小柴胡汤抑制NF-κB信号通路对氨诱导大鼠星形胶质细胞水肿的保护作用研究*

李晋，冯勤兴，贾为壹，刘正芸，刘佳佳，徐尚福

（1.遵义医科大学贵州省普通高等学校传染病与生物安全特色重点实验室 遵义 563006；2.遵义医科大学生命科学研究院 遵义 563006；3.遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室遵义 563006）

肝性脑病（Hepatic encephalopathy，HE）是由各种严重肝病所致，以代谢紊乱为基础的神经精神异常综合征，其经典病理生理学概念是基于肝细胞功能障碍和/或门脉系统分流（Portal system shunt，PSS），导致血液和大脑高氨水平。氨浓度升高干扰中枢神经系统（Central nervous system，CNS）的内稳态和导致认知缺陷。其中，A型为急性肝功能衰竭（Acute liver failure，ALF）相关的HE（ALF associated hepatic encephalophathy，AHE），常发生在病毒性肝炎、对乙酰氨基酚毒性或暴露于其他肝毒素（特别是酒精）引起的大面积肝坏死之后，是一种高死亡率（55%-70%）的疾病，AHE常伴有脑水肿，进而产生颅内压升高和脑疝，最终导致死亡[1-2]。目前，除了肝移植外，还没有令人满意的治疗AHE的方法[3-4]。

AHE的主要发病因素是脑水肿的发展，以及随后颅内压的增加和脑疝。星形胶质细胞（Astrocyte，AS）的肿胀（细胞毒性水肿）是AHE水肿的主要组成部分。尽管AHE水肿的分子基础仍然难以捉摸，但氨在其发病机制中有很强的关联[5]。正常情况下，体内氨的主要来源是从膳食蛋白中获得的氨基酸代谢产生，肝脏起着重要的解氨毒作用。因此，当肝脏衰竭时，血氨水平升高，病变肝脏对其清除能力受损，导致大脑谷氨酰胺（Glutamine，Gln）累积，引起中枢神经系统紊乱[6]。因此高氨血症是AHE发病的中心环节。氨处理星形胶质细胞培养物是一种常用的HE体外模型，因为这些培养物重现了HE实验动物和病人身上观察到的许多特征，包括形态学改变、细胞肿胀等[7-8]。

除氨外，有研究表明炎症在AHE发病机制中的潜在作用。AHE患者血液中白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）明显升高[9]。核因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）调控多个能够损害星形胶质细胞的神经炎性细胞因子和趋化因子[10]。众所周知，NF-κB可以激活许多炎症因子基因，包括诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS），过多的iNOS导致一氧化氮（Nitric oxide，NO）过量，已有研究证实NO的供体S-nitroso-N-acethylpenicillamine（SNAP）和morsidonine（SIN-1）引起星形胶质细胞肿胀，而非特异性iNOS抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）显著减少氨诱导的星形胶质细胞肿胀[11]。这些研究表明，NF-κB可能代表AHE中星形胶质细胞肿胀机制的重要组分，因此，抑制星形胶质细胞的NF-κB信号通路可能是预防神经炎性损伤和减轻星形胶质细胞肿胀的一种有前途的治疗策略。

中药复方小柴胡汤出自东汉张仲景的《伤寒杂病论》，是中医十大名方之一，在中医领域常用来治疗外感发热，尤其是有往来寒热等少阳证。课题组前期研究证实小柴胡汤具有治疗硫代乙酰胺（Thioacetamide，TAA）诱导大鼠AHE模型的潜在作用，改善AHE大鼠大脑皮层星形胶质细胞的结构，减轻脑组织水肿[12]。本研究拟在此基础上，通过观察氨对体外培养大鼠原代星形胶质细胞的影响，以NF-κB信号通路为靶点，探讨小柴胡汤对星形胶质细胞肿胀的干预作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级Sprague-Dawley大鼠30只，雄性，体质量在（200±20）g，由第三军医大实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2012-0005。

1.2 药品、试剂和主要仪器

小柴胡颗粒（广州白云山光华制药股份有限公司）；氯化铵（优宁维生物）；DMEM/F-12培养基（中国利维宁公司）；牛血清白蛋白和BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；RNAiso Plus、PCR引物和PrimeScriptTMRT reagent Kit（大连宝生物工程有限公司）；iQTM SYBR Green SuperMix（美国BIO-RAD公司）；β-actin、NF-κB p-P65、TNF-α、GFAP、AQP4抗体和ECL增强型化学发光试剂（北京博奥森生物公司）；NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Gel 1.0 mm×10 well预制胶（美国Thermo Fisher公司）；ND2000超微量分光光度计（美国Thermo Fisher公司）；CFX connect实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司）；Allegra X-30 台式高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；全波长酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；ChemiDoc XRS化学发光成像系统（美国BIO-RAD公司）。

1.3 含药血清制备

将Sprague-Dawley大鼠随机分为2组，即空白对照组（Vehicle组）和小柴胡汤组（XCHT组），每组15只。按照成人体质量60 kg，人与大鼠每公斤体质量折算的等效剂量，XCHT组大鼠灌服5 g·kg-1的小柴颗粒，空白对照组灌服等量蒸馏水，每天1次，共6天。大鼠末次给药前12 h禁食不禁水，给药1-2 h后在腹腔内注射7%水合氯醛（0.5 mL·100 g-1）麻醉动物，腹主动脉取血，室温静置2 h，离心（3500 r·min-1，15 min），吸出血清，相同组血清混合，水浴灭活，于超净台中用微孔滤膜过滤除菌后，分装至离心管中，存放于-80℃冰箱备用。

1.4 细胞分离、纯化与培养

将新生1-2天的Sprague-Dawley大鼠在无菌条件下断头，取出大脑皮层组织并除净脑膜，将脑皮质剪碎，胰酶消化15 min后用完全培养基终止消化并反复吹打至分散成单个细胞。用细胞筛过滤组织匀浆后1000 r·min-1，4℃，离心10 min。收集沉淀并用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F-12培养基混匀，24 h后更换培养瓶中液体，置于培养箱（37℃，5% CO2）。免疫荧光法对星形胶质细胞表面胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillary acidic protein，GFAP）染色进行细胞纯度检测，当细胞含量大于95%时可传代并用于以下检测。

1.5 细胞分组与细胞免疫荧光

细胞按照每孔5×104个细胞接种6孔板，分为Vehicle组、Model组、XCHT组，每组3孔。按分组分别加入不含胎牛血清的DMEM/F-12基础培养基稀释的各种血清（均为10%），Model组和XCHT组同时加入5 mmol·L-1氯化铵[13-14]。培养箱放置24 h后取出细胞，PBS清洗，多聚甲醛固定，0.5% Triton-X100通透细胞膜，用山羊血清封闭，一抗（1∶100）4℃孵育过夜。次日，用PBST清洗，吸干废液，滴入二抗（1∶200）37℃孵育（此操作及以下操作避光），1 h后PBST清洗，吸干废液，每孔加入500 µL DAPI，避光孵育5 min，倒置荧光显微镜下观察并检测荧光强度。

1.6 RT-PCR检测

细胞分组处理同上，每组3瓶。24 h后取出细胞，胰酶消化，终止消化后，同组相混，离心，弃上清。每组加入500 µL RNAiso Plus裂解。总RNA提取按照试剂盒说明书操作，总RNA浓度用ND-2000超微量分光光度计检测，OD260/280＞1.8 RNA纯度符合要求。采用高容量转录试剂盒进行逆转录，应用Power SYBR Green Master Mix进行RT-PCR定量。PCR引物退火温度为60℃，其他条件按照说明书设置，引物信息见表1。

表1 PCR引物序列

1.7 Western blot检测

细胞分组处理同上，每组3瓶。收集给药24 h后的细胞，每瓶加入50 µL裂解液（RIPA:PMSF:碱性磷酸酶抑制剂=100∶1∶1）冰上裂解30 min，蛋白定量采用BCA法。加入蛋白上样缓冲液放入多功能梯度PCR仪中变性15 min。80 V跑完上层胶，当Marker出现后，将电压加压到120 V，跑完为止。半干转方法转膜30 min（25 V，1.0 A）。取出电转后的PVDF膜，TBST洗3次，每次10 min。将PVDF膜置于5%的脱脂奶粉溶液封闭1 h，取出后用TBST洗3次，每次10 min。一抗孵育（1:1000），4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。二抗孵育（1∶2000），室温摇床振摇1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化学发光剂曝光，并分析实验结果。

1.8 统计方法

实验所有数据采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析，数据以均值±标准差（±s）表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 原代星形胶质细胞纯度鉴定

当星形胶质细胞传至第3代，采用免疫荧光法对GFAP染色鉴定细胞的纯度，星形胶质细胞（阳性细胞）呈红色（图1）。荧光显微镜下随机选取5个不同视野进行观察和计数，当星形胶质细胞比例达95%以上时，可用于以下实验。

图1 原代星形胶质细胞的纯度鉴定

2.2 免疫荧光检测AQP4的表达

利用免疫荧光法对星形胶质细胞内的水通道蛋白4（Aquaporin4，AQP4）进行染色，并对平均荧光强度值进行分析。结果 显示：与Vehicle组相比，Model组AQP4呈高表达（P＜0.01），而小柴胡汤干预后AQP4的表达明显降低（P＜0.01）（见图2）。

图2 细胞免疫荧光法检测AQP4蛋白的表达（±s）

2.3 小柴胡汤对星形胶质细胞AQP4、GFAP、TNF-α mRNA表达的影响

RT-PCR法检测结果显示：与Vehicle组比较，Model组AQP4、TNF-α mRNA的表达量明显升高，与Model组相比，XCHT组AQP4、TNF-α mRNA的表达量显著降低（P＜0.05）；Model组GFAP mRNA的表达量相对于Vehicle组降低，小柴胡汤给药后，GFAP mRNA的表达量明显升高（P＜0.05）（见图3）。

图3 RT-PCR技术检测AQP4、GFAP、TNF-α mRNA表达水平（±s）

2.4 小柴胡汤对星形胶质细胞AQP4、GFAP、NF-κB p-P65、TNF-α蛋白表达的影响

Western blot法检测结果显示：Model组较Vehicle组AQP4、NF-κB p-P65、TNF-α的蛋白表达量明显升高，与Model组比较，XCHT组AQP4、NF-κB p-P65、TNF-α的蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；而模型组GFAP蛋白表达量相对于空白对照组有降低的趋势，小柴胡汤组给药后GFAP 蛋白表达量明显升高（P＜0.05）（见图4）。

图4 Western blot法检测星形胶质细胞AQP4、GFAP、NF-κB p-P65、TNF-α蛋白的表达（±s）

3 讨论

脑水肿是肝性脑病的共同特征，被定义为大脑细胞内和细胞外间隙水分过多积聚。血管源性水肿通过紧密连接蛋白的丢失导致血脑屏障的破坏，使颅内压升高；胞质性水肿通过星形胶质细胞的细胞内肿胀增加血脑屏障的通透性，也使脑容量增加；而细胞毒性水肿通过改变水转运膜蛋白（如水通道蛋白）的表达，触发细胞膜的水渗透性增加。脑水肿是AHE重要的病理变化，主要表现以星形胶质细胞肿胀为特征的细胞毒性水肿[15]。高氨血症被认为是大脑和神经改变的一个重要因素。高氨血症通过改变神经递质代谢和诱导神经元毒性，在肝性脑病（Hepatic encephalopathy，HE）和急性肝衰竭（Acute liver failure，ALF）发病中发挥重要作用[16-17]。有研究发现，当脑组织内的氨浓度达到3-5 mmol·L-1水平时就能够引起星形胶质细胞水肿和肝性脑病。许多建立AHE体外模型的研究均采用3-5 mmol·L-1氨刺激星形胶质细胞水肿[13-14]。因此，本实验通过氯化铵诱导大鼠原代星形胶质细胞水肿，模拟AHE脑水肿体外模型。中药复方小柴胡汤由七味中药组成（柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、生姜、大枣），是治疗伤寒少阳证的基础常用古方，也是和解少阳法的代表方，主治往来寒热、胸胁苦满、默默不欲饮食等伤寒少阳证。现代医学研究表明，小柴胡汤除具有显著的抗炎保肝、解热镇痛等作用，对神经系统亦具有很好的保护作用。研究发现小柴胡汤通过调节下丘脑和纹状体的5-羟色胺能和多巴胺能系统，并提高海马神经发生，对抑郁症小鼠模型具有明显治疗作用，同时利用UPLC-MS/MS方法测定小柴胡汤给药后小鼠的血浆成分，结果显示，血浆中存在小柴胡汤的有效成分如黄芩苷、甘草苷、人参皂苷Rg1和Re、汉黄芩苷、甘草酸、汉黄芩素等[18-19]。一项临床研究报道，小柴胡汤加减治疗病毒性脑膜炎、脑炎21例，治愈18例，好转2例，无效1例，服药无不良反应[20]。课题组前期研究发现小柴胡汤具有治疗实验性大鼠AHE的潜在作用[12]，因此，本实验通过体外实验进一步观察小柴胡汤含药血清对氯化铵诱导大鼠原代星形胶质细胞水肿（模拟AHE脑水肿体外模型）的改善情况，结果证实：①小柴胡汤能够改善氯化铵诱导的星形胶质细胞水肿；②小柴胡汤可能通过抑制NF-κB信号通路调控TNF-α介导的炎症反应，减轻星形胶质细胞水肿。

血管周围星形胶质细胞端足通过离子和水交换维持脑内稳态。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）家族中AQP4特异性表达于星形胶质细胞的细胞膜，是中枢神经系统中最常见的水通道蛋白，在血管周围区域和星形胶质细胞端足中都有大量发现，是对水运动影响最大的水通道蛋白。在对AQP4敲除小鼠的研究发现，AQP4广泛参与脑水平衡、神经胶质瘢痕、神经兴奋、神经炎症，甚至神经退行性和神经精神障碍[21]。在脑水肿（尤其细胞毒性水肿）形成过程中起重要的作用，AQP4表达水平的高低与星形胶质细胞水肿的严重程度直接相关[22-23]。在本实验中，Model组细胞的AQP4呈现高表达，经小柴胡汤干预后AQP4的表达明显下降。GFAP是细胞骨架蛋白的一种，可作为星形胶质细胞的特异性标志物，几乎参与细胞内所有重要的生命活动。研究发现GFAP特异地存在于星形胶质细胞中并与星形胶质细胞的活性成正比[24]。课题组前期成功分离培养出新生Sprague-Dawley大鼠脑皮质星形胶质细胞，通过对星形胶质细胞标志性蛋白GFAP进行染色，成功得到高纯度的原代星形胶质细胞。本实验利用免疫荧光法对星形胶质细胞表面GFAP进行检测，当细胞纯度大于95%时用于实验。RT-PCR和Western blot结果显示Model组GFAP的表达量相对于Vehicle组降低，小柴胡汤给药后，GFAP的表达量明显升高。以上结果提示小柴胡汤可以改善氯化铵诱导的星形胶质细胞水肿，增强星形胶质细胞的活性。

近年来发现在AHE的发病机制中炎症反应与高氨血症的协同作用起至关重要的作用。高氨血症使星形胶质细胞内谷氨酰胺浓度升高，因谷氨酰胺的胶体渗透性，能够将水分子吸引进入细胞内进而引起星形胶质细胞肿胀、脑水肿和颅内高压，并诱发炎症反应，使血脑屏障的完整性遭到破坏，星形胶质细胞对水的通透性增加，星形胶质细胞进一步肿胀。而炎症反应又反过来促使脑内氨浓度升高，增加氨对中枢神经系统的毒性。体外研究证实炎症因子（如TNF-α）能够促进血氨弥散入星形胶质细胞中，加重星形胶质细胞肿胀[25-26]。在炎症过程中， NF-κB通路一直起着重要作用。NF-κB转录因子家族由5个成员组成：p65（RelA）、RelB、c-Rel、NF-κB 1（p105/p50）和NF-κB 2（p100/p52），它们可以结合靶基因启动子中的特定增强子元件，调节炎症和免疫系统，是炎症反应中关键性的核转录因子，广泛存在于神经系统中，如星形胶质细胞、小胶质细胞等，可诱导多种细胞炎性因子表达，造成脑组织损伤[27]。其中，NF-κB P65亚基与炎症密切相关。静息状态下，NF-κB以p50/p65异二聚体形式与其抑制性蛋白IκB结合，表现为非活化状态。当受到病理因素（LPS或TNF-α等）刺激时，IκB被IκB激酶IKK复合物磷酸化，导致IκB通过泛素化降解。NF-κB P65蛋白游离并进入细胞核，启动TNF-α、NO、iNOS、IL-6等多种炎症介质的转录和翻译，使星形胶质细胞活化，促进炎症反应发生[28]。其中TNF-α在ALF中起着重要的作用。在ALF患者和动物模型中，HE的严重程度与循环中TNF-α的水平密切相关。将TNF-α注入到中枢神经系统中，能以剂量依赖的方式引起血脑屏障通透性增加，而采用TNF-α抗体即阻止了血脑屏障的开放，表明TNF-α是调控血脑屏障开放的重要因素之一。血脑屏障通透性增加后，使得原本在正常情况下不能通过血脑屏障的神经毒物比如γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等进入脑组织，进而影响中枢神经系统的功能，同时血脑屏障对氨的通透性也增加，使脑内氨的浓度升高。在细胞水平上，TNF-α增加人脑血管内皮细胞对氨的摄取，并引起氨致敏培养星形胶质细胞水肿。同时大量释放的TNF-α可与星形胶质细胞表面受体结合或通过星形胶质细胞间缝隙连接作用于远处的星形胶质细胞，诱导TNF-α、谷氨酸、K+等物质的释放，TNF-α又能进一步活化NF-κB蛋白，加重炎症反应[29-32]。本实验结果显示Model组较Vehicle组NF-κB p-P65、TNF-α蛋白表达量明显升高，与Model组比较，XCHT组NF-κB p-P65、TNF-α蛋白表达量显著降低，提示小柴胡汤能够抑制NF-κB活性，可能通过抑制NF-κB信号通路调控TNF-α介导的炎症反应，减轻星形胶质细胞水肿。

AHE发生在急性肝功能衰竭基础上，常在起病数日内（2周内）由轻度意识错乱迅速陷入深昏迷，甚至死亡，目前还没有令人满意的治疗方法。中医药是我国医学科学的特色，也是中华民族优秀文化的重要组成部分，中医药独特优势（多靶点、多途径、整体协调的特点）和作用，体现在疗效确切的经典配方上。但中医药宝库不是拿来就能用的，必须与现代科技相结合。结合现代药理学和课题组前期研究发现中药复方小柴胡汤具有改善肝功能，提高AHE大鼠生存率和脑功能的作用，因此本研究在此基础上进一步深入探讨其治疗机制。综上所述，本研究表明小柴胡汤明显改善氨诱导大鼠原代星形胶质细胞的水肿，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路，减少炎症介质（尤其TNF-α）的产生和释放有关。