基于植物代谢组学和网络药理学分析预测鸡骨草药材的质量标志物*

徐月阳，史军杰，彭丽华，方碧烟，陈炜璇，成金乐**

（1.广州中医药大学中药学院 广州 510006；2.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心/岭南中药资源教育部重点实验室 广州 510006；3.国家中成药工程技术研究中心 南药研发实验室 广州 510006；4.中山市中智药业集团有限公司 中山 528437）

鸡骨草为豆科植物广州相思子Abrus cantoniensisHance的干燥全株，始载于《岭南采药录》，别名黄头草、黄仔强。其味甘、微苦，性凉，归肝、胃经，具有利湿退黄、清热解毒、疏肝止痛的功效，用于治疗湿热黄疸、胁肋不舒、胃脘胀痛、乳痈肿痛[1]等症。鸡骨草主要分布于广东、广西壮族自治区、福建及海南等地区，含有多种化学成分，如氨基酸、酚类、强心苷、三萜类、黄酮类、香豆素类、生物碱类、植物甾醇、多糖类等，其中生物碱类、黄酮类、三萜类是其主要化学成分[2-3]。现代药理研究表明，鸡骨草具有抗癌、抗菌、抗氧化、促进伤口愈合、降脂保肝、增强免疫等作用[4-9]。在临床上与其他中药配伍还可以应用于治疗慢性肝炎、黄疸型肝炎、胆囊炎、肝硬化腹水、母儿ABO血型不合[10-14]等疾病。

中药质量标志物（Q-Marker）的概念在2016年由刘昌孝院士提出[15]，近年来，在中药材、中药饮片、中药复方的研究中广泛应用，其从传递与溯源、成分特有性、有效性、可测性以及复方配伍5个方面开展科学研究[16]，为中药全程质量控制研究提供了新的研究思路。植物代谢组学是采用液质、气质、核磁等技术方法通过对药用植物的次生代谢产物进行分析，结合多元统计学分析方法，从整体上探讨药用植物化学成分的分布规律[17]。网络药理学利用大数据统计技术结合系统生物学和网络生物学将药物作用与生物学网络整合，综合分析在网络中药物与节点或网络模块的关系，具有整体性和系统性的特点，在中药学领域中可应用于阐述中药多成分和多靶点的网络关系、筛选中药的活性成分、阐述中药药效作用机制等[18]。

鸡骨草作为药食同源品种在民间广泛应用，《中国药典》2020年版中，鸡骨草仅以浸出物等作为质量控制指标[1]，缺乏活性成分的含量测定指标，且目前对鸡骨草的药效物质基础及作用机制的相关研究报道较少。因此，本研究结合中药的Q-Marker理念，基于植物代谢组学、多元统计学、网络药理学相结合的方法预测鸡骨草药材的潜在Q-Marker，以期为鸡骨草药材的质量控制和药效物质基础研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器与软件

M150型中药磨粉机（金华市旋风药材机械厂）；UPLC-QTOF-MS液质联用系统：ACQUITY UPLC HClass型超高效液相色谱串联Xevo G2-XS QTOF型四极杆飞行时间质谱（美国waters公司）；UNIFI Portal工作站（美国waters公司）；KQ-700DE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204型万分之一、MS105型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；SPSS26.0软件（美国IBM公司）；SIMCA14.1软件（瑞典Umetrics公司）；TBtools软件（https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）；Openbabel 3.1.1软件（https://openbabel.org/wiki/Main_Page）；Cytoscape 3.8.2 软件（Cytoscape Consortium； https:// cytoscape.org/）；Pymol 2.4.0软件（美国Schrodinger公司；https://github.com/schrodinger/pymol-open-source），AutoDock 4.2.6软件（美国Scripps研究所；https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/）。

1.2 试剂与试样

甲醇、乙腈（质谱级，美国默克公司）；水（屈臣氏，广州屈臣氏食品饮料有限公司）；甲酸（质谱级，德国默克公司）；葫芦巴碱（纯度：98%，上海源叶生物科技有限公司）；维采宁-2（批号：PS012054，纯度：98.0%）；下箴刺桐碱（批号：PS000241，纯度：98.0%）；异夏佛塔苷（批号：PS001083，纯度：98.0%）均购自成都普思生物科技股份有限公司；相思子碱（批号：111808-202003）；夏佛塔苷（批号：111912-201703，纯度：95.6%）均购自中国食品药品鉴定研究院；实验用11批次鸡骨草药材采集于主产地广西壮族自治区灵山、平南等地，经中智药业集团有限公司贾世清中药师鉴定为豆科植物广州相思子（Abrus cantoniensisHance），药材来源信息详见表1。

表1 11批次鸡骨草药材来源信息

2 方法

2.1 鸡骨草药材供试品和对照品溶液的制备

取鸡骨草药材适量，粉碎，过3号筛，精密称取粉末1 g，置150 mL的具塞锥形瓶中，加入30%甲醇15 mL，精密称定重量，超声提取45 min（功率560 W，频率40 kHz），冷却，再称定重量，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，倒入50 mL的离心管中，离心5 min（9000 r·min-1），取上清液2 mL，经0.22 µm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

用十万分之一电子天平精密称取葫芦巴碱、维采宁-2、相思子碱、下箴刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品适量，分别置于10 mL的容量瓶中，后用甲醇定容至刻度线，超声处理15 min，得对照品浓度依次为0.988 mg·mL-1、1.167 mg·mL-1、1.201 mg·mL-1、1.370 mg·mL-1、1.089 mg·mL-1、1.182 mg·mL-1的对照品储备液，于4℃贮藏，备用。取配置好的对照品储备溶液各1 mL于20 mL的容量瓶中，后加甲醇定容至刻度线，混匀，过0.22 µm微孔滤膜，即得葫芦巴碱浓度为49.40 µg·mL-1、维采宁-2浓度为58.35 µg·mL-1、相思子碱浓度为60.05 µg·mL-1、下箴刺桐碱浓度为68.50 µg·mL-1、夏佛塔苷浓度为54.45 µg·mL-1、异夏佛塔苷浓度为59.10 µg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2 色谱及质谱条件

色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 µm）色谱柱；ACQUITY UPLC柱在线过滤器；流速：0.3 mL·min-1；柱温：35℃；进样量：1 µL；流动相：乙腈（A）-0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序为：0-8 min:0%-8%（A）；8-10 min:8%-12%（A）；10-18 min:12%-19%（A）；18-20 min:19%-24%（A）；20-32 min:24%-38%（A）；32-41 min: 38%-52%（A）；41-45 min: 52%-67%（A）；45-60 min:67%-90%（A）；60-63 min:90%-0%；63-70 min:0%-0%（A）。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），毛细管电压：3.0 kV（ESI+），离子源温度：140℃，锥孔电压：40 V，锥孔气流速：50 L·h-1，脱溶剂气温度：450℃，脱溶剂气流速：800 L·h-1，高能量通道碰撞电压：20-40 eV，低能量通道碰撞电压：6 eV，质量扫描范围100-1200 m·z-1，采用亮氨酸-脑啡肽进行精确质量校正（[M-H]-为554.2620，[M+H]+为556.2766）。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS方法学考察

2.3.1 精密度试验

取适量鸡骨草药材，按2.1项下供试品制备方法制备供试品溶液，并按2.2项下色谱质谱条件连续进样6次，进行测定，计算6个已知化学成分（与对照品比对）的保留时间和响应值的RSD值分别为0.1%-0.4%和1.62%-3.35%，结果表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性试验

精密称取同一鸡骨草样品适量，按2.1项下供试品制备方法制备供试品溶液，平行制备6份，并按2.2项下色谱质谱条件进行测定，计算6个已知化学成分（与对照品比对）的保留时间和响应值的RSD值分别为0.11%-0.13%和1.75%-5.24%，结果表明该方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取适量鸡骨草药材，按2.1项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h下按2.2项下色谱质谱条件进行测定，计算6个已知化学成分（与对照品比对）的保留时间和响应值的RSD值分别为0.61%-1.22%和2.31%-4.99%，结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.4 鸡骨草化合物鉴定解析

2.4.1 鸡骨草化合物的检索和整理

利用中国知网（https://www.cnki.net/）、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SciFinder（https://scifinder-n.cas.org/）、PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、ChemSpider（http://www.chemspider.com/）等网站检索鸡骨草化学成分研究的相关文献，收集文献中有关鸡骨草化学成分的分子式、CAS号、化学名等信息汇总到Excel表格中，共103个化合物信息。登录SciFinder网站，根据收集到的有关鸡骨草化学成分的CAS号检索化学成分的结构式，下载结构式的mol文件格式，将化学成分Excel信息表和结构式文件放入同一个文件夹中导入UNIFI软件中，补充UNIFI软件本地中药数据库的鸡骨草化学成分信息。

2.4.2 11批次鸡骨草药材化学成分的鉴定分析

按照“2.2”项下的色谱质谱条件进样后，得到11批次鸡骨草药材样品的质谱数据，后将质谱数据通过UNIFI软件处理，与文献收集的成分和本地鸡骨草数据库化学成分信息比对，设置鉴定参数为响应值≥5000，质量差≤5 ppm，并进一步通过对照品及文献报道数据比对精确分子质量、特征碎片离子、保留时间等信息进行鉴定。将所鉴定的成分结果导出并汇总到Excel表中，通过分析11批次鸡骨草药材的化学成分，筛选得到共有成分。为了比较不同批次间所含共有成分的含量差异，利用TBtools软件根据其响应值对成分进行热图分析。

2.5 多元统计学分析

利用SPSS26.0软件，以11批次鸡骨草药材中共有成分的响应值为变量，对数据进行标准化处理，选用Ward联结法作为聚类方法，以平方欧式距离计算测量区间，进行聚类分析。利用SIMCA14.1软件，以11批次鸡骨草药材中共有成分的响应值为变量进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA），找出造成鸡骨草药材分类的主要含量差异成分。

2.6 网络药理学研究

2.6.1 活性成分筛选及靶点预测

通过PubChem网站查询上述主要含量差异成分的smiles号，将smiles号输入Swiss ADME数据库（http://www.swissadme.ch/）中以判断其是否具有活性，以胃肠道吸收（GI absorption）显示为“High”，类药性（Druglikeness）项下的5个参数（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）至少满足两个“Yes”为标准筛选出符合条件的潜在活性成分。将潜在活性成分的smiles号输入Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）中设置物种为“Homo sapiens”进行预测，以表格中“Probability＞0”作为筛选标准预测化合物的靶点信息。

2.6.2 “含量差异潜在活性成分-潜在靶点”网络图的构建

在Excel表中整理11批次鸡骨草药材中含量差异潜在活性成分和潜在靶点的网络信息表及类型表，导入Cytoscape 3.8.2软件进行绘制“含量差异潜在活性成分-潜在靶点”的网络图。

2.6.3 蛋白质与蛋白质互作网络分析（Protein-Protein Interaction，PPI）及核心靶点筛选

为了进一步筛选出核心靶点，在STRING数据库（https://www.string-db.org/）中导入上述潜在靶点信息的基因名，物种选择“Homo sapiens”，将获得的PPI数据下载其信息文件后导入Cytoscape 3.8.2软件进行绘制PPI图，使用软件工具中的“Analyze Network”分析其拓扑参数，下载信息表并用Excel表处理，计算靶点信息的Degree值和Betweenness Centrality（中介中心性）值的中位数，以同时满足大于等于两者2倍中位数为标准筛选出核心靶点。

2.6.4 核心靶点的基因本体（Gene ontology，GO）功能富集分析与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

在Metascape数据库（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）中上传核心靶点的基因名，物种选择“H.sapiens”，点击“Custom Analysis”，在“Enrichment”界面分别进行GO分析和KEGG分析，点击Analysis Report Page，下载所有的注释结果（All in One Zip），根据所得结果绘制GO分析柱状图及KEGG分析气泡图。

2.6.5 “核心成分-核心靶点-核心通路”网络图的构建

筛选出富集核心靶点蛋白较多的前20条信号通路，在Excel表中整理核心靶点相关的前20条核心通路和涉及相关核心成分的网络信息表及类型表，导入Cytoscape 3.8.2软件进行绘制“核心成分-核心靶点-核心通路”的网络图。

2.6.6 分子对接验证

以上述“核心成分-核心靶点-核心通路”网络图中Degree值排名靠前的两个核心成分为配体，在PubChem网站中下载其3D结构的sdf文件格式，并在Openbabel 3.1.1软件中转换sdf格式为pdb格式。以网络图中Degree值排名前五的核心靶点作为受体，并在RCSB PDB网站（https://www.rcsb.org/）中下载核心靶点蛋白3D结构的pdb文件。利用Pymol 2.4.0软件对核心靶点蛋白进行去水、去配体处理，用AutoDock 4.2.6软件对配体和处理过的受体进行加氢、加电荷等操作，并进行分子对接，以获得最佳活性位点，得到配体与受体的结合能。并将2个核心成分最优结合模式的对接结果导入Pymol 2.4.0软件，绘制成三维图进行可视化展示。

3 结果

3.1 鸡骨草化学成分分析

通过对11批次鸡骨草药材的质谱数据进行鉴定分析，将所鉴定的成分结果导出并汇总到Excel表中，筛选得到39个共有成分，以ACH1样品为例，总离子流图见图1，共有化学成分鉴定结果详见表2，分别为17个三萜皂苷类、10个黄酮类、3个异黄烷醌类、2个生物碱类、2个色原酮类、2个醇类、1个氨基酸类、1个蒽醌类、1个三萜类成分。通过热图分析（见图2），图中颜色越深表示响应值越大，从图中看出Soyasaponin I、Quebrachitol、Abrine、Isoschaftoside、Isobiflorin、Hypaphorine、Schaftoside、Biflorin、Arginine这9个化学成分在不同批次间成分含量均较高。

图1 鸡骨草ACH1样品的UPLC-Q-TOF-MSE总离子流图

图2 11批次鸡骨草药材中39个共有成分的热图分析

表2 11批次鸡骨草药材的共有成分

3.2 多元统计学分析

3.2.1 聚类分析

利用SPSS26.0软件，以11批次鸡骨草药材中39个共有成分的响应值为变量进行聚类分析，结果见图3，当平方欧式距离为15时，11批次鸡骨草样品被分为4类，ACH1、2、3、4聚为一类，ACH5为一类，ACH6、9、10、11聚为一类。ACH7、8聚为一类，说明不同来源鸡骨草药材之间存在一定的差异。

图3 11批次鸡骨草药材的聚类分析图

3.2.2 主成分分析和正交偏最小二乘判别分析

利用SIMCA14.1软件，以11批次鸡骨草药材中39个共有成分的响应值为变量进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析，结果见图4和图5所示，图中不同颜色的圆点代表不同产地的鸡骨草药材，主成分分析计算结果显示4个主成分的累计贡献率为83.7%，且从图中看出可以将11批次鸡骨草药材分为4类，ACH1、2、3、4为一类，ACH5为一类，ACH6、9、10、11为一类。ACH7、8为一类，分类结果与聚类分析结果相一致。为进一步找出造成分类差异的因素，进行正交偏最小二乘判别分析，模型的主成分回归系数Q2Y＝0.628＞0.5，说明模型的预测能力较强，反映样本具明确分离的趋势；R2Y＝0.919，说明模型对因变量变异贡献的百分比为91.9%，模型的拟合度较好，对建立的模型进行200次的置换检验，得到Q2回归线的截距为负值（见图6），表明所构建的OPLS-DA模型具有较好的预测能力及有效可用。从OPLS-DA图中提取重要性变量的VIP（Variable Importance for the Projection）值，结果见图7，对其变量的VIP值进行排序，显示化学成分Quebrachitol（2.335 98）、Arginine（2.209 89）、Abrine（1.997 67）、Isobiflorin（1.925 93）、SoyasaponinⅠ（1.809 06）、Hypaphorine（1.759 42）、Isoschaftoside（1.668 29）、Biflorin（1.579 85）、Schaftoside（1.532 21）的VIP值大于1，结合上述热图分析结果表明鸡骨草药材中以上9个化学成分的含量差异是影响11批次鸡骨草药材分类的主要因素。

图4 11批次鸡骨草药材PCA-X得分图

图5 11批次鸡骨草药材OPLS-DA得分图

图6 OPLS-DA模型的排列检验图

图7 11批次鸡骨草药材共有成分的VIP得分图

3.3 含量差异成分的活性筛选与靶点预测

利用Swiss ADME数据库以判断上述9个含量差异成分是否具有活性，结果这9个化合物均为潜在活性成分。通过Swiss Target Prediction数据库预测这9个潜在活性成分的靶点信息，预测出的靶点删除重复值后共得到166个靶点信息。

3.4 含量差异潜在活性成分的“成分-靶点”网络图的构建

将9个潜在活性成分及166个潜在靶点分别导入Cytoscape 3.8.2软件中，构建“含量差异潜在活性成分-潜在靶点”网络图如图8所示，并进行“Analyze Network”分析其拓扑参数，图中共产生了175个节点，223条边，其中红色代表活性成分，蓝色代表靶点基因。每个成分作用于多个靶点，每个靶点平均作用于2个成分，存在多成分多靶点相互作用的现象。网络图中的节点以度值（Degree）计算，Degree值表示网络中节点与靶点相连的边数，Degree值越大，其节点形状越大，颜色越深，进一步说明该节点在网络图中的作用大。从图中看出Hypaphorine（degree 103）、Abrine（degree 71）这2个成分作用的靶点多，影响大。

图8 “含量差异潜在活性成分-潜在靶点”网络图

3.5 蛋白互作PPI网络构建及核心靶点筛选

将上述9个潜在活性成分的166个潜在靶点信息的基因名导入STRING数据库中进行PPI分析，结果获得159个靶点的蛋白质互作信息，下载其信息文件后导入Cytoscape 3.8.2软件进行绘制PPI图，通过分析其拓扑参数，以同时满足大于等于靶点信息的Degree值和Betweenness Centrality值的中位数的2倍为标准筛选出核心靶点，结果见图9，共筛选出29个核心靶点（见表3）。

图9 蛋白质与蛋白质互作核心靶点筛选图

表3 29个核心靶点信息

3.6 GO功能和KEGG通路分析结果

利用Metascape数据库对29个核心靶点进行GO分析和KEGG分析，GO分析包括生物过程（Biological process，BP）、细胞组分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）3个部分，GO分析共富集480个条目，其中BP有368个条目，主要富集在血管发育、细胞激活、细胞分化的负调控、正向调节转移酶活性等过程，CC有61个条目，主要富集在膜筏、膜微区、突触膜等区域，MF有51个条目，主要富集在蛋白激酶结合、核受体活性、配体激活的转录因子活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等功能，分别选取BP、CC、MF的LogP值最小的排名前10的条目绘制柱状图（见图10）。KEGG分析共富集了86条通路，主要涉及的通路有癌症通路（Pathways in cancer）、血脂和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、肺小细胞癌（Small cell lung cancer）、轴突引导（Axon guidance）、糖尿病并发症AGR受体信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等，通过Excel表处理选取LogP值最小的排名前20的核心通路并绘制气泡图（见图11），结果表明，鸡骨草药材中的化学成分通过作用于多靶点进而调控多条通路从而发挥治病疗效。

图10 GO功能富集分析柱状图

图11 KEGG通路富集分析气泡图

3.7 鸡骨草“核心成分-核心靶点-核心通路”网络分析

将29个核心靶点相关的前20条核心通路和涉及的4个核心成分分别导入Cytoscape 3.8.2 软件进行绘制“核心成分-核心靶点-核心通路”的网络图，结果见图12，圆形代表核心成分，菱形代表靶点，V形代表通路，共有53个节点，178条边，并进行“Analyze Network”分析其拓扑参数，结果显示，Degree值较大的前两个成分为Hypaphorine（degree 17）、Abrine（degree 12），前两个靶点为PIK3CA（degree 20）、JUN（degree 13）、前两个通路为Pathways in cancer（degree 15）、Lipid and atherosclerosis（degree 10）。鸡骨草具有清热解毒的功效，清热解毒类中药大多具有抗肿瘤的作用[19]，通过提取主要的节点网络图发现（见图13），Hypaphorine通过作用于PIK3CA、ITGB1、PTGS2、MMP9、PPARG、CXCL8、RHOA靶点及Abrine作用于CTNNB1、CDK2、NOS2靶点进而对癌症通路产生作用，从而发挥鸡骨草清热解毒的功效。Hypaphorine还通过作用于PIK3CA、ITGB1靶点及Abrine作用于CDK2靶点进而对PI3K-Akt信号通路产生作用。PI3K-Akt信号通路参与调控细胞的基本进程，其中包括细胞的生长、转录、翻译、增殖及糖原代谢等，相关研究表明PI3K-Akt信号通路在癌症如胰腺癌[20]、胃癌[21-22]、肝癌[23]、宫颈癌[24]等，糖脂代谢[25-26]，帕金森症[27]，肌少-骨质疏松症[28]等发挥重要作用。并且从图12中显示Hypaphorine作用于PIK3CA、CXCL8、MMP9靶点及Abrine作用于CDK2靶点也对乙型肝炎信号通路产生作用，结合鸡骨草疏肝止痛的功效作用进一步说明下箴刺桐碱（Hypaphorine）和相思子碱（Abrine）为鸡骨草药材的主要活性成分。

图12 “核心成分-核心靶点-核心通路”网络图

图13 核心网络图

3.8 分子对接结果

以上述核心网络图中相思子碱和下箴刺桐碱为配体，核心靶点PIK3CA、JUN、RHOA、ITGB1、CTNNB1为受体，将这2个核心成分与5个核心靶点进行分子对接，结果见表4，根据文献研究表明[29]，结合能＜0表示配体和靶点蛋白能自发进行结合，结合能≤-4.0 kcal·mol-1表示配体和靶点蛋白具有较好的结合活性，数值越低结合强度越大。相思子碱与核心靶点RHOA、ITGB1及下箴刺桐碱与核心靶点RHOA、ITGB1、JUN的结合能均小于-4.0 kcal·mol-1，使用Pymol 2.4.0软件对相思子碱和下箴刺桐碱与核心靶点蛋白RHOA得到的最优结合模式进行可视化处理，结果见图14，表明鸡骨草药材中相思子碱和下箴刺桐碱具有较好的生物活性。

图14 成分与靶点分子对接图

表4 成分与核心靶点蛋白的结合能

4 Q-Marker的预测分析

本研究通过对11批次鸡骨草药材的共有成分进行多元统计学分析，获得了造成多批次鸡骨草药材分类的主要含量差异性成分，并进行网络药理学分析，建立“核心成分-核心靶点-核心通路”的网络图，大豆皂苷I（Soyasaponin Ⅰ）为豆科植物中常见的化学成分[30]，精氨酸（Arginine）在植物中广泛存在均不易作为鸡骨草药材的Q-marker。根据度值的大小，相思子碱和下箴刺桐碱在网络图中起主要作用，且通过液质分析表明11批次鸡骨草药材中相思子碱和下箴刺桐碱的响应值均较高，为不同来源11批次鸡骨草药材所共有，这两个成分通过作用靶点进而对与鸡骨草药材清热解毒、疏肝止痛功效相关的通路产生作用。并根据Q-Marker理念中的可测性、有效性结合文献研究对这2个化合物进行分析，黄平等[31]采用反相高效液相色谱法，色谱柱选用Kromasil C18，以甲醇-乙腈-水-冰醋酸-三乙胺为流动相，检测波长为220 nm，流速为1.0 mL·min-1，建立了鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的含量测定方法。徐柯心等[32]采用超高效液相色谱法，选用色谱柱为HSS T3柱，以乙腈-0.2%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.3 mL·min-1，柱温为30℃，检测波长为270 nm，建立了能同时测定鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的含量测定方法，体现了所预测的鸡骨草药材Q-Marker的可测性。钟正贤等[33]、陈学芬等[34]将鸡骨草提取物中分离出的相思子碱和下箴刺桐碱分别作用于小鼠耳廓肿胀、小鼠肝损伤及黄疸小鼠模型，结果表明相思子碱和下箴刺桐碱均能明显减少小鼠耳廓肿胀的重量，能降低肝损伤小鼠和黄疸小鼠模型血清中的总胆红素含量及转氨酶活性，还通过测定其对小鼠溶血素抗体生成的影响，发现相思子碱和下箴刺桐碱均能增加免疫器官胸腺、脾脏的重量，表明相思子碱和下箴刺桐碱具有抗炎、退黄降酶、抗肝损伤及免疫增强的作用，体现了所预测的鸡骨草药材Q-Marker的有效性。以上文献研究为所预测鸡骨草药材的Q-Marker提供了有利依据，也进一步表明所预测鸡骨草药材Q-Marker的合理性。

5 讨论

中药质量是中医药产业健康发展的生命线，中药质量的好坏在中医发挥临床疗效的方面至关重要，中药作为天然产品，其质量受诸多因素的影响。因此，为保证生产出质量优良且疗效稳定的中药品种，需要建立科学的质量评价体系，中药质量标志物（QMarker）的提出，为中药的质量标准和质量控制研究提供了新的科研思路。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS方法分析11批次鸡骨草药材的化学成分，获得39个共有成分，主要为三萜皂苷类、黄酮类、生物碱类成分。鸡骨草中皂苷类成分具有抗肝癌、抗乙型病毒性肝炎、保护化学性及免疫性肝损伤等[35-37]作用，黄酮类成分具有抗氧化、保护肝损伤、防治胃溃疡等[38-40]作用，生物碱类成分具有抗炎、退黄降酶、抗肝损伤及免疫增强的作用[33-34]。以共有成分作为Q-Marker的备选成分，先以共有成分的响应值为变量进行多元统计学分析，初步筛选出影响多批次鸡骨草药材分类的主要9个化学成分，且这9个化学成分在鸡骨草药材中的含量均较高选为QMarker的候选化学成分，后进一步通过网络药理学结合文献研究预测相思子碱和下箴刺桐碱为鸡骨草药材的Q-Marker。Q-Marker相思子碱和下箴刺桐碱，均具有抗炎、退黄降酶、抗肝损伤及免疫增强的作用。

核心靶点PIK3CA、JUN、RHOA、ITGB1、CTNNB1与鸡骨草Q-Marker抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗肝癌作用等相关。核心靶点PIK3R1与癌症、免疫缺陷、发育障碍有关[41]，CTNNB1与结直肠癌、肝细胞癌、卵巢癌相关，JUN与恶性肿瘤相关，RHOA与肿瘤细胞的增殖和转移相关，ITGB1与促进胶质瘤细胞增殖、食管癌相关[42-43]。分子对接验证了鸡骨草Q-Marker与核心靶点PIK3CA、JUN、RHOA、ITGB1、CTNNB1均能自发进行结合，并与RHOA、ITGB1有较好的结合活性，理论上证实了Q-Marker较好的生物活性，且这些核心靶点作用于与鸡骨草药材清热解毒功效相关的主要核心通路癌症通路（Pathways in cancer）。基因本体富集分析中生物过程主要涉及细胞激活、细胞分化的负调控、正向调节转移酶活性等；分子功能涉及蛋白激酶结合，配体激活的转录因子活性等；细胞组成主要为膜筏、膜微区、突触膜等。由此可知核心靶点、核心通路、Q-Marker存在紧密的相关性，后期可在本研究的基础上进一步结合实验研究证明其关联性。

本研究首次结合植物代谢组学、多元统计学和网络药理学从化学、数理统计和生物信息学的角度预测分析了鸡骨草药材的Q-Marker，后结合文献证明其合理性，为鸡骨草药材及相关制剂的质量标准提升和质量控制研究提供了科学依据。通过网络药理学分析结果所获得的靶点和通路，可为后续鸡骨草药材的药效和药理作用机制研究提供参考。