基于TMT蛋白组学探讨消肿止痛合剂治疗皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制*

马岁录，何志军，刘涛，李岩，何元旭，何波

（1.甘肃中医药大学中医临床学院 兰州 730030；2.甘肃省中医院 兰州 730050）

皮瓣缺血再灌注损伤（FIRI）是指缺血缺氧的皮瓣组织在血运重建过程中由于有害物质的释放而引起皮瓣组织再次损伤的病理过程。皮瓣移植技术作为整形外科与修复重建外科在临床上治疗烧伤、肿瘤、骨感染等疾病的重要手术方式，临床应用广泛，但术后出现的皮瓣坏死不仅困扰着临床医生，同时也加重了患者的负担[1]。有研究表明，皮瓣移植过程中出现的FIRI是导致皮瓣坏死的主要原因[1]。现代研究发现FIRI是由炎症反应、氧化应激反应、血管内皮细胞坏死、局部微循环障碍等多种因素共同作用的结果[2]。

FIRI属于中医学中“瘀血证”的范畴，临床上使用具有“祛瘀生新、活血止痛”功效的中医药治疗FIRI的效果显著[3]。在中医整体观念与辨证论治思想的指导下，以“活血化瘀、消肿止痛”为主体的中医药在治疗FIRI中具有良好的效果，不仅可以显著提高移植皮瓣的存活率，还可以降低西药治疗过程中出现的不良反应[4]。中医药作为我国的瑰宝，中药以及中药制剂内的有效成分较为复杂，并且在疾病治疗过程中的作用机制尚未完全清楚，但随着蛋白组学（Proteomics）技术的出现与不断发展，通过使用蛋白组学技术研究药物在治疗疾病过程中的关键靶点，可以为中药、中药制剂的研发，以及探究中医药治疗疾病的作用机制提供了重要途径[5]。

消肿止痛合剂属于甘肃省中医院院内制剂，由甘肃省中医院科研制剂中心生产，用于治疗骨折、骨折术后、软组织损伤等多种骨伤科疾病多年，临床疗效显著[6]。课题组前期相关临床和实验研究证实，消肿止痛合剂可以通过减少炎症因子的释放、中性粒细胞的聚集以及细胞凋亡，从而达到保护缺血缺氧皮瓣的目的[7]。同时，近期课题研究发现，消肿止痛合剂可以通过减少FIRI大鼠血管内皮细胞的凋亡，促进皮瓣新生血管的生成，从而极大程度的提高了移植皮瓣的成活率[8]。既往研究已经证实消肿止痛合剂可以改善FIRI大鼠皮瓣的成活率。但消肿止痛合剂治疗FIRI的机制研究尚不够深入，仍需继续深入研究。本次研究通过利用TMT体外标记定量蛋白组学技术，筛选消肿止痛合剂在FIRI中起药理作用的关键靶点与通路，从蛋白表达调控角度阐述消肿止痛合剂治疗FIRI的作用机制，并为课题组的相关研究提供新的思路与方向。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器

采用2月龄SPF级SD大鼠30只（由甘肃中医药大学动物实验中心提供并饲养，温度22℃，相对湿度55%，自由摄食饮水），雌雄各半，体质量在200-220 g，实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2020-0001，实验动物使用许可证号：SYXK（甘）2020-0009，动物合格证编号：NO.62001000000533，本实验经甘肃中医药大学伦理委员会批准（批号：2021-024）。消肿止痛合剂，由甘肃省中医院制剂室按制备工艺制成，注册文号：甘卫普制准字（1997）-202-04，批号：20051122，规格：250 mL/瓶；UA 缓冲液（Sigma公司，8M Urea，150 mmol·L-1Tris-HCl pH = 8.0）、NH4HCO3（Sigma公司，批号：A6141）、乙腈（Merck公司，批号：1499230-935）、甲酸（Fluka公司，批号：20190111723）、TMT 10plex kit（Thermo Fisher公司，批号：90066）、High-pH反相肽分离试剂盒（Thermo Fisher公司，批号：84868）、质谱仪（Thermo Scientific公司，Q-exacitve HF-X）、色谱系统（Thermo Scientific公司，Easy-nLC1200）、色谱柱（Trap column（Reverse-phase），100 µm×20 mm (5 µm，C18)）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组与给药

采用SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，体质量200-220 g（由甘肃中医药大学动物实验中心提供）。将30只大鼠按体质量编号后，使用随机数字表法将大鼠随机分为3组，正常组（假手术组）、模型组、消肿止痛合剂组（消肿组），各组10只。消肿组给予消肿止痛合剂灌胃，给药量按70 kg 成人体表面积折算成等效剂量，按1.8 mL·kg-1灌胃，1 mL/100 g(每毫升含生药0.09 g)，1次/天，连续7天；正常组、模型组给予同体积生理盐水灌胃，1次/天，连续7天。

1.2.2 实验动物造模

皮瓣造模方法参考Schmauss等[9]所述文献进行造模：以1%的戊巴比妥（0.5 mL/100g）腹腔麻醉3组SD大鼠，俯卧位固定于大鼠解剖，正常组切取背部约5 cm×6 cm皮肤及其皮下筋膜，未游离皮瓣。模型组与消肿组完全游离背部大小约5 cm×6 cm带蒂皮瓣，并使用微血管夹夹闭双侧胸背浅动脉2 h，2 h后去除血管夹在显微镜下观察血运恢复情况，模拟FIRI。用6-0医用聚酰胺缝合线间断原位缝合皮瓣（皮瓣组织包括皮肤及皮下筋膜层）。各组大鼠切口周围聚维碘酮消毒后涂抹红霉素软膏，术后前3天使用头孢噻肟钠预防感染（sig:0.2 g，i.m,qd)。

1.2.3 标本采集、病理组织学观察与蛋白样品制备

术后7天将大鼠麻醉，观察各组皮瓣组织坏死程度后，切取皮瓣组织，部分放入10%中性多聚甲醛固定，乙醇、二甲苯处理后石蜡包埋并切片处理，TUNEL染色后在光学显微镜下行观察。部分放入事先预备好的液氮罐中，12 h后取出置于-80℃冰箱中保存待用。取样品液氮研磨，每样称取约100 mg，分别加入600 µL SDT裂解液，冰浴超声2 min，4℃，16 000 g离心20 min，取上清液，使用BCA法进行蛋白定量。

1.2.4 指标检测

（1）SDS-PAGE凝胶电泳

每组样品各取15 µg蛋白质样品5∶1（V/V）加入5×上样缓冲液，沸水浴5 min，进行8%-16% SDSPAGE电泳。电泳使用考马斯亮蓝染色（Bradford法）。

（2）蛋白质酶解及肽段脱盐

每组样品各取300 µg蛋白质样品进行蛋白质酶解，酶解方法参考Wiśniewski等[10]使用的FASP酶解法。酶解后的肽段使用C18 Cartridge脱盐，真空冻干。肽段干燥后用0.1% TFA复溶，使用Thermo desalting spin column脱盐处理，进行肽段定量。

（3）TMT肽段标记与肽段分级

每例样品分别取100 µg肽段，按照Thermo Fisher公司TMT标记试剂盒说明书进行标记（正常组：ZC-1、ZC-2、ZC-3；模型组：MX-1、MX-2、MX-3；消肿组：XZ-1、XZ-2、XZ-3）。各组标记后的肽段等量混合、干燥，使用High-pH反相色谱柱将干燥后的肽段进行分级。最终将上述方法收集到的样品合并为10个组分。每个组分的肽段干燥后用0.1% FA复溶冻干样品，以备LC-MS分析。

（4）LC-MS/MS分析及蛋白质鉴定

参考van den Broek等[11]论述的方法对样品进行LC-MS/MS分析及蛋白质鉴定。使用纳升流速高效液相色谱系统（Easy nLC 1200）进行色谱分离。缓冲液A：0.1%甲酸水溶液；缓冲液B：0.1%甲酸、80%乙腈和水混合溶液。肽段分离后用Q-Exactive HF-X质谱仪进行DDA二级质谱分析。

1.3 数据处理及分析

数据处理使用Proteome Discoverer软件（搜索引擎 Sequest HT）对LC-MS/MS原始RAW文件进行数据库检索（蛋白数据库：uniprot-Rattus norvegicus-[10116]-36181-20210608.fasta，来源网址：https://www.uniprot.org，蛋白数目：36181；下载日期：2021-06-8）。将筛选出的差异蛋白进行GO富集分析，KEGG通路富集分析，共同差异蛋白分析以及差异蛋白相互作用PPI网络分析。

2 结果

2.1 消肿止痛合剂对FIRI模型大鼠的影响

术后7天观察大鼠皮瓣组织坏死程度发现（图1），空白组大鼠皮瓣组织生长良好、色泽红润、弹性好；模型组大鼠皮瓣组织瘀血形成、色泽发黑，皮肤肿胀，弹性差；消肿止痛合剂治疗后，大鼠皮瓣组织瘀血明显减轻，肿胀基本消退，弹性好转。TUNEL染色发现（图1），空白组大鼠皮瓣组织结构正常，核染色清晰、完整，未见明显凋亡细胞；模型组大鼠皮瓣组织结构紊乱，核膜破裂，染色质浓缩，可见大量凋亡细胞；消肿止痛合剂治疗后，大鼠皮瓣组织结构相对完整，略有水肿，核染色较清晰，可见少量凋亡细胞。实验结果提示FIRI可加重皮瓣坏死，而消肿止痛合剂可减轻FIRI造成的皮瓣坏死。

图1 各组大鼠术后7天皮瓣形态及皮瓣组织TUNEL染色

2.2 皮瓣组织蛋白质浓度测定及SDS-PAGE凝胶电泳

通过SDS-PAGE凝胶电泳，验证制备的各组皮瓣组织总蛋白样品，未见明显蛋白质降解，电泳平行性好，蛋白条带清晰（图2）。蛋白浓度测定结果为：正常组（9.49 µg·µL-1）、模型组（11.56 µg·µL-1）、消肿组（7.43 µg·µL-1），满足后续研究TMT-蛋白定量检测及其生物信息分析等实验的要求。

图2 SDS-PAGE凝胶电泳图谱

2.3 蛋白质鉴定、定量分析、聚类分析及差异表达蛋白质筛选

蛋白质定量分析共鉴定到28012个唯一性肽段、5005个蛋白质，其中定量到4996个蛋白质。以上述实验方法（fold change ＞ 1.2且P＜ 0.05）两两比较组间的显著性差异蛋白质结果。与正常组比较，模型组显著差异蛋白表达数共有85个，其中表达上调的蛋白有22个，表达下调的蛋白有63个。与模型组比较，消肿组显著差异蛋白表达数共有273个，其中表达上调的蛋白有141个，表达下调的蛋白有132个。在数据分析中，采用Fold change和P-value两个因素共同绘制火山图，用于表现两组样本数据的蛋白质定量信息以及显著性差异（图3，图4）。并且对目标蛋白进行蛋白质聚类分析，以显示所筛选的目标蛋白质的合理性（图5，图6）。

图3 模型组VS正常组蛋白质定量火山图

图4 消肿组VS模型组蛋白质定量火山图

图5 模型组VS正常组蛋白质聚类分析

图6 消肿组VS模型组蛋白质聚类分析

2.4 生物信息学分析

2.4.1 差异蛋白GO富集分析

FIRI造模后差异表达蛋白质GO功能富集分析，与正常组比较，通过分析模型组中差异表达蛋白GO功能注释及富集，发现其主要涉及细胞及细胞器定位建立、分子转运、单个有机体细胞定位、细胞器定位、免疫反应分子介质产生、免疫球蛋白产生、水解酶活性负调控等生物过程（Biological process，BP）；包括线粒体、线粒体膜部分、细胞质、胞外区域等细胞组分（Cellular compoent，CC）；参与酶活性抑制、肽酶调节、内切酶抑制、多巴胺受体结合等分子功能（Molecular function，MF）（图7）。

图7 模型组VS正常组GO功能富集分析

消肿止痛合剂治疗后差异蛋白质GO功能富集分析，与模型组比较，通过分析消肿组中差异表达蛋白GO功能注释及富集，发现其主要涉及单有机体代谢、细胞组分的发生与结合、分解代谢、酸性物质代谢等生物过程；包括细胞器、细胞器膜部分、细胞质部分、囊泡、线粒体等细胞组分；参与催化、小分子结合、水解酶活化、同种蛋白结合、核苷酸调节等分子功能（图8）。

图8 消肿组VS模型组的GO功能富集分析

2.4.2 差异蛋白KEGG通路富集分析

FIRI造模后差异表达蛋白质KEGG富集分析，与正常组对比，通过分析模型组的差异表达蛋白，富集到KEGG通路共8条（图9）。其中富集程度最高的为心肌收缩信号通路、其次为心肌收缩的肾上腺素能信号通路、细胞周期信号通路、氧化磷酸化信号通路、磷脂酶D信号通路等。这些信号通路涉及到生物体代谢、信号传导及细胞转化等过程。

图9 模型组VS正常组KEGG通路富集分析

消肿止痛合剂治疗后差异表达蛋白质KEGG富集分析，与模型组对比，通过分析消肿组的差异表达蛋白，富集到KEGG通路共12条（图10）。其中富集程度最高的为代谢信号通路、其次为核糖体转录翻译等信号通路、蛋白酶体信号通路、细胞周期信号通路等。这些信号通路主要涉及到生物体代谢、遗传信息的加工处理及细胞转化过程。

图10 消肿组VS模型组KEGG通路富集分析

2.4.3 共同差异蛋白分析

将模型组VS正常组、消肿组VS模型组中相关差异蛋白数据进行分析，得出共同差异蛋白统计结果。在模型组中表达上调，但在消肿组中有表达下调的蛋白有3个；在模型组中表达下调，但在消肿组中表达上调的蛋白有13个；即模型组共有16个表达异常的蛋白在消肿止痛合剂干预后得到纠正（表1）。

表1 模型组与消肿组的共同差异表达蛋白统计

2.4.4 差异蛋白相互作用分析

在生物体中，各种蛋白质发挥其功能必须依赖于多种蛋白质的介导与调节，为了更加清晰的阐述不同蛋白之间的相互作用，借助STRING蛋白相互作用网络分析工具分析，得出PPI图（图11），发现在线粒体核糖核蛋白体（Ribosome）相关信号通路主要涉及到的差异蛋白或基因共有8个，分别为Rpl32、Rps11、Rpl35a、Mrpl4、Mrpl2、Mrpl32、Mrpl34、Mrpl28；在蛋白酶体（Proteasome）信号通路主要涉及到的差异蛋白或基因共有6个，分别为Psmb6、Psma4、Psmb1、Psma2、Psma6、Psmd8；在蛋白传出（Protein export）相关信号通路主要涉及到差异蛋白或基因3个，分别为Srp19、Srp9、Spcs3。在蛋白酶体与线粒体核糖体相互作用中，Mrpl32与Psma2之间存在相互作用，Mrpl34与Psma4存在相互作用。在蛋白酶体与蛋白传出相互作用中，Psmb1与Srp9存在相互关系。

图11 共同差异表达蛋白相互作用网络

3 讨论

FIRI是皮瓣移植术后出现皮瓣坏死的重要原因，其过程是多种致病因素共同作用的结果，属于中医“血瘀”范畴。中药或者中药制剂在治疗FIRI时具有多靶点、全方位的治疗效果。消肿止痛合剂是由当归、川芎、桃仁、红花、赤芍、木香、泽兰等药物构成的复方制剂，具有“活血化瘀、消肿止痛”的功效，对于皮瓣移植术后患者疗效显著，并且课题组在前期研究中发现，消肿止痛合剂可以促进FIRI模型大鼠皮瓣的存活率[6-8]。蛋白组学技术通过对完整的细胞、组织、体液等样品的全部蛋白质进行相应分析研究，可用于药物研发过程中不同的阶段，在现代药物研发过程中具有重要作用[5]。本次实验结合GO功能分析、KEGG通路分析、PPI相互作用分析，筛选出消肿止痛合剂治疗FIRI大鼠可能与线粒体核糖体、20S蛋白酶体等信号通路有关，其中差异蛋白Mrpl32、Psma2、Mrpl34、Psma4、Psmb1可能是治疗的关键靶点。

Mrpl32与Mrpl34是线粒体核糖体复合物（Mitochondrial ribosomal protein，MRP）合成过程中的重要蛋白质亚基，广泛存在于哺乳动物线粒体中，可通过调控线粒体的结构与功能参与生命调节的过程[12]。Cheong等[12]研究发现，在敲除小鼠Mrpl32与Mrpl34基因后，小鼠胚胎细胞内的线粒体调节发生紊乱，原肠胚形成障碍，导致胚胎的生长发育受到限制，提示Mrpl32与Mrpl34通过调节线粒体功能而维持细胞稳态。有研究表明，MrpL32与线粒体内膜紧密结合，参与线粒体蛋白体的组装过程，在线粒体翻译以及维持翻译相对稳定性起重要作用，此外，MrpL32还可促进线粒体的成熟[13]。在IRI过程中，由于线粒体稳态的破坏以及线粒体核糖体功能的紊乱，引起了线粒体内膜上的氧化磷酸化过程被抑制，细胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的释放增加，线粒体的分裂与融合发生失衡，从而可导致组织器官的进一步损伤[14]。Xie等[15]发现在脑IRI模型中，外源性线粒体移植可降低细胞内ROS的表达水平并减少细胞凋亡，对脑组织起保护作用，提示线粒体在IRI中具有保护作用。此外，线粒体功能与血管内皮的生长密切相关。线粒体内ROS介导的氧化应激反应会加速血管内皮细胞的衰老与死亡，这可能与ROS导致了线粒体的融合与分裂失衡[16]，引起了线粒体DNA突变[17]，以及与线粒体自噬功能密切相关[18]，提示线粒体功能的丧失可能会导致细胞死亡。线粒体相关动力蛋白-1（Dynaminrelated protein-1，DRP-1）可引起组织器官的IRI，有研究发现，下调DRP-1对缺血缺氧条件下的皮瓣组织具有保护作用[19]。Zhou等[20]研究发现，通过抑制DRP-1的表达,可以阻止线粒体膜渗透性转换孔（Mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的开放以及PINK1/Parkin信号通路的激活，从而下调细胞内ROS的表达，减轻血管内皮的损伤，保护血管内皮屏障的完整性。MRP是线粒体发育、成熟的关键分子，该分子的缺失可导致线粒体相关结构与功能发生障碍，从而破坏细胞内环境的稳态，造成细胞凋亡。本次实验结果中，正常组与模型组对比，IRI后皮瓣中Mrpl32表达降低，MRP的合成减少，线粒体功能被抑制，从而导致皮瓣瘀血水肿；经过消肿止痛合剂干预后，靶点蛋白MrpL32表达升高，并恢复MRP的功能，加快线粒体功能的恢复，可为缺血缺氧皮瓣组织提供一定的能量，并减少ROS的氧化损伤，可能有利于皮瓣组织的恢复。因此，消肿止痛合剂可能通过调控MRP通路，恢复线粒体功能，从而防治IRI皮瓣的坏死。

Psma（α亚基）与psmb（β亚基）是形成20S蛋白酶体核心颗粒的关键性亚单位，其与19S调节颗粒等共同形成的26S蛋白酶体复合物，可介导真核生物体内绝大多数蛋白质的降解，并且通过不同的途径参与生物体内细胞凋亡、自噬、DNA翻译转录、细胞代谢以及免疫应答等几乎全部的生命过程[21-22]。20S蛋白酶体在体内蛋白质降解过程中起核心催化作用[23]。Psma2与Psma4位于20S蛋白酶结构的外侧，可识别与控制底物蛋白进入20S蛋白酶体内进行降解，可以有效防止非目标蛋白的错误降解[24-25]。Psmb1参与20S蛋白酶体内侧结构的构成，发挥降解底物蛋白的作用[26]。其中，Psmb1由于亚基上有蛋白酶活性，具有催化作用，因此可以切割底物蛋白上的酸性残基，是20S蛋白酶体的活性中心之一，在底物蛋白的降解过程中具有重要作用[27]。大量的文献报道，IRI的早期治疗中，可以通过蛋白酶体抑制剂MG132抑制蛋白酶体的功能从不同信号通路减轻IRI过程中出现的再次损伤[28]。但有部分研究表明蛋白酶体在IRI的治疗中具有重要作用。Patel等[29]通过研究蛋白酶体肽酶活性与肺IRI的功能和形态学后果之间的联系，发现在肺IRI后24-72 h后，蛋白酶体失活状态逐步解除，168 h后，蛋白酶体的活性持续增加，这表明了蛋白酶体在缺血缺氧组织的修复过程中可能具有重要作用。Yang等[30]研究发现，Psmb4在心肌IRI后可以通过干预NF-κB信号通路抑制心肌细胞凋亡，提示蛋白酶体在改善心肌IRI有积极意义。此外，20S蛋白酶体在急性氧化应激反应中，可以通过ATP/泛素非依赖性蛋白降解发挥作用，标记并降解氧化蛋白，减轻氧化应激的对组织器官的损害[31]。皮瓣移植术后新生血管的建立是皮瓣成活的关键过程。岳彩霞等[32]研究发现，在肿瘤血管的生成过程中，MG132可以通过抑制RhoA通路对缺氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）和VEGF表达的上调,来抑制肿瘤微血管的生成，从而达到治疗肿瘤的目的。Ren等[33]发现通过抑制泛素蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system，UPS）相关基因可以抑制VEGF的表达以及宫颈癌的发育，提示蛋白酶体系统与微血管再生之间可能有一定的联系。蛋白酶体系统与炎症反应，氧化应激反应、微血管再生有关，且前期研究表明，消肿止痛合剂可以减轻炎症反应等对IR皮瓣的损伤，并可促进皮瓣组织微血管再生。本次实验中通过模型组与空白组的对比，Psma2与Psma4在模型组中下调，提示IR损伤后蛋白酶体的功能被抑制，而经过消肿止痛合剂干预后，上述靶点蛋白的表达上调，提示消肿止痛合剂可改善IR损伤皮瓣中蛋白酶体结构与功能的抑制，从而发挥抗皮瓣坏死的作用。因此，消肿止痛合剂可能通过干预蛋白酶体系统从而防治IRI皮瓣的坏死。

综上所述，此次研究采用TMT蛋白质组学技术及生物信息学分析方法分析了消肿止痛合剂对FIRI模型大鼠的皮瓣组织，结果显示共同差异蛋白Mrpl32、Mrpl34、Psma2、Psma4、Psmb1可能是消肿止痛合剂抗FIRI的关键靶点蛋白；主要涉及线粒体核糖体的转录翻译、20S蛋白酶体合成等生物过程；其介导的线粒体核糖体、泛素蛋白酶体系统等重要信号通路参与FIRI的保护过程。该研究为FIRI的中医药治疗提供了新的靶点和研究新思路，对FIRI发病机制、新靶点药物开发、临床治疗等具有重要指导意义。