再生性牙髓治疗在成人根尖发育不全恒牙应用的研究进展

胡佳 王秀清 卢国英 黄晓晶

福建医科大学口腔医学院/附属口腔医院牙体牙髓科 福建省口腔疾病研究重点实验室福建省口腔生物材料工程技术研究中心 福建省高校口腔医学重点实验室福建医科大学口腔医学研究院 福州 350002

成人根尖发育不全感染恒牙的治疗难点在于形成根尖三维封闭，防止再感染。目前有效的治疗方法是通过根尖诱导成形术或者根尖屏障术形成根尖封闭。然而根尖诱导成形术就诊次数多，长期封药增加牙折风险[1]；根尖屏障术工作长度不易确定，根尖屏障物止点的位置难以控制。两种治疗方法均不能使牙根继续发育，患牙无法感受外界刺激和自我修复。

再生性牙髓治疗（regenerative endodontic procedures，REPs）是基于组织工程学原理的治疗方法，目标是消除临床症状和体征，促进牙根继续发育，最终实现牙髓牙本质复合体的功能性再生。2013年美国牙髓病学会（American Association of Endodontics，AAE）发布了牙髓再生操作指南，并分别于2016、2018和2021年予以更新，推动儿童和青少年年轻恒牙感染根管的牙髓再生治疗。牙髓再生能力与年龄相关，对于根尖孔粗大甚至敞开的成人感染性恒牙（≥18岁），REPs是否同样适用？本文对REPs在成人根尖发育不全感染恒牙中的应用现状进行综述，并对其临床应用前景进行讨论。

1 REPs 治疗成人根尖发育不全感染恒牙的应用基础

成人恒牙包括成人根尖发育不全的恒牙和成人根尖发育完成的恒牙，其中根尖发育完成的恒牙又称成熟恒牙。已有临床病例报道和实验研究证实REPs可以用于成人感染根管的治疗，能促进根尖周病变愈合，并通过体内外实验初步揭示其作用机制。

1.1 生物学基础研究

REPs利用组织工程学原理，旨在实现牙根继续发育和牙髓牙本质复合体的功能性再生，其方法主要分为两类：外源性干细胞移植和内源性干细胞归巢。

外源性干细胞移植是将干细胞、支架材料和生长因子放入消毒后的根管内，以获得组织的再生。其中，外源性干细胞包括牙源性干细胞（如牙髓干细胞、人脱落乳牙干细胞、牙周膜干细胞和根尖牙乳头干细胞等）和非牙源性干细胞（如骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞等）[2]。

内源性干细胞归巢技术则包括牙髓血运重建术和细胞归巢技术。前者通过根尖引血带来种子细胞、生长因子和支架，以获得牙髓组织再生；后者将复合有生长因子的生物支架材料注入无髓根管，靶向调控自体干细胞定向迁移至根管内并增殖分化。

REPs能否应用于成人恒牙的治疗，取决于根管系统中能否获得干细胞。Chrepa等[3]采集了20例成年患者根管内血液，检测间充质干细胞标记物的表达，结果表明刺激根尖出血可将未分化的间充质干细胞引入成人恒牙的根管系统中，且干细胞具有成骨的特性。这些标记物的浓度具有很高的变异性，表明除年龄、性别和牙齿类型以外，其他因素也调节了干细胞的相对数量，可能包括病因的性质和持续时间（如根管感染的毒性和持续时间）。He等[4]分析了成人恒牙REPs治疗的潜在生物学基础，认为成人恒牙新生组织的细胞来源可能包括骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞。Arslan等[5]的组织学研究发现，根尖发育完成的成熟恒牙REPs治疗后，根管内新生组织的成分为纤维结缔组织、骨样组织和血管样结构等，揭示了成熟恒牙可产生类似于年轻恒牙的新生组织和结构。虽然这不是牙髓组织，但仍是活组织，可能有助于先天免疫系统的重建，从而控制根管系统的再感染。

牙槽骨干/祖细胞和牙周膜干/祖细胞还可能通过细胞归巢的方式被募集到根管内。在组织再生过程中，细胞归巢包括细胞的募集和分化，并受外源性和/或内源性生长因子的调控。与REPs相关的生长因子包括粒细胞集落刺激因子、血小板衍生因子、转化生长因子-β、骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子等，存在于血凝块、血小板浓缩物和天然牙本质的基质中。Ⅰvica等[6]研究发现：存在于管周牙本质的转化生长因子-β1和血管内皮生长因子的分布不受年龄和牙根发育程度的影响，这提示无论是年轻恒牙还是成人恒牙，天然牙本质基质中均含有丰富的生长因子参与协调再生过程。He等[7]研究认为：调控干细胞归巢及血管再生的关键分子可能包括Wnt/β-catenin信号通路，该研究利用配体 Wnt3a靶向诱导内源性干细胞归巢，并对小型猪下颌切牙根管内新生物进行组织学研究，观察到牙本质、血管及神经纤维等形成。Kim等[8]将含有生长因子的胶原支架放入消毒后的人类成熟恒牙根管内并植入大鼠背部3~6周，结果显示根管内有血管、牙本质样组织和神经样组织形成。对细胞归巢的特异性调控机制的探索有助于未来实现成人恒牙的功能性再生。

虽然自体间充质干细胞是患者自身组织的可靠来源[9-10]，但在自体干细胞数量或活性不足的情况下，同种异体干细胞的移植也是一种可使用的补充和/或替代方法。人脐带间充质干细胞已被证实具有牙源性分化潜能，以及更强的免疫抑制和新生血管的潜能[11]。优化的细胞传递系统是成功治疗的关键因素，Brizuela等[12]将其包裹于血浆来源的生物材料中，含有生长因子的支架可以为干细胞提供特定的细胞信号，可以维持治疗细胞的长期稳定。

1.2 临床研究

20世纪60年代就有报道，将根尖区血液引入消毒后的成熟恒牙根管内，可以促进根尖病变的愈合；后来的研究证实了通过刺激根尖区出血，可以促进年轻恒牙牙根继续发育[13]。2017年一项Meta分析[14]比较了REPs与根尖屏障的疗效，结果发现：二者在临床成功率方面的差异没有统计学意义，且REPs组有79%的患牙牙根继续发育。REPs在年轻恒牙中的广泛应用给成人恒牙的治疗带来新的思路（表1和表2）。2012年，Shah等[15]对成熟恒牙的再生治疗进行临床研究并取得成功。随后的病例报告和临床研究[16-18]也表明：将REPs运用于成熟恒牙的治疗能消除临床症状和促进根尖病变愈合。Arslan等[19]采用随机对照研究进一步发现：REPs与传统根管治疗有相似的临床成功率，且REPs组有50%的患牙牙髓活力测试阳性，该结果与既往有关年轻恒牙的报道[20]一致。Brizuela等[12]使用包裹人脐带间充质干细胞的血浆来源生物材料作为REPs的支架，并在传统牙髓活力测试的基础上增加激光多普勒血流测量，结果同样表明：REPs 治疗成熟恒牙的临床成功率为100%，且50%的患牙电活力测试阳性。El-Kateb等[21]运用磁共振成像技术定量评估了成熟恒牙中两种根尖预备尺寸（0.3 mm/0.5 mm）对REPs疗效的影响，结果表明根尖孔直径的大小对预后没有显著影响。综合既往的相关研究，Glynis等[22]的系统综述全面评估了REPs运用于成熟恒牙的治疗依据，提出REPs可能是治疗成熟恒牙牙髓坏死和根尖牙周炎的一种潜在的选择。

表1 成熟恒牙REPs治疗的研究汇总Tab 1 Summary of studies on REPs in mature permanent teeth

成人恒牙在牙根发育完成之前因龋病、创伤或畸形中央尖折断等因素引起牙髓坏死，可导致根尖发育不全或根尖孔敞开。Zhujiang等[28]使用重组人血小板源性生长因子治疗成人根尖发育不全的下颌磨牙，结果显示牙根继续发育，牙髓活力测试阳性。Gaviño Orduña等[27]使用血凝块+富血小板血浆治疗3例成人根尖发育不全的感染恒牙，5年随访结果显示：根尖病变完全愈合，根尖周可见骨质新生，1例（Nolla 8期）牙根长度少量增加；1例（Nolla 9期）根尖孔闭合，但管壁厚度均无明显变化。Neelamurthy等[26]将REPs运用于年轻恒牙（4例）和根尖孔敞开的成人恒牙（9例）并取得临床成功，其中66.7%的成人恒牙根尖闭合或牙根发育，1例牙髓活力测试阳性。此外，一些病例报告[25,27,29,31]描述了REPs在成人根尖敞开的恒牙再治疗中的应用，结果发现“根尖闭合”是牙根结构最常见的变化。Nosrat等[25]的文献回顾也表明：REPs是成人根尖发育不全恒牙再治疗病例的一种有效的治疗选择。目前，有关REPs在成人根尖发育不全感染恒牙中的运用多为病例系列研究和病例报告，还没有关于该主题的分析性和实验性研究。由于成人根尖发育不全的恒牙在再生潜能和感染程度方面与成熟恒牙更为接近，但根尖孔更为宽大，因此已有的REPs运用于年轻恒牙和成熟恒牙的证据可以为其临床应用提供一定的依据。

2 REPs治疗成人根尖发育不全感染恒牙的挑战

成人根尖发育不全感染恒牙在再生潜能、感染程度、牙根发育程度上均与年轻恒牙不同，故治疗面临更大挑战。

2.1 成人恒牙与年轻恒牙的异同

恒牙萌出后一般需要经历3年或更长时间才能使牙根发育完全，患者年龄越大，意味着治疗时间远超过牙萌出后的牙根形成关键时期。干细胞的数量、功能状态以及局部微环境等也随之改变。与REPs相关的内源性干细胞主要包括根尖牙乳头干细胞、牙髓干细胞、炎症根尖周前体细胞、骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞[13]。根尖牙乳头干细胞虽只存在于牙齿发育的特定阶段，但由于其在根尖炎症等不利条件下仍可能存活并维持分化潜力，故在年轻恒牙REPs中起重要作用。而成人根尖未发育完全的恒牙已过了牙根形成的关键时期，长时间的持续感染状态下根尖牙乳头干细胞是否仍能存活有待探究。此外，年龄相关的衰老因素影响牙髓干细胞的增殖和分化能力，因此成人恒牙在长期炎症状态下，根尖存在活髓的概率小于年轻恒牙[32]。由于成人根尖发育不全的恒牙在细胞状态和感染程度方面与成熟恒牙更为接近，由此可以推测，在REPs中二者的干细胞来源可能类似，即来自根尖炎症组织、骨髓或牙周膜组织[4]。这些细胞生成血管化和神经化牙髓组织的能力较低，并且随着年龄的增长，分化能力下降[33]。一项有关年龄对REPs疗效影响的研究[34]表明：年轻组患者在牙根继续发育和根尖孔缩小方面更有优势。

基于年轻恒牙REPs的综述表明，牙髓坏死后感染的持续时间与REPs的预后之间存在联系[35]。与年轻恒牙相比，成人恒牙的根管感染时间更长，治疗史更为复杂。成人恒牙在长期慢性感染过程中，由于炎症破坏和防御修复交互作用，可能存在牙根局部发育停止和局部继续生长的特殊表现[36]，导致根尖段形态不规则，根管消毒更为困难。Lin等[37]对1颗REPs失败的年轻恒牙进行组织学分析，可见牙根外吸收，部分吸收区见骨样或牙骨质样组织沉积，根管内可见炎症细胞、坏死碎片和细菌生物膜，这一结果提示RFPs失败的原因与未控制的感染有关。如何成功控制根管系统内的感染是成人恒牙和年轻恒牙需要共同面对的难题。

与年轻恒牙相比，成人恒牙根尖孔相对较小，血液及干细胞迁移的路径狭窄。Abada等[38]的研究发现：根尖孔直径越大，根尖干细胞数量越多，新生血管的可能性就越大。而动物实验[39]则观察到根尖孔直径为0.32 mm的根管内有新组织长入，且根尖孔的大小不是自体移植后血运重建和新组织生长的决定性因素。Fang等[40]的综述分析也表明：不同根尖孔直径（<0.5 mm， 0.5~1 mm，>1 mm）的REPs成功率都高达90%。在本文引用的成人恒牙的REPs相关研究中（表1和表2），根尖孔直径范围为0.25~1.0 mm（成人根尖发育不全恒牙的根尖孔直径≥1 mm），临床成功率为92.3%~100%。目前，对于年轻恒牙或成人恒牙再生的最佳根尖孔直径还没有达成共识。

2.2 成人恒牙REPs治疗的特殊考量

成功的根管系统消毒是REPs中最关键和最具挑战性的步骤[41]。在年轻恒牙的REPs治疗中，主要通过化学冲洗和根管封药等方式来消毒根管以保护根尖乳头干细胞。成人恒牙的根尖孔相对较小，尤其是成熟恒牙，根尖已发育完成，单纯化学冲洗能否彻底消毒未预备根管的根尖三分之一区域存在疑问。Verma等[42]认为缺乏机械清创可能导致根管感染清除不佳，并通过研究证明了残留的细菌生物膜会影响牙本质释放转化生长因子-β1，因而可能对REPs的结果产生负面影响。为获得最佳的组织再生结果，更好的消毒程序是必要的。在有关成人根尖发育不全恒牙的病例报告中均提及少量预备根管；在成熟恒牙的相关研究中，均使用机械预备，部分病例对根尖孔进行扩大[19]。Borlina等[43]的动物实验表明，扩大根尖孔更有利于清除感染，促进根尖病变的愈合。而Arslan等[19]将成熟恒牙的根尖孔扩大5或6个号，但结果发现REPs的疗效无明显差异。该结果与El-Kateb等[21]的随机对照研究结果一致，即成熟恒牙中两种根尖预备尺寸（0.3 mm/0.5 mm）对REPs疗效没有显著影响。

刺激根尖周组织出血形成血凝块是REPs治疗中获取生长因子和支架的主要方法。成人恒牙由于感染时间长，根尖孔狭小等因素可能导致刺破根尖后出血量不足，往往需要其他支架或生长因子作为补充，如血小板浓缩物和其他生物材料支架[13]。多个病例和试验[25,27,31]报告了血小板浓缩物支架用于成人恒牙REPs治疗的成功结果。也有研究[12]将血浆源性生物材料与外源性干细胞结合并移植到根管内进行REPs治疗。无论在何种情况下，刺激根尖出血都具有重要作用，一方面带来丰富的生长因子，如促进血管新生的血管内皮生长因子，促进神经纤维延伸的胰岛素生长因子等[44]，另一方面也可能将先天和适应性免疫防御系统的体液（补体成分、免疫球蛋白、抗菌肽）和细胞（多形核白细胞、巨噬细胞）成分带入根管内[45]。

2.3 成人恒牙REPs治疗的效果

REPs治疗的效果主要通过3个目标来衡量。首要目标是症状消失和存在根尖周骨质愈合的证据。在本文所涉及的关于成人恒牙REPs治疗的相关研究中（成人根尖发育不全的恒牙20颗和成熟恒牙89颗），临床症状都得到了明显改善，检查结果为阴性。在Arslan等[19]的随机对照研究中，2颗成熟恒牙（7.7%）由于根尖病变没有缩小而被归为失败病例，原因可能为残余的细菌微生物感染。除上述2例外，其余所有成人恒牙在影像学上均显示出骨愈合迹象。

REPs治疗的二级目标是根管壁增厚和/或牙根的长度增加。由于成熟恒牙的牙根已经发育完成，所以无须衡量这一目标。而对于成人根尖发育不全的恒牙，二级目标是期望达到的目标，但并非是必须目标。在Neelamurthy等[26]的临床研究中，6例（66.7%）根尖发育不全的成人恒牙观察到根尖闭合或牙根发育现象。在其他病例报告或病例系列研究[18,25,27,29-30]中也普遍观察到牙根发育处于Nolla 9期的成人恒牙的根尖闭合。组织学研究[46]推测根尖孔的闭合可能是由类牙骨质样组织矿化而成。虽然刺激成人恒牙根尖区出血有干细胞进入根管内，但分化的成分为骨样组织、类骨质样和成纤维等组织，而未观察到成牙本质层和牙本质样组织形成[5,46]，这可能是管壁和根长未继续发育的原因，也提示成人经REPs后较难实现牙髓—牙本质复合体的再生。

REPs治疗的三级目标是牙髓活力测试阳性，该结果通常被认为是有新的活组织形成。在本文所涉及的成人恒牙的相关报道中，牙齿恢复活力的患者数量差异很大（0%~100%）。不同的测量技术和仪器可能会影响测量结果。例如在Nageh等[23]的临床试验中，15颗牙齿中有6颗的牙髓电测试强度超过40（最大值为80）。强度越高，受邻近组织如牙周膜组织影响的概率就越大。此外，该测试依赖于患者的反馈，可能会对结果产生误导[47]。目前，仅一项有关成人恒牙的随机对照研究[12]使用其他牙齿活力测试方法（激光多普勒血流测量仪）作为辅助检测手段。

目前，对再生性牙髓治疗的效果评价主要参照临床治疗成功标准。由于严格的伦理限制和多重考虑，REPs的治愈效果还欠缺组织学层面的评价。通过免疫组织化学方法可以检测新生物的神经元标志物、施旺细胞标志物，新形成硬组织的骨涎蛋白、牙本质涎蛋白、骨钙蛋白，以及观察有无成牙本质细胞形成。陈霞等[46]分析了牙髓电活力测试阳性牙齿的组织学特征，结果发现：达到AAE评价三级目标的患牙，其组织学检查往往能发现神经再生，而达到二级目标的部分患牙，组织学检查仍可发现神经再生，因此牙髓活力的检测方式仍有待改善。激光多普勒血流仪可提示血流量的变化，检测结果可以辅助判断牙髓活力状态，但同样存在假阴性结果的可能[12]。磁共振成像是无创诊断和监测软组织疾病的重要工具，已被用于评估实验动物模型和患者中牙髓干细胞移植后的牙髓组织的再生，有希望成为牙髓再生的评估工具[21]。

3 REPs 治疗成人根尖发育不全感染性恒牙的策略和研究方向

3.1 基于控制感染的方法

REPs成功的前提是控制感染。机械预备可以去除根管壁内已被细菌和毒素侵入的牙本质，达到生物学清理的目标，但同时要避免刺激和损伤根尖周组织。虽然AAE并没有提出对年轻恒牙使用机械预备，但随机对照研究[19,21]表明：根尖预备尺寸对成人恒牙REPs的疗效没有显著影响，这为成人恒牙运用机械轻度预备来清除感染提供了证据支持。在化学预备方面，Fouad等[48]用不同消毒方法处理根尖孔粗大的感染根管，结果显示：5.25%~6% NaClO 组的根管菌群数量显著低于1.25% NaOCl组，但是1.5% NaClO被认为对根尖周干细胞的毒性最小。以低浓度药液进行根管冲洗的有限抑菌效果使人们聚焦于根管内封药这一消毒手段。Ruiz-Linares等[49]通过体内外研究发现，双氯芬酸钠水凝胶与传统根管消毒方式相比，表现出更强的抵抗细菌生物膜的作用。

未来的研究方向在于开发新的消毒药物或药物组合、研发具有消毒和抗菌功能的支架材料以及使用负压灌溉、光动力消毒[50]、低能量激光[51]等新技术，而且在加强消毒效果的同时需要尽量保护根尖周组织。

3.2 基于细胞归巢的方法

细胞归巢技术是将含有生长因子的生物支架材料注入无髓根管内，使自体干细胞迁移至根管内并增殖分化，最终形成再生的牙髓组织。一项针对成熟恒牙的临床随机对照研究[19]显示：使用血凝块支架的细胞归巢技术治疗后92.4%的患牙根尖病变愈合。然而成人患者的干细胞数量和活性较年轻患者低，牙根发育程度的不同可能带来根尖引血不足等问题，促使研究者不断寻找和优化生物活性支架材料和生长因子的组合与投递方式，探索干细胞归巢的特异性调控机制，以增强成人恒牙根尖周组织中干细胞的归巢、增殖和定向分化能力。

1）浓缩生长因子、富血小板血浆、富血小板纤维蛋白等天然/合成支架。研究者[52]将制备的浓缩生长因子用组织学染色和扫描电子显微镜观察，并提取生长因子进行免疫组织化学实验，发现浓缩生长因子能有效促进干细胞增殖、迁移和分化。在治疗年轻恒牙囊性根尖周病变中运用浓缩生长因子可观察到根尖病变愈合及牙根继续发育[53]。在一项回顾性研究[23]中，患者平均年龄25岁，根管经少量预备和消毒后，采用血凝块和富血小板纤维蛋白支架，1年后复查所有患牙根尖病变愈合，50%患牙恢复牙髓活力。

2）3D打印“牙髓复合体”，又称生物打印。Yu等[54]通过 3D打印技术制备凝胶支架，验证了该支架可为人牙髓细胞的生长提供适宜的微环境，促进细胞的生长与增殖，可作为组织工程牙髓再生的候选材料。

3）水凝胶支架。水凝胶是在水中可以溶胀的高分子网络体系，包括天然高分子水凝胶、合成高分子水凝胶和复合水凝胶。其三维网络结构和黏弹性与细胞外基质极为类似，可以模拟细胞生活的三维微环境，有利于细胞增殖和分化[55]。颜燕宏等[56]合成纳米介孔二氧化硅负载甲硝唑复合水凝胶，经体外研究证实其对粪肠球菌和变异链球菌的浮游细菌和细菌生物膜具有显著的抗菌性能，同时能促进牙髓细胞的黏附。水凝胶还可以制备成可注射剂型，在凝胶化前可通过注射的方式使液体充分填充髓腔和根管，使得水凝胶与周围组织密切贴合，目前是REPs支架材料的研究热点之一。

4）外泌体。随着对REPs机制的深入研究，发现干细胞分泌的外泌体在其中扮演着重要角色。外泌体具有来源广泛、效果直接、免疫排斥反应小等优势，有望通过募集宿主细胞的方式再生牙髓组织。Huang等[57]将成骨诱导后的牙髓干细胞分泌的外泌体与干细胞通过凝胶包封后充填入牙本质套管并植入裸鼠皮下，2周后可观察到高表达成牙相关蛋白的新生组织，证实了外泌体用于REPs的可行性。随后的相关研究[58]也显示外泌体表现出不同程度的促进迁移、增殖和成牙分化能力，且能在体内再生出牙髓样组织。

后续研究须探明高效的外泌体提取方法，明确外泌体在体内的输送路径、剂量、生物学分布及代谢动力学特点，方能实现引导外泌体抵达组织缺损区发挥功能，保证其临床应用的安全性[59]。

综上所述，REPs治疗成人根尖发育不全的感染恒牙虽然取得了一定的进展，但目前仍处于临床试验的早期阶段，需要进行大量设计良好、前瞻性、长期随访的临床试验，以获得可靠的疗效评价。随着对REPs机制研究的深入，如何借助组织工程和生物材料的发展，完成从实验研究到临床应用的转化，实现真正的牙髓—牙本质复合体再生，仍需要进一步探索。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。