基于UPLC-Q-TOF/MS及CORT诱导的低分化PC12抑郁细胞模型的柴胡抗抑郁活性成分研究*

于静波，韩越，周梓洋，牟晴蕊，陈静梅，欧阳煜钦，费璋，王宇红**

（1.湖南中医药大学科技创新中心/中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地 长沙 410208；2.湖南中医药大学抑郁类疾病中医药防治湖南省重点实验室 长沙 410208；3.湖南中医药大学药学院 长沙 410208）

抑郁症是以情绪功能障碍、思维迟缓、意志力减退、认知功能损害和社会功能障碍为主要临床特征的精神疾病[1]。抑郁症现已成为自杀的首要因素，严重影响人类生活质量[2]。柴胡Bupleuri Radix为伞形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifoliumWilld.的干燥根，性微寒，味辛、苦，归肝、胆、肺经，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气之功[3]。柴胡为临床治疗抑郁症中最为常用的中药，是多个抗抑郁疗效明确的复方如《伤寒论》中四逆散、《太平惠民和剂局方》中逍遥散、《景岳全书》中柴胡疏肝散等的基础药物[4]。

从柴胡中已分离鉴定得到皂苷类、黄酮类、多糖类、木脂素类等成分。研究表明柴胡皂苷类成分具有抗抑郁作用[5]。在柴胡抗抑郁活性成分研究中，关于柴胡总皂苷、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的研究报道较多。由于柴胡皂苷极性强、结构相似、同分异构体较多，其他成分的抗抑郁作用尚需进一步探明。因此本实验通过超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术获得柴胡代谢轮廓，鉴定柴胡中的化学成分，并利用皮质酮（CORT）诱导的PC12细胞损伤模型对关键成分进行活性筛选，最终探究柴胡抗抑郁活性成分。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AcquityTMUPLC液相色谱仪、XEVO G2-XS QTOF/MS质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）、MassLynx V4.1工作站（美国Waters公司）；LE204E/02型电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；KQ5200DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Mini-Q Intergral纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 试药

柴胡饮片（产地为河北，批号20180601），购于北京同仁堂药店；对照品柴胡皂苷A（批号P03M9F5059 3）、柴胡皂苷D（批号P26N11F132137）、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A（批号Z02A10L94589）、柴胡皂苷E（批号M28GB150097）和阿魏酸（批号G27A11L112005）购于上海源叶生物科技有限公司；柴胡皂苷C（批号wkq21101907）、柴胡皂苷F（批号wkq21070102）、柴胡皂苷B2（批号wkq21070611）和槲皮苷（批号wkq21022402）购于四川维克奇生物科技有限公司；前柴胡皂苷F（批号21121701）购于成都普菲德生物技术有限公司；绿原酸（批号110753-201817）和异槲皮苷（批号111809-201804）购于中国食品药品鉴定研究院；以上标准品质量分数均≥98.00%。质谱纯甲醇、乙腈购于美国Thermo Fisher公司；甲酸购于德国CNW公司，其他试剂均为分析纯；CCK-8试剂盒（批号CK04）购于日本同仁化学研究所；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号C0017）购于上海碧云天生物技术有限公司。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm i.d., 1.7 µm）；流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），洗脱梯度为0-2 min，98%-90% A；2-6 min，90%-80% A；6-12 min，80%-65% A；12-15 min，65%-60% A；15-22 min，60%-50% A；22-26 min，50%-20% A；26-27 min，20%-0% A；柱温40℃；样品仓温度10℃；流速为0.3 mL·min-1；进样体积6 µL；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正负离子检测的全模式，质量扫描范围：m/z50-1500 Da，毛细管电压正负模式下分别为3.0 kV、2.5 kV，样品锥孔电压：40 V，离子源温度100℃，去溶剂化气流温度400℃，锥孔气流50 L·h-1，去溶剂气流量800 L·h-1。利用亮氨酸-脑啡肽（[M+H]+=556.2771，[M-H]-=554.2615）作为内标液进行质量实时校正，流速10 µL·min-1。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取阿魏酸、绿原酸、槲皮苷、异槲皮苷、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F、前柴胡皂苷F、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A对照品适量，以甲醇溶解，分别配置成浓度为1.0 mg·mL-1的单一对照品储备液。精密量取各对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，再用逐级甲醇稀释，得到混合对照品溶液。过0.22 µm滤膜供液质分析。

2.4 供试品溶液的制备

将柴胡饮片在15倍量水中浸泡1 h，煎煮2 h，纱布过滤，收集滤液；滤渣加10倍量水，煎煮1.5 h，纱布过滤，合并两次滤液。将滤液旋转浓缩，冷冻干燥制备成冻干粉。取柴胡冻干粉50 mg左右，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，密封，并超声30 min，溶液于4 ℃，13 000 r·min-1离心15 min，取上清液。上清液过0.22 µm滤膜供液质分析。

2.5 柴胡抗抑郁活性成分筛选

2.5.1 细胞分组、造模及给药

低分化PC12细胞培养在含10%胎牛、100 U·mL-1青霉素和100 µg·mL-1链霉素的DMEM培养基，放置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，待2-3天后进行细胞传代处理。

取对数生长期的PC12细胞，以1×104·mL-1接种于96孔板中，分为对照组、模型组和给药组等，每组设置5个复孔。培养24 h后，弃去培养基，模型组加入含200 µmol·L-1CORT的无血清培养基；给药组加入含25 µmol·L-1待测单体和200 µmol·L-1CORT的无血清培养基；对照组加入等量的无血清培养基。各组继续培养24 h后，根据试剂盒进行后续实验。

2.5.2 细胞活力的测定

取待测96孔板，每孔加入10 µL CCK-8溶液，在培养箱内孵育1-4 h后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。细胞活力=（A实验组-A培养液）/（A对照组-A培养液）×100%

2.5.3 乳酸脱氢酶（LDH）的测定

取待测96孔板，2100 r·min-1离心5 min，收集细胞培养液于新的96孔板，向各孔中加入LDH检测工作液，混匀后室温避光孵育30 min，在490 nm处测定LDH吸光度值。LDH释放率=（A实验组-A培养液）/（A对照组-A培养液）×100%。

2.6 统计学方法

实验数据以均值±标准差（±s）形式表示。利用SPSS 17.0进行ANOVA差异分析，P＜0.05表示具有显著性差异，P＜0.01表示具有极显著性差异。

3 结果

3.1 基于UPLC-Q-TOF/MS的柴胡水提物化学成分鉴定

采用UPLC-Q-TOF/MS技术对柴胡水提物中的化学成分进行定性分析，获得其代谢产物的化学信息。正、负离子模式下，代表性的柴胡水提物代谢轮廓见图1。根据采集的化合物MS/MS质谱信息结合UNIFI数据库、参考文献[6-14]及标准品等对柴胡体外成分进行分析表征。利用采集的精确分子量计算化合物的元素组成，利用采集的二级碎片信息对该成分进行表征。最终鉴定柴胡中54个化学成分，其中酚酸及其苷类10个，包括绿原酸、隐绿原酸、阿魏酰基奎宁酸等；黄酮及其苷类5个，如芦丁、异槲皮苷、水仙苷等；皂苷类35个，如柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、柴胡皂苷B2等；其他有机酸类、氨基酸类、核苷酸类4个成分，结果见表1。

表1 柴胡体外成分鉴定

图1 正离子模式（A）和负离子模式（B）下，基于UPLC-Q-TOF/MS的柴胡水提物代谢轮廓

3.1.1 酚酸及其苷类成分鉴定

从柴胡中共鉴定了10个酚酸类成分，包括化合物4-7、9-12、15、17。该类化合物的主要裂解途径为H2O、COOH、CO等小分子丢失，且羰基处易于断裂而产生相应的碎片离子。以绿原酸为例（图2），保留时间3.60 min，ESI-模式下检测到绿原酸的准分子离子峰为m/z353.0863 [M-H]-，计算其元素组成为C16H18O9；二级质谱显示母离子酯键断裂产生碎片峰m/z191.0542 [M-H-C9H6O3]-和m/z161.0222 [M-HC7H12O6]-；碎片离子m/z191.0542脱去1分子H2O产生碎片峰m/z173.0441，再脱去CH2O2产生碎片峰m/z127.0378；母离子C-O键断裂产生碎片离子m/z179.0316 [M-H-C7H10O5]-和碎片离子m/z173.0441[M-H-C9H8O4]-；碎片离子m/z179.0316脱去CO2产生碎片峰m/z135.0421。

图2 负离子模式下，绿原酸全扫描质谱图（A）、二级质谱（B）和裂解途径（C）

3.1.2 黄酮及其苷类成分鉴定

从柴胡中共鉴定了5个黄酮及其苷类成分，其中14、16、18、19均为黄酮醇苷类化合物。该类化合物的主要裂解途径为苷键断裂、苷元C环RDA裂解发生1，3键和0，2键的断裂及CO、H2O等中性离子丢失。以异槲皮苷为例（图3），保留时间6.21 min，ESI-模式下检测到异槲皮苷的准分子离子峰为m/z463.0895 [MH]-，计算其元素组成为C21H20O12；二级质谱显示母离子脱去葡萄糖残基产生苷元m/z301.0345 [M-H-Glu]-及m/z300.0276 [M-2H-Glu]-；苷元脱去1分子H2O产生碎片峰m/z283.0264，再丢失CO产生碎片峰m/z255.0295；苷元丢失CH2O产生碎片峰m/z271.0246，再丢失CO产生碎片峰m/z243.0290；苷元C环1，3键断裂产生碎片峰m/z151.0028 [1,3A]-；苷元C环0，2键断裂产生碎片峰m/z135.0074 [0,2B]-。

图3 负离子模式下，异槲皮苷全扫描质谱图（A）、二级质谱（B）和裂解途径（C）

3.1.3 柴胡皂苷类成分鉴定

柴胡皂苷结构均为五环三萜齐墩果烷型衍生物，其苷元可分为环氧醚型（Ⅰ型），异环双稀型（Ⅱ型），12-稀型（Ⅲ型），同环双稀型（Ⅳ型），12-稀-28-羧酸型（Ⅴ型），异环双稀-30-羧酸型（Ⅵ型），18-稀型（Ⅶ型）7种不同类型，柴胡皂苷中一般只含有葡萄糖，夫糖，鼠李糖，木糖和戊糖醇[15]。通过分析对照品柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷F等的二级质谱图对柴胡皂苷类成分质谱裂解途径进行归纳。

柴胡皂苷A属于Ⅰ型柴胡皂苷。如图4所示，保留时间16.15 min，ESI+模式下检测到柴胡皂苷A的准分子离子峰为m/z781.4736 [M+H]+，另外还存在加合形式为[M+Na]+的离子m/z803.4551，计算其元素组成为C42H68O13；二级质谱显示母离子脱去1分子H2O产生碎片离子m/z763.4595 [M+H-H2O]+，再脱去1分子H2O产生碎片离子m/z745.4531 [M+H-2H2O]+；碎片离子m/z763.4595脱去1个葡萄糖残基产生碎片峰m/z601.4061，进一步脱去1个夫糖残基产生碎片峰m/z455.3508；碎片离子m/z745.4531脱去1个葡萄糖残基产生碎片峰m/z583.3939，进一步脱去1个夫糖残基产生碎片峰m/z437.3431。柴胡皂苷D与柴胡皂苷A为差向异构体，产生的二级碎片相同。

图4 正离子模式下，柴胡皂苷A全扫描质谱图（A）、二级质谱（B）和裂解途径（C）

柴胡皂苷B2属于Ⅱ型柴胡皂苷。如图5所示，保留时间16.30 min，ESI+模式下检测到柴胡皂苷B2的准分子离子峰为m/z781.4766 [M+H]+，另外还存在加合形式为[M+Na]+的离子m/z803.4597，计算其元素组成为C42H68O13；二级质谱显示母离子脱去1分子H2O产生碎片离子m/z763.4666 [M+H-H2O]+，再脱去1分子H2O产生碎片离子m/z745.4558 [M+H-2H2O]+；碎片离子m/z763.4666脱去1个葡萄糖残基产生碎片峰m/z601.4129，进一步脱去1个夫糖残基产生碎片峰m/z455.3533，还可同时脱去C16位羟基与C17位羟甲基产生碎片峰m/z407.3314；碎片离子m/z745.4558脱去1个葡萄糖残基产生碎片峰m/z583.4021，再脱去1个夫糖残基产生碎片峰m/z437.3425。

图5 正离子模式下，柴胡皂苷B2全扫描质谱图（A）、二级质谱（B）和裂解途径（C）

柴胡皂苷F属于Ⅲ型柴胡皂苷。如图6所示，保留时间13.57 min，ESI+模式下检测到柴胡皂苷F的准分子离子峰为m/z929.5519 [M+H]+，另外还存在加合形式为 [M+Na]+的离子m/z951.5340，计算其元素组成为C48H80O17；二级质谱显示母离子脱去1分子H2O产生碎片离子m/z911.5388 [M+H-H2O]+，再脱去1分子H2O产生碎片离子m/z893.5281 [M+H-2H2O]+；碎片离子m/z911.5388脱去1个鼠李糖残基产生碎片峰m/z765.4766，再脱去1个葡萄糖残基产生碎片峰m/z 603.4261，进一步脱去1个葡萄糖残基产生碎片峰m/z441.3725，还可同时脱去C16位羟基与C17位羟甲基产生碎片峰m/z393.3501；碎片离子m/z893.5281脱去1个鼠李糖残基产生碎片峰m/z747.4681，再脱去1个葡萄糖残基产生碎片峰m/z585.4155，再脱去1个葡萄糖残基产生碎片峰m/z423.3621。故推测柴胡皂苷的裂解方法主要为糖基及苷元上取代基的丢失，并以此为基础对柴胡中其他皂苷类成分进行表征。

图6 正离子模式下，柴胡皂苷F全扫描质谱图（A）、二级质谱（B）和裂解途径（C）

根据BPI色谱图中各成分的相对峰面积与总相对峰面积比值判断其对柴胡代谢轮廓贡献程度大小，进而筛选活性成分[16]。经计算得到柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷F、柴胡皂苷E、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A对柴胡代谢轮廓的贡献度较大，作为柴胡潜在抗抑郁活性成分。其中，柴胡皂苷A的贡献度最大，占总轮廓的23.12%，见表2。

表2 鉴定化合物对柴胡代谢轮廓的贡献度

3.2 柴胡关键成分对CORT诱导的低分化PC12细胞活力的影响

细胞活力实验中，如图7所示，在200 µmol·L-1CORT作用下，PC12细胞活力为（58.27%±3.04%）。与对照组比较，模型组PC12细胞活力显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，柴胡皂苷A组、柴胡皂苷B2组、柴胡皂苷C组、柴胡皂苷E组、柴胡皂苷F组、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A组细胞活力显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。

图7 柴胡关键成分对CORT诱导的低分化PC12细胞活力的影响

3.3 柴胡关键成分对CORT诱导的低分化PC12细胞LDH释放率的影响

LDH释放率实验中，如图8所示，在200 µmol·L-1CORT作用下，PC12细胞的LDH实验率为（154.26%±24.50%）。与对照组比较，模型组PC12细胞LDH释放率显著升高（P＜0.05）；柴胡皂苷A组、柴胡皂苷B2组、柴胡皂苷C组、柴胡皂苷E组、柴胡皂苷F组LDH释放率显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。

图8 柴胡关键成分对CORT诱导的低分化PC12细胞LDH释放率的影响

4 讨论

抑郁症是一种具有广泛临床表现及多系统发病机制的精神疾病[17]，以整体观念为指导原则的中医药在抑郁症防治中具有独特优势[18]。大量临床及实验研究报道柴胡提取物、药对及类方抗抑郁症作用明确[19-21]。但除柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷B2，柴胡其他成分在抗抑郁作用方面的研究还未见报道。

本研究首先利用UPLC-Q-TOF/MS技术对柴胡水提取物进行成分分析，共鉴定包括酚类、黄酮类、皂苷类等54个化学成分，其中8个化学成分为从柴胡中首次报道，并推测鉴定出化合物45和54这2个苷元16位为羰基的新型柴胡皂苷类化合物。柴胡水提物中化学成分主要为Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型柴胡皂苷类成分，且化学结构之间具有联系。柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E和6″-O-乙酰基柴胡皂苷A等均属于I型柴胡皂苷。其中，柴胡皂苷A与2″-O-乙酰基柴胡皂苷A、3″-O-乙酰基柴胡皂苷A、4″-O-乙酰基柴胡皂苷A和6″-O-乙酰基柴胡皂苷A苷元相同，柴胡皂苷C与柴胡皂苷E苷元相同。柴胡皂苷A，可在体内代谢为前柴胡皂苷F和柴胡皂苷元F[22]。柴胡皂苷B2、柴胡皂苷M和柴胡皂苷N等属于Ⅱ型柴胡皂苷，柴胡皂苷F属于Ⅲ型柴胡皂苷。柴胡皂苷B2可由Ⅰ型柴胡皂苷柴胡皂苷D转化而来。

根据各成分相对峰面积与总相对峰面积比值判断柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷F、柴胡皂苷E、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A对柴胡代谢轮廓的贡献度较大。四逆散为具有明确抗抑郁疗效的中药复方，周佳等[23]利用UPLC-MS/MS法同时测定四逆散水提物中主要成分的含量，测得柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D的含量分别为886.60 µg·g-1、122.32 µg·g-1、160.16 µg·g-1、29.61 µg·g-1，证明柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2和柴胡皂苷C对方中君药柴胡的重要贡献。本实验同时通过测定细胞活力和LDH释放率发现，具有较高贡献度的柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷F、柴胡皂苷E、6″-O-乙酰基柴胡皂苷A对CORT诱导的低分化PC12抑郁细胞模型产生保护作用。文献报道柴胡皂苷A可改善慢性不可预知性温和应激诱导的围绝经期雌性大鼠的抑郁样行为，其机制可能与调节海马体中脑源性神经营养因子（BDNF）的表达及炎症因子相关[24]。Wang等[25]研究发现柴胡皂苷A可通过p-CREB/BDNF信号通路改善中风化抑郁大鼠模型快感缺失、自主活动降低、绝望等抑郁行为及抑制海马神经元凋亡。柴胡皂苷B2能够保护CORT诱导的PC12细胞损伤，其作用机制主要与调节D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、减少线粒体凋亡通路和抑制p38/NF-κB信号通路等密切相关[26]。曲中原等[27]利用网络药理学方法预测柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷F可作用于MAPK1、FGF2、CASP3、MAPK8等14个核心靶点，通过PI3K-Akt、Ras、MAPK等信号通路发挥抗抑郁、抗炎、抗肿瘤作用。综上推断，由于柴胡皂苷结构相近，如I型柴胡皂苷为具有13,28-环氧结构的化合物，氧环不稳定，在煎煮过程中或体内代谢过程中转化为II型柴胡皂苷，可协同发挥抗抑郁作用。

本研究基于UPLC-Q-TOF/MS及CORT诱导的低分化PC12抑郁细胞模型，确定柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F可能为柴胡主要的抗抑郁活性成分，为柴胡质量控制及抗抑郁药物研发提供依据。