基于转录组的党参NBS-LRR家族基因鉴定及表达分析*

赵光辉，董林林，宁康，怀浩，程宇飞，张娟，郭笑彤**

（1.鲁东大学农学院 烟台 264025；2.中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

党参（CODONOPSIS RADIX）是我国常用的补气益血的中药材，为桔梗科草本植物党参（Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.）、素花党参Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta （Nannf.）L.T.Shen或川党参Codonopsis tangshenOliv.的干燥根，含有多糖、炔苷类、生物碱类、黄酮类、木质素类等多种活性成分，在调节免疫、调节糖代谢、延缓衰老、抗氧化、抗肿瘤、保护胃肠黏膜等方面发挥重要作用，主要用于治疗气血不足、脾胃虚弱、食少疲乏等[1]。2020年1月6日，国家卫生健康委、国家市场监管总局联合发布了《关于对党参等9种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知》，对甘肃党参定义为药食同源物质并展开生产经营试点工作。

随着党参市场需求的逐渐增加，党参的种植面积也持续扩大。然而连作障碍问题日益突出，导致党参病害泛滥，严重制约党参产业发展，其中根腐病害已经成为致使党参减产的主要原因[2]，而尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是党参根腐病的主要致病菌[3]。目前主要通过栽培管理措施优化和化学农药喷施等方法来减少党参病害的发生[3-4]，但是效果并不理想。因此，高抗病的党参新品种培育是解决党参根腐病害难题的迫切需要，而抗病机制解析是党参优良高抗新品种培育的前提条件之一。

在植物生长发育进化过程中，常受各类病原微生物的威胁，产生一系列的免疫调控反应[5]。在植物的免疫反应过程中，抗病基因R在抵御病原菌入侵的过程中发挥着至关重要的作用[6-8]。目前已经有100多种植物的抗病基因被克隆出来，如大豆[9-10]、谷子[11]、马铃薯[12]、拟南芥[13]、大麦[14]、甘蓝[15]、水稻[16]等。植物的抗病基因家族蛋白具备一些共有的结构域，包括卷曲螺旋（Coiled-coil，CC），核苷酸结合位点（Nucleotide-binding sites，NBS），Toll-白介素-1受体（Toll-interleukin-1 receptor，TIR），富含亮氨酸的重复单元（Leucine-rich repeat，LRR）等[17]。根据这些抗病基因不同的结构域将植物的抗病基因R所编码的蛋白分为5类，其中NBS-LRR家族基因数目最多[18]，具有重要的研究意义。NBS-LRR家族根据N端的结构不同分为TIR类（含TIR结构域）和Non-TIR类（含有螺旋卷曲结构CC或其他特殊结构）[17]。有研究把NBS-LRR家族成员分为TNL（TIR-NBS-LRR）、CNL（CC-NBS-LRR）和RNL（RPW8-NBS-LRR）三个亚家族[19-20]。NBSLRR家族基因的结构与表达分析为植物抗逆机制解析提供数据支撑。在中药研究领域，发现人参NBSLRR家族抗病基因具有明显的功能分化和器官特异性[21]。本研究针对党参NBS-LRR家族中的TNL和CNL两个亚家族进行分析，通过研究其编码蛋白的理化性质、研究其基因结构、析系统发育进化关系、探究抗病蛋白互作网络以及表达模式，以阐明党参NBS-LRR家族基因的特性，为党参抗病机制的解析，根腐病害难题的解决和党参抗病品种的选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 党参NBS-LRR家族抗病基因鉴定、基因理化性质分析和亚细胞定位预测

接菌实验是对党参根部接种尖孢镰刀菌（F.oxysporum），分别于接菌后0、6、24、72、120 h采集党参根部样品，提取RNA并进行转录组测序（此实验为本课题组先前的研究结果，未发表，用于解析党参对根腐病尖孢镰刀菌的响应机制）。利用R基因家族Pfam号在党参转录组数据库中检索PF01582、PF13676（TIR domain）；PF00931（NB-ARC domain）；PF00560、PF12799、PF07723、PF13855、PF13306、PF13516、PF14580（LRR domain）；PF05659（RPW8 domain），获得党参抗病家族候选基因ID和基因信息。将候选基因的蛋白序列输入在线网站NCBI数据库中的Web CD-Search Tool（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）以及SMART网站（http://smart.emblheidelberg.de/）使用Sequence analysis工具进行结构域的预测，对预测结果分析整理删除没有NB-ARC保守结构域的基因。使用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）验证预测的结果，按其含有的TIR、CC、LRR不同结构域进行分类整理，得到党参NBS-LRR家族基因。

对党参结构较完整的CNL及TNL类基因分析其理化性质、预测其亚细胞定位结果，整理党参CNL及TNL类基因的编码蛋白序列，使用在线工具ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/），获得党参CNL及TNL类基因的氨基酸数量（Size）、等电点（pI）以及分子量（Mw）和疏水性（GRAVY）等信息，利用CELLO v2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）预测党参CNL及TNL类基因的亚细胞定位结果。

1.2 党参CNL及TNL亚家族基因motif预测

利用MEME网站（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）设置motif number为10，输入基因结构序列信息，预测党参TNL及CNL类基因的保守基序蛋白结构域。

1.3 党参NBS-LRR家族进化分析

使用TBtools在本课题组前期接菌实验得到的转录组蛋白库中检索党参NBS-LRR家族基因ID，得到党参NBS-LRR家族的蛋白序列。使用MEGA7.0.14对这些蛋白序列进行CLustalW多序列比对，选择默认参数分析，用NJ邻接法（Neighbor-joining method）进行系统发育进化树的构建，Bootstrap method（步长检验）设置为1000，选择p-distance模型，方法选择Partial deletion，程度为50%。通过在线工具EvolVIew（https://evolgenius.info//evolview-v2/）进行党参NBS-LRR系统发育进化树的分析美化。

用MEGA7.0.14对党参NBS-LRR家族与拟南芥NBS-LRR家族进行系统发育进化分析。拟南芥NBSLRR家族通过TAIR（https://www.arabidopsis.org/）网站在线获得。

1.4 在尖孢镰刀菌（F. oxysporum）胁迫下党参NBSLRR家族基因的表达差异分析

利用前期本课题组对党参进行接菌实验，并选取0、6、24、72、120 h共5个时间点的转录组数据，取FPKM的平均值，利用联川云生物平台（https://www.omicstudio.cn/index）绘制热图，分析党参NBS-LRR家族的基因表达模式。数据处理方法为Log2，数据处理按行处理。

1.5 NBS-LRR家族基因互作网络分析

提取党参NBS-LRR家族的同源拟南芥编码蛋白序列，利用STRING（https://string-db.org/），获得与党参同源拟南芥蛋白的互作蛋白，使用Cytoscape软件，进行党参与拟南芥NBS-LRR蛋白互作网络可视化分析。

2 结果与分析

2.1 党参NBS-LRR家族基因鉴定、理化性质分析和亚细胞定位预测结果

基于党参转录组数据及NBS-LRR家族不同结构域，在PF01582（TIR domain）中共检索到34个基因；在PF00931（NB-ARC domain）中检索到123个基因，在PF00560、PF12799、PF13306、PF13855和PF14580（LRR domain）中检索到85个基因；在PF05659（RPW8 domain）中检索到3个基因。对所有筛选到的245个基因通过预测基因结构，共鉴定到88个党参NBS-LRR家族基因（表1）。其中，N类基因64个（含N型50个、NL型14个），CNL类基因15个（含CN型1个、CNL型14个），TNL类基因7个（含TN型4个、TNL型3个）、PN类基因（含RPW8/NBS结构域）2个。从整体分析，党参TNL类基因7个，约占党参NBS-LRR家族数量的8%，CNL类基因数量15个，约占NBS-LRR家族的17%，而RNL类基因只有2个，约占党参NBS-LRR家族的2%。其中党参CNL类基因数目（15个）约是TNL类基因数目（7个）的2倍，这与模式作物拟南芥中的TNL亚家族成员数目约是CNL亚家族成员数目的2倍[13]差别较大。党参CNL亚家族成员数目大于TNL亚家族数目，表明在党参发育进化过程中，为适应环境增强抗病性，CNL亚家族在进化过程中发生扩增。

表1 党参NBS-LRR家族基因分类

党参CNL及TNL类基因理化性质及亚细胞定位预测结果显示（表2），前15个基因为党参CNL类型基因，后7个为党参TNL类型基因。党参NBS-LRR家族基因氨基酸长度范围是1161-4800，编码蛋白的开放阅读框（ORF）长度范围为425-4011，氨基酸数是141-1223，蛋白质分子量范围16 365.91-139 922.52 kDa，等电点是5.17-9.46，总平均疏水指数为（-0.377）-（-0.121），表明党参CNL及TNL类蛋白全是亲水性蛋白，亚细胞定位预测显示党参CNL及TNL家族蛋白全部定位在细胞质。对党参CNL及TNL类基因理化性质分析和亚细胞定位预测为其功能分析提供研究基础。

表2 党参TNL及CNL类基因信息表

2.2 党参NBS-LRR家族motif预测

研究发现在NBS-LRR家族中，NB-ARC保守域有8个常见的保守基序分别为P-loop、Kinase2、GLPL、MHDV、RNBS-A、RNBS-B、RNBS-C、RNBS-D[22]。对党参NBS-LRR家族中基因结构较完整的CNL及TNL类基因使用MEME工具分析，共预测到10个保守motif（图1）。Motif 1序列为GSKDVRVISIVGMGGJGK TTJAKKVYN，含GxxxGKT/S序列，符合P-loop的结构模型。Motif 3的氨基酸含有的序列CGGLPLAIVVJGG LL是GLPL保守序列。Motif 5的氨基酸序列为PWFDPGSKIIJTTRNEEVAK，含有的GSxxxTTR是RNBS-B的序列特征。Motif 6是典型的富亮氨酸重复序列为LRR结构特点。Motif 7含有的为KLMMHQLLR DMGREIVRQE序列是MHDV的序列特点。Motif 8的氨基酸序列为JKDALRGKRYLLVLDDVWS，含有的LVVLD序列是与ATP/GTP结合位点相关的激酶Knase 2的结构单元。Motif 9的氨基酸序列PHRLKLLSEDESWELFCKKAF为RNBS-C结构单元。Motif预测结果显示，前14个基因是党参CNL类基因，后七个基因是党参TNL类基因（图2）。在党参CNL类基因中共预测到7个保守motif（不含motif 4，motif 7，motif 10），并以motif 1（P-loop）-motif 8（Kinase2）-motif 5（RNBS-B）-motif 9（RNBS-C）-motif 3（GLPL）-motif 2-motif 6（LRR）的顺序排列。有3个基因没有预测到LRR结构单元，所有CNL亚家族基因全部含有其它6个motif。在TNL中共预测到了9个motif（不含motif 2），并以motif 4-motif 10-motif 1（P-loop）-motif 8（Kinase2）-motif 5（RNBS-B）-motif 9（RNBS-C）--motif 3（GLPL）-motif 7（MHDV）-motif 6（LRR）的顺序排列，有11个基因预测到LRR结构。motif 4、motif 10为TNL类基因特有的TIR结构，TNL类基因中有6个基因含有Motif 7（MHDV），有3个基因（TNL型）含有LRR结构，4个基因（TN型）不含LRR结构，证实了本研究的预测分类结果。研究结果表明党参NBSLRR类基因在发育进化过程中结构比较保守。

图1 党参CNL及TNL类基因10个保守基序模型

图2 党参CNL及TNL类基因的保守基序分析

2.3 党参NBS-LRR家族系统发育进化分析

利用MEGA7.0.14工具对党参NBS-LRR家族基因的编码蛋白序列建立系统发育进化分析，对88个党参NBS-LRR家族基因建立系统发育进化树（图3）。党参NBS-LRR家族系统发育进化树中15个CNL类基因聚集在灰色分枝包括：DN65402_c8_g2、DN59886_c 0_g1、DN64893_c0_g2、DN52173_c3_g4、DN51331_c0_g4、DN55845_c0_g2、DN58409_c0_g1、DN48620_c0_g 6、DN61518_c1_g3、DN53685_c0_g3、DN65190_c1_g2、DN61931_c0_g1、DN56519_c1_g1、DN57137_c1_g10和DN63147_c0_g1，7个TNL类基因聚集在粉色分枝包括：DN63121_c0_g2、DN58543_c1_g2、DN64213_c0_g 1、DN59598_c1_g2、DN58543_c1_g1、DN54844_c1_g1、DN60120_c0_g1，含特殊结构域RPW8的RN类只有2个基因分别为DN62129_c0_g1和DN51381_c1_g2。在CNL和TNL分枝还含有N和NL类基因，推测这些基因在发育进化过程中可能丢失了部分CC或TIR结构，也可能是N和NL型基因进化出了部分CC或TIR结构。党参CNL类基因与TNL类基因聚集在不同的分枝，表明在党参进化过程中，NBS-LRR家族基因中CNL亚家族和TNL亚家族可能遵循不同的进化方式和路径。

图3 党参NBS-LRR家族系统发育进化树

党参与拟南芥的NBS-LRR家族的基因系统发育分析获得系统发育进化树（图4）。共发现了5对同源基因（红色），分别是AT5G17680.1和DN54844c1g1；AT1G27180.1和DN65008c1g2；AT1G33560.1和DN5138 1c1g2；AT5G36930.2和DN54844c1g2/DN57200c0g1；DN5 8546c0g3和AT5G66910.1/AT5G66900.3/AT5G66900.2/AT5G66900.1。

图4 党参与拟南芥NBS-LRR家族系统发育进化树

2.4 在尖孢镰刀菌（F. oxysporum）胁迫下党参NBSLRR家族基因的表达差异分析

尖孢镰刀菌（F. oxysporum）侵染0、6、24、72、120 h后，党参NBS-LRR基因表达模式不同（图5）。在党参响应病原菌侵染的过程中，随着时间的增加部分基因的表达模式表现为逐渐增加然后降低，例如DN56071c1g8、DN64591c1g1和DN48464c1g1等基因在病原菌侵染后24 h达到最高，24 h后逐渐降低；而部分基因表达模式表现为先减低后增加的规律，例如DN58543c1g1、DN63324c2g1和DN64213c0g1等基因在病原菌侵染后0-24 h表达量逐渐降低，在24-120 h表达量又逐渐增加。在党参侵染尖孢镰刀菌6 h时，DN53844c0g3、DN58543c1g2、DN53844c0g1、DN64786c1g 6、DN64786c1g5、DN48234c0g2、DN54844c1g2、DN65008c1g2、DN59747c0g3与侵染前相比表达水平提高；在党参侵染尖孢镰刀菌24 h时，DN56071c1g8、DN64591c1g1、DN48464c1g1、DN59886c0g1存在高表达；病原菌侵染72 h后党参DN61931c0g1、 DN65190c1 g2、DN48620c0g6、DN65370c0g1和DN57200c0g1等基因高表达。病原菌侵染120 h后DN53844c0g4、DN53844c0 g3、DN64840c1g2、DN58543c1g1、DN64422c2g5和DN63324c2g1等基因高表达。在侵染前期（6-24 h）高表达的基因DN64786c1g6、DN64786c1g5、DN48234c0g 2、DN54844c1g2、DN59747c0g3、DN56071c1g8、DN64591c1g1、DN48464c1g1、DN59886c0g1对尖孢镰刀菌具有明显的响应，推测这些在病原菌侵染前期（6-24 h）高表达的基因在党参响应根腐病过程中发挥重要调控作用。

图5 党参NBS-LRR基因在尖孢镰刀菌（F. oxysporum）胁迫下0、6、24、72、120 h的表达模式热图

2.5 NBS-LRR基因互作网络分析

为探究党参NBS-LRR家族基因的生物学功能，基于拟南芥互作网络数据库，通过同源分析的方法，预测了蛋白之间的关系网络（图6）。共发现了12个拟南芥的同源蛋白分别是DN64893c0g2、DN64490c0g3、DN49453c0g1、DN65343c1g2、DN54844c1g2、DN64422c 2g6、DN60170c0g1、DN65402c8g2、DN49778c1g1、DN65307c2g1、DN65418c4g2和DN59747c0g3，以及42个相关的互作蛋白。互作蛋白中IKU2（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族），是编码富含亮氨酸重复序列（LRR）激酶；GLR家族作为谷氨酸门控受体可以调节钙离子流入细胞；CYTC-1和CYTC-2是线粒体电子传递链中的最终载体蛋白；MPK3参与氧化应激介导的信号级联（如臭氧），并参与细菌鞭毛蛋白受体FLS2下游的先天免疫MAP激酶信号级联（MEKK1、MKK4/MK5和MPK3/MPK6）。党参的抗病蛋白DN54844c1g2可能与GLR家族互作，进而通过调节Ca2+内流参与免疫调控；DN64786c1g5可能与CYTC-1和CYTC-2互作，进而通过参与氧化还原反应参与党参响应根腐病过程；DN59747c0g3可能与MPK3互作，进而通过参与MAP信号级联、磷酸化WRKY转录因子以及参与超敏反应（HR），在党参响应根腐病过程中发挥重要作用。表明党参NBS-LRR家族基因可能通过参与复杂的信号转导过程来调控抗病。DN54844c1g2、DN64786c1g 5、DN64786c1g5是党参响应根腐病过程中具有重要作用的抗病基因。表明党参NBS-LRR家族基因可能通过参与复杂的信号转导过程来调控抗病。DN54844c1 g2、DN64786c1g5、DN64786c1g5是党参响应根腐病过程中具有重要作用的抗病基因。

图6 NBS-LRR基因互作网络

3 讨论

基于党参转录组数据分析，共鉴定到88个党参NBS-LRR家族基因，CNL类基因数量（15个）约为TNL类基因数量（7个）的2倍，与拟南芥中TNL亚家族基因数量约是CNL亚家族基因数量的2倍[13]相差较大，与人参中CNL亚家族基因数量（50个）是TNL亚家族基因数量（21个）[21]的2.4倍相差不大。植物NBS-LRR家族基因的数量多少在一定程度上表现出植物的抗病能力大小[22]。与模式物种相比较，党参CNL类基因较TNL类基因发生明显扩增，与人参中TNL和CNL亚家族基因的发育进化路径比较一致。

Motif预测得到10个保守的motif序列，包括Ploop、GLPL、Kinase2、RNBS-B、RNBS-C、MHDV以及LRR和TIR典型的结构单元，符合植物NBS-LRR家族基因典型的结构特征，如谷子[23]，甘薯[8]等，这种结果意味着党参的NBS-LRR家族基因在发育进化过程中保持较高的保守性。同一亚家族NBS-LRR基因motif排列具有一定的顺序性，并且亲缘关系越近序列越相似，序列上的相似性意味着功能上的相似性[24]。研究表明LRR结构域具有特异识别病原微生物的作用[17]，本研究中共有14个基因含有LRR结构域，占总数的67%，含LRR结构域的基因数量越多推测其识别病原菌发挥抗病能力越强。

系统发育分析结果发现，党参CNL和TNL类基因聚集分布于不同的进化分枝，TNL和CNL亚家族基因发育进化路径可能不同，这与醋栗番茄的研究结果相似[25]，党参与拟南芥NBS-LRR家族系统发育分析结果共发现了5个同源基因对，在醋栗番茄与拟南芥的系统进化分析中也发现了5个同源基因对。

目前研究发现，NBS-LRR家族基因在野生二粒小麦[26]、人参[21]等植物中存在时空表达差异。本研究结果表明党参NBS-LRR家族基因在尖孢镰刀菌（F.oxysporum）胁迫下具有时间表达模式差异，NBS-LRR基因参与调控党参响应根腐病的过程，其中DN64786c1g6、DN64786c1g5、DN48234c0g2、DN54844 c1g2、DN59747c0g3、DN56071c1g8、DN64591c1g1、DN48464c1g1、DN59886c0g1等基因在尖孢镰刀菌（F. oxysporum）侵染的前期（6-24 h）高表达，表明这些基因在党参抗病响应过程中存在重要的表达调控作用。

NBS-LRR家族基因可与多种抗病相关蛋白互作，构建植物复杂的抗病关系网络[27]。本研究预测NBS-LRR互作网络发现12个党参抗病蛋白可能与42个互作蛋白具有相互作用，党参与拟南芥同源的基因之间可能存在相似的结构和作用模式并具备相同的功能。DN54844c1g2可能与GLR家族互作，进而通过调节Ca2+内流参与免疫调控；DN64786c1g5可能与CYTC-1和CYTC-2互作，进而通过参与氧化还原反应参与党参响应根腐病过程；DN59747c0g3可能与MPK3互作，进而通过参与MAP信号级联、磷酸化WRKY转录因子以及参与超敏反应（HR），在党参响应根腐病过程中发挥重要作用。目前在桃[28]、拟南芥[29]等植物响应胁迫过程中发挥重要作用，进一步探究其在党参响应根腐病过程中的作用机制具有深远意义。

本研究基于转录组数据，鉴定党参NBS-LRR基因家族、分析其理化性质、基因结构、系统发育、表达模式及互作网络，确定党参NBS-LRR家族包含88个基因，党参CNL及TNL类基因结构比较保守；党参CNL亚家族基因在进化过程中发生扩增；在尖孢镰刀菌（F. oxysporum）胁迫下党参NBS-LRR家族基因表达模式具有时间差异，并确定了响应病原菌的高表达基因，通过互作网络预测了DN54844c1g2、DN64786c1g 5、DN59747c0g3的重要作用。本研究为揭示党参抗病机制、党参遗传育种及改良提供基础。