大黄素通过调控miR-29a-5p/VEGFB介导的细胞凋亡抑制多柔比星诱导的心脏毒性*

张肇锋，汤若晗，张良

（南京中医药大学药学院/江苏省中药药效与安全性评价重点实验室 南京 210023）

多柔比星（Doxorubicin，DOX）作为临床上最常用的化疗药物，对多种血液系统癌症和肉瘤具有显著的治疗作用[1-2]。但是，严重的心脏毒性限制了其临床益处的发挥[3]。目前的研究显示多柔比星心脏毒性的多种诱发因素中氧化应激是最主要的因素，DOX可以导致心肌细胞中活性氧（ROS）含量增加，同时DOX降低了超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，进而导致心肌细胞凋亡，引发心脏毒性[4]。因此，新的治疗药物的研究与开发对该疾病具有重要的意义。

microRNA（miRNA）是一种内源性非编码RNA，可以与大多数人类mRNA产生保守的相互作用，从而影响人体的发育过程和疾病进程[5]。近年来，越来越多的研究显示miRNA在多柔比星诱导的心脏毒性进程中发挥了关键作用，例如miR-495-3p[6]与miR-24-3p[7]均能靶向相关蛋白减轻氧化损伤改善多柔比星诱导的心脏毒性。有文章显示大鼠在给予DOX治疗后心肌组织中miR-29a-5p表达水平明显升高[8]，此外，miR-29a-5p在细胞凋亡[9]和氧化应激[10]等细胞生物学进程中也发挥了关键调控作用。miR-29a-5p的靶向蛋白血管内皮生长因子B（Vascular endothelial growth factor-B，VEGFB）在心脏中大量表达，之前的研究显示白藜芦醇能够通过上调VEGFB减轻多柔比星诱导的心肌细胞凋亡[11]。对于其抗凋亡的机制，有研究表明VEGFB能够激活受体NP-1和VEGFR-1并与它们的复合物结合发挥抗凋亡的功能[12-13]。然而，miR-29a-5p/VEGFB途径是否可以调节DOX诱导的心脏毒性，目前仍未见报道。

大黄素（Emodin）是从中药大黄中提取的蒽醌衍生物，具有抗炎[14]、抗菌[15]、免疫抑制[16]等生物活性。重要的是，有研究表明大黄素可以抑制脂多糖（LPS）和缺氧诱导的H9C2心肌细胞凋亡[17-18]和心肌炎症[19]的发生。然而，目前还没有大黄素对抗DOX诱导心脏毒性作用和机制的研究报告，因此，本研究的目的是研究大黄素对DOX诱导心脏毒性的保护作用，并检验这种作用是否通过调控miR-29a-5p/VEGFB途径介导的心肌细胞凋亡来实现的。

1 材料

1.1 细胞株

H9C2大鼠心肌细胞，购买于江苏凯基生物技术有限公司。

1.2 药品与试剂

大黄素（批号：C18F8Q29652）、多柔比星（批号：H11S10Y9726），上海源叶生物科技有限公司；DMSO（批号：710N0314），北京索莱宝科技有限公司；DMEM（批号：8121587）、FBS（批号：2176377），美国Gibco公司；青霉素-链霉素混合液（100×）（批号：20210415），苏州新赛美生物科技有限公司；Caspase-3试剂盒（批号：110719200930）、Caspase-9试剂盒（批号：041621211117）、MDA脂质氧化检测试剂盒（批号：041621210810）、总SOD活性检测试剂盒（批号：052621210729）、ROS活性氧检测试剂盒（批号：041720200803）、GSH-Px谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒（批号：030121210906）、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（批号：050721211125），均购自上海碧云天生物技术公司；cTnT肌钙蛋白检测试剂盒（批号：Dec 2021），南京迈博生物科技有限公司；CK肌酸激酶检测试剂盒（批号：202201），南京翼飞雪生物科技有限公司；GSH还原型谷胱甘肽检测试剂盒（批号：20211104）、LDH乳酸脱氢酶检测试剂盒（批号：20211207），南京建成生物工程研究所；VEGFB抗体（批号：73v5240），美国AFFINITY公司；Bax抗体（批号：10005017）、Bcl-2（批号：26593-1-AP）、Bcl-xl抗体（批号：00049963）、β-actin抗体（批号：10004156）、鼠二抗（批号：20000275），均购自美国Proteintech公司；兔二抗（批号：BST17A13B17C50），美国BOSTER公司；miR-29a-5p模拟物、抑制剂和阴性对照购自江苏凯基生物技术有限公司；HiScript® Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix和miRNA 1stStrand cDNA Synthesis Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PCR引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 仪器

IX53型倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；infinte M200PRO型酶标仪，瑞士TECAN公司；164-5050垂直电泳仪、GelDoc 2000凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司；Nikon Ti倒置荧光显微镜，日本Nikon公司；DS-11型Nano-Drop浓度测定仪，美国DeNovix公司；7500荧光定量PCR仪，美国ABI公司。

2 方法

2.1 细胞培养

H9C2大鼠心肌细胞培养于含89% DMEM、10%胎牛血清、1% 1×105U·mL-1青霉素和1×105µg·mL-1链霉素的完全培养基中。在37℃下含95% O2、5% CO2的饱和湿度条件中培养。

2.2 实验分组及给药

取对数生长期的H9C2细胞，调整细胞密度为1×105个细胞·mL-1，接种于六孔板。设对照组、DOX组（2.5 µmol·L-1，溶解于生理盐水中）及大黄素低、中、高剂量组（5、15、25 µmol·L-1，溶解于0.1% DMSO中）。

2.3 多柔比星诱导的心脏毒性细胞模型的建立

根据前期试验结果选择最佳多柔比星处理浓度为2.5 µmol·L-1建立心脏毒性模型，诱导H9C2细胞损伤16 h。

2.4 MTT法检测细胞活力

将H9C2细胞以1×105个细胞·mL-1的密度接种于96孔板中培养24 h。用不同浓度大黄素（5、15、25 µmol·L-1，溶解于0.1% DMSO中）预孵育细胞8 h，然后加入DOX（2.5 µmol·L-1，溶解于生理盐水中）处理细胞16 h，每组设3个复孔。每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 µL，37℃下孵育4 h，在490 nm处检测各孔吸光度（OD）。计算：细胞活力（%）=（DOX组OD值-调零组OD值）/（对照组OD值-调零组OD值）×100%。

2.5 测量cTnT、LDH、CK、SOD、MDA、GSH和GSH-Px水平

取细胞培养液上清加入96孔板，按试剂盒说明书向各孔中加入相应检测试剂，置于酶标仪中检测心肌肌钙蛋白（cTnT）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）水平；按试剂盒说明书对H9C2进行细胞裂解操作，将细胞裂解液与相应检测试剂加入96孔板中，置于酶标仪中检测超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）的浓度。

2.6 细胞内活性氧（ROS）检测

将H9C2细胞以1×105个细胞·mL-1的密度接种于24孔板中，并用不同浓度大黄素（5、15、25 µmol·L-1）预孵育8 h，然后加入DOX处理细胞16 h。去除培养液，加入含DCFH-DA（10 µmol·L-1）的无血清培养液，37℃细胞培养箱内孵育20 min。最终通过倒置荧光显微镜以200倍放大倍率分析样品。

2.7 Caspase-3、Caspase-9活性检测

将H9C2细胞以1×105个细胞·mL-1的密度接种于24孔板中。根据试剂盒说明书，使用比色法测定H9C2细胞中Caspase-3、Caspase-9活性。

2.8 TUNEL染色

将H9C2细胞以1×105个细胞·mL-1的密度接种于24孔板中。其余步骤按照试剂盒流程进行：PBS洗涤1次，用免疫染色固定液固定细胞30 min。加入免疫染色强力通透液，室温孵育5 min。用PBS洗涤2次。每孔加50 µL TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min后加入含DAPI的抗荧光淬灭封片液。置于倒置荧光显微镜下观察并拍摄图片。

2.9 RT-qPCR测定miR-29a-5p、VEGFB的mRNA表达水平

使用总RNA提取试剂提取H9C2细胞中总RNA，使用逆转录试剂盒进行逆转录以生成第一链互补DNA（cDNA），使用SYBR qPCR Master Mix在ABI Q6实时荧光定量PCR仪上进行实时定量聚合酶链反应（PCR）。PCR引物序列如下（Rat）：miR-29a-5p：F：5’-CGCCGTAGCACCATCTGAAA-3’，R：5’-CAGCCAC AAAAGAGCACAAT-3'，逆转录引物5’-GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCT GAAC-3’；U6：F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAA AAT-3’，R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，逆转录引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；VEGFB：F：5’-TGGAACTCATGGGTAATGTGGTCAAAC-3’，R：5’-CTGGCTTCACAGCACTCTCCTTTC-3’；GAPDH：F：5’-GTCCATGCCATCACTGCCACTC-3’，R：5’-CGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’。

2.10 Western blot法检测H9C2细胞中VEGFB、Bax、Bcl-2、Bcl-xl蛋白的表达

将H9C2细胞以1×105个细胞·mL-1的密度接种于6孔板中，用不同浓度大黄素（5、15、25 µmol·L-1，溶解于0.1% DMSO中）预孵育细胞8 h，然后加入DOX（2.5 µmol·L-1，溶解于生理盐水中）处理细胞16 h。使用含蛋白酶和蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。测定含量后，经过SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移到PVDF膜。室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗VEGFB、Bax、Bcl-2、Bcl-xl，4℃孵育过夜。室温下加入二抗孵育1 h后，使用ECL化学发光检测试剂盒显影，化学发光成像系统曝光成像。以β-actin作为内参蛋白，采用Image J软件对目的蛋白进行半定量分析。

2.11 miR-29a-5p模拟物和抑制剂转染实验

转染的目的是上调或下调miR-29a-5p的表达水平。将miR-29a-5p模拟物、模拟阴性对照物、miR-29a-5p抑制剂或抑制剂阴性对照物分别溶于在Opti-MEM中。向每种溶液中加入LipoRNAi转染试剂。加入6孔板中后在室温下孵育20 min。在无双抗培养基中转染H9C2细胞。37℃培养48 h。检测miR-29a-5p模拟物和抑制剂转染效率、VEGFB mRNA和蛋白表达水平。

2.12 统计学处理方法

数据以平均值±标准差（±s，n=6）表示。使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组比较采用非配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大黄素减轻了DOX诱导的H9C2细胞心脏毒性

如图1A所示，DOX以时间和剂量依赖性的方式降低了H9C2细胞的活力（P＜0.01）。前期研究显示，2.5 µmol·L-1DOX处理H9C2细胞8 h条件下无法达到造模要求；同时H9C2细胞在2.5 µmol·L-1DOX处理24 h条件下，大黄素对DOX诱导的H9C2细胞损伤又难以逆转；而在2.5 µmol·L-1DOX处理H9C2细胞16 h条件下，15 µmol·L-1的大黄素可以显著提高H9C2细胞的活力（P＜0.01），如图1B所示，故选择DOX诱导H9C2细胞16 h作为本实验的造模时间。大黄素低、中、高剂量下单独处理H9C2细胞没有产生明显的毒性，差异无统计学意义（P＞0.05），如图1C所示。此外，与对照组相比，DOX组cTnT、LDH、CK水平均明显升高；然而，大黄素显著降低了H9C2细胞中cTnT、LDH、CK释放水平（P＜0.01），如图1D-1F。结果 表明，大黄素减轻了DOX诱导的H9C2心肌细胞损伤，改善了DOX引起的心脏毒性。

图1 大黄素保护H9C2细胞免受DOX诱导的损伤的影响（±s，n=6）

3.2 大黄素减轻了DOX诱导的H9C2细胞氧化损伤

如图2A-2D所示，与DOX组相比，大黄素显著降低了H9C2细胞中脂质氧化产物MDA的表达水平，同时显著增加了SOD、GSH和GSH-Px等抗氧化酶的水平（P＜0.01）。与对照组相比，DOX组H9C2细胞内ROS释放量明显升高；然而，与DOX组相比，大黄素显著降低了DOX诱导的H9C2细胞中ROS水平升高的情况（P＜0.01），如图2E-2F。这些结果表明，大黄素可以减轻DOX诱导的氧化损伤。

图2 大黄素减轻了DOX诱导的H9C2细胞氧化损伤（±s，n=6）

3.3 大黄素抑制了DOX诱导的H9C2细胞凋亡

TUNEL染色显示，大黄素抑制了DOX诱导的TUNEL阳性细胞数量的升高，初步显示了大黄素的抗凋亡作用（P＜0.01），如图3A-3B所示。与DOX组相比，大黄素显著抑制了Caspase-3和Caspase-9活性的升高（P＜0.01），如图3C-3D。Western blot结果显示，DOX明显降低了抗凋亡蛋白BCL-2、BCL-xl的表达水平，增加了促凋亡蛋白Bax的表达水平。但是这些情况被大黄素逆转（P＜0.01），如图3E-3F。这些发现表明，心肌细胞损伤程度的降低与大黄素抑制H9C2心肌细胞凋亡有关。

3.4 大黄素降低了DOX诱导的H9C2细胞中miR-29a-5p水平并提高VEGFB水平

图4A显示，DOX显著上调了H9C2细胞中miR-29a-5p的表达水平，但是在低、中、高剂量大黄素作用下被显著下调（P＜0.01）。RT-qPCR与Western Blot结果显示，大黄素显著提高了H9C2细胞中DOX诱导的VEGFB表达水平的下调（P＜0.01），如图4B-4C。此外，单独给予H9C2细胞大黄素处理能够在15 µmol·L-1剂量下显著提高H9C2细胞中VEGFB的表达（P＜0.05），如图4D所示。这些结果初步显示了大黄素对miR-29a-5p/VEGFB信号通路的调控作用。

图4 大黄素降低了DOX诱导的miR-29a-5p水平并提高VEGFB水平（±s，n=6）

3.5 VEGFB是miR-29a-5p靶向蛋白

我们使用了两种不同的数据库（miRmap、miRDB）来预测miR-29a-5p的靶向蛋白，发现miR-29a-5p与VEGFB的3’非翻译区（3’UTR）有结合位点，如图5A。然后给予H9C2细胞miR-29a-5p mimic与inhibitor转染以确定miR-29a-5p对VEGFB表达的影响，首先使用RT-qPCR法验证了miR-29a-5p mimic与inhibitor的转染效率（P＜0.01），如图5B-5C所示。然后采用Western blot法检测了VEGFB蛋白的表达量，使用miR-29a-5p mimic/inhibitor转染H9C2细胞后，VEGFB蛋白的表达水平显著降低/升高（P＜0.01）；RT-qPCR检测VEGFB mRNA表达水平显示了相同的趋势（P＜0.01），如图5D-5G所示。这些结果表明了miR-29a-5p对靶蛋白VEGFB具有调控作用。

图5 miR-29a-5p靶向VEGFB（±s，n=6）

3.6 大黄素逆转了miR-29a-5p模拟物的作用

为了进一步验证大黄素对miR-29a-5p/VEGFB介导的信号通路的调控作用，我们使用miR-29a-5p mimic转染H9C2细胞后，发现大黄素在15 µmol·L-1剂量下仍然可以显著提升H9C2细胞活力，减轻了DOX诱导的心脏毒性（P＜0.01），如图6A。RT-qPCR结果显示，与DOX+miR-29a-5p mimic组相比，大黄素在15 µmol·L-1剂量时明显逆转了其抑制VEGFB mRNA表达水平升高的情况；Western blot检测显示了相同的趋势，如图6B-6C所示（P＜0.01）。结果 显示，过表达miR-29a-5p加重了DOX诱导的H9C2细胞损伤，然而大黄素可以通过miR-29a-5p/VEGFB途径逆转这种现象，进一步验证了大黄素对miR-29a-5p/VEGFB途径的调控作用。

图6 大黄素逆转了miR-29a-5p模拟物的作用（±s，n=6）

4 讨论

多柔比星（DOX）是一种蒽环类化疗药物，在抗肿瘤方面中发挥了重要作用。然而这种药物的治疗作用受到了其心脏毒性副作用的限制。研究表明给予DOX治疗后2-3天出现急性心脏毒性，给药后数月甚至数周产生慢性心脏毒性[20]，并且其他器官也会受到损伤，例如严重的肝肾毒性[21]。因此，找到一种能够对抗DOX心脏毒性的活性化合物是迫切且必要的。

大黄素是大黄中含量最高的组分，根据之前的研究，大黄素能够通过调节多个通路来调控细胞凋亡的进程，从而显示出对多器官损伤有效的保护作用[22-25]，据此我们提出了大黄素能够改善多柔比星（DOX）诱导的心脏毒性的假说。本研究探索了大黄素对DOX诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用，结果表明大黄素显著改善了DOX诱导的心肌细胞损伤，提高了H9C2细胞的活力，降低了cTnT、LDH、CK的释放水平。

DOX已被证明可以通过诱导心肌细胞凋亡的途径产生心脏毒性[26-27]。因此我们研究了大黄素对DOX诱导心脏毒性的抗凋亡作用。有证据表明细胞凋亡和程序性细胞死亡是DOX诱导心脏毒性至关重要的一个环节[28]。细胞凋亡在信号转导过程中受到一系列蛋白质的调控，BCL-2家族在其中发挥了关键作用[29]。BCL-2蛋白家族是线粒体驱动的内源性凋亡[30]和下游半胱天冬酶活化（Caspase）的主要调节剂，包括促凋亡（Bax）和抗凋亡（BCL-2和BCL-xl）蛋白[31]。本课题研究结果显示，DOX导致H9C2心肌细胞凋亡程度加重，这一点可以通过Caspase-3、Caspase-9活性和Bax表达增强以及Bcl-2、Bcl-xl表达降低来体现。这些结果与其他研究一致[32-35]。重要的是，大黄素治疗显著改善了DOX诱导的H9C2心肌细胞凋亡，这可以通过Caspase-3、Caspase-9活性和Bax表达降低以及Bcl-2、Bcl-xl表达水平恢复来证明。这些都有助于DOX诱导心脏毒性的改善。

miRNA可以与靶基因的3’-非翻译区（3’-UTR）结合来调控基因的表达[36]。越来越多的证据表明miRNA是治疗心脏疾病的潜在药物靶点。研究显示miR-410-3p可加剧心脏肥大的发生发展过程[37]。此外，据报道miR-499-5p和miR-17-5p在DOX诱导的心脏毒性中发挥了关键调控作用[38-39]。文献显示，DOX诱导的H9C2心肌细胞中miR-29a-5p表达水平显著升高，可能是治疗DOX诱导的心脏毒性的新靶点[8]。因此，对miR-29a-5p抑制剂的筛选为治疗DOX诱导的心脏毒性提供了更多的潜在候选药物。我们的工作显示大黄素显著抑制了miR-29a-5p表达水平，同时抗凋亡蛋白VEGFB的表达显著增加。在转染miR-29a-5p模拟物和抑制剂后，VEGFB的表达分别出现了降低和升高，表明VEGFB是miR-29a-5p的靶基因。此外，转染miR-29a-5p模拟物后，给予DOX处理的H9C2细胞活力与凋亡蛋白VEGFB表达水平降低更为明显。然而，与MIMIC+DOX组相比，大黄素显著提高了H9C2细胞的活力，上调了VEGFB水平，表明大黄素逆转了miR-29a-5p模拟物的作用，证明大黄素能够对miR-29a-5p/VEGFB信号通路产生调控作用并抑制H9C2细胞凋亡。

大量研究也证明，DOX诱导心脏毒性的潜在机制与氧化应激密切相关[40]。抗氧化剂与活性氧（ROS）之间的失衡是产生氧化应激重要的原因之一[41]。内源性抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）在心脏中表达水平较低，所以更易受到DOX诱导的氧化损伤[42]。我们的结果显示，大黄素显著下调了DOX引起的ROS水平升高的情况，同时提高了SOD、GSH、GSH-Px等抗氧化酶水平。此外，大黄素可以显著降低脂质过氧化终产物MDA的表达水平。这些结果均表明大黄素显著减轻了DOX诱导的H9C2心肌细胞氧化损伤。不足的是，我们的研究仅对大黄素对抗DOX诱导的心肌氧化损伤进行了表型的探索，尚未对其深层机制进行探讨，miR-29a-5p/VEGFB途径是否能够调控氧化应激以及氧化应激与细胞凋亡之间的关系均是日后需要解决的关键问题。

综上所述，我们的数据表明大黄素通过调节miR-29a-5p/VEGFB介导的心肌细胞凋亡显著降低了DOX诱导的心脏毒性，同时大黄素还展现出很强的清除ROS的能力。这些都证明了大黄素的临床治疗潜力。当然，这种天然产物对抗DOX引起的心脏毒性的深层机制和临床应用仍需要进一步探究。