎症性损伤；anti-CCP是RA的临床监测指标，与RA的活动性、病情严重程度及病情发展有关，用于判断RA疾病活动程度及骨侵蚀严重程度[32-34]。

RA发病之根本所在，是标实的同时寓有本虚，先天禀赋不足，肾精亏虚。因此，温肾固本，通经活络，扶正以祛邪是类风湿性关节炎的治疗之根[35-36]。艾灸之法，温经散寒、扶正祛邪、调理阴阳，因此常用于各种经脉痹阻、阳气不足所致之症。本实验选穴足三里、肾俞，分别为胃经下合穴与肾之背俞穴，具有调理脾胃、调理先天之本、振奋正气之效。二者配伍，后天补先天，先天生后天，使阳气内生，匡扶正气。临床研究、系统性评价业已证实艾灸具有较好的临床治疗效果[5-8]及循证医学证据[37]支持。我们的前期研究表明艾灸对实验性RA具有明确的抗炎效应和免疫调整作用，且能够良性调整引发持续性滑膜炎症的炎性细胞因子的分泌及其信号传导通路[38-45]。结合本次实验结果，提示艾灸可降低家兔双侧膝关节肿胀程度及滑膜液中免疫效应因子anti-CCP、RF，促炎性细胞因子IL-18的含量，在NLRP3过表达的情况下其作用显著降低，说明艾灸可能通过有效调控实验性RA家兔关节滑膜液中anti-CCP、RF、IL-18的含量来实现抑制实验性RA家兔异常免疫反应，从而实现其抗炎调节作用，而这一作用的实现可能与NLRP3表达情况有密切关联。本实验结果也印证了“炎症就是剧烈免疫反应的结果”。近年来，随着医学的发展和进步，已基本明确了NLRP3的结构，但是NLRP3是如何启动、激活、调控的，尤其在RA中，尚处于探索研究阶段。RA是一个以自身免疫抗体产生为特征的自身免疫性疾病，作为免疫与炎症的纽带，以NLRP3为切入点，艾灸-NLRP3-anti-CCP/RF-IL-18为研究主线，有望在艾灸治疗RA的研究领域取得新进展，可以为临床探索RA的治疗提供新思路，为艾灸治疗RA提供实验依据。