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苹果内生菌Torulaspora delbrueckii强化对苹果醋风味物质合成的影响

2023-11-07宋雪苗马世源李子健罗惠波

食品科学 2023年20期
关键词:苹果醋乙酯醋酸

宋雪苗,马世源,李子健,罗惠波,黄 丹,2,*

(1.四川轻化工大学生物工程学院,四川 自贡 643000;2.四川省川南晒制麸醋生物酿造技术工程实验室,四川 宜宾 644000)

苹果醋作为一种健康风味饮品,具有较为广泛的市场认可度。2021年我国苹果醋饮料的市场规模已超50亿 元且将持续增长。苹果醋挥发性香气成分丰富,对4 个品牌市售苹果醋的挥发性风味物质进行分析,共鉴定到111 种化合物,其中相对含量较高的是醇类、醛类、酯类和其他杂环类化合物;而乙酸乙酯、乙酸丙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、2-甲基丁基乙酸酯、3-甲基丁酸戊酯、己醛、苯甲醛和2,3-二氢呋喃9 种化合物则是4 种苹果醋饮料中的共有化合物[1]。苹果醋的营养风味物质主要来源于发酵过程中微生物对糖类等成分的转化和微生物代谢,以及水果天然的香气等。传统上,仅使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)参与苹果醋酒精发酵。使用单一菌种发酵易于获得一致、稳定的味道和香气,但会导致产品的香气复杂性和典型性较少。与S.cerevisiae相比,非酿酒酵母具有改善发酵制品风味的潜力[2-4]。非酿酒酵母种类繁多,包括葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、毕赤酵母(Pichiaspp.)等。Liu Qing等[5]采用热带假丝酵母(Candida tropicalis)和芳香酵母进行酒精发酵,发现混合培养的苹果醋中水果风味和花香味均高于单一培养。另外,Ni Zhenghang等[6]通过T.delbrueckii与S.cerevisiae共培养发现,醇类、乙酯类和萜烯的含量增加,并使苹果酒具有浓郁的水果和花香味。然而,关于T.delbrueckii对果醋风味的影响却鲜有报道。

内生菌是栖息在植物组织内部而不对植物造成明显伤害的微生物[7],一般具有调节植物生长、抵御环境损伤和提高植物抗病性等功能[2,8-9]。通过与宿主的长期共存,这类微生物已经发展出强大的代谢途径。据报道,一些内生菌合成的次级代谢产物与其宿主产生的生物活性物质类似[10];Liu Feng等[11]发现咖啡豆表面的天然内生菌在改善咖啡风味特征方面具有重要贡献。然而,在以往研究中,苹果内生菌对苹果醋风味的影响鲜有报道。

因此,为更全面地了解苹果内生菌T.delbrueckiiS1对苹果醋风味品质的影响,本研究将实验室分离自苹果的内生菌T.delbrueckiiS1用于苹果醋发酵实验,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)和高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定其风味成分,并探明T.delbrueckiiS1菌株对苹果醋发酵过程挥发性风味物质间相互作用的影响。目前,涉及苹果醋特征风味的研究很少,本研究就提高苹果醋典型性苹果香、花香和醋香以改善其风味品质提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红富士苹果(Malus pumilaMill.);T.delbrueckiiNJSYGA 2021(T.delbrueckiiS1)从苹果中分离获得,现保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2022046,T.delbrueckiiS1的最适发酵温度25 ℃,最适pH 3.5;葡萄酒活性干酵母BV818(S.cerevisiae)(活菌数1.5×1011CFU/g)湖北安琪酵母股份有限公司;醋酸菌(活菌数2×1010CFU/g)成都曲赋生物科技有限公司。

果胶酶(酶活力≥1000 U/g)山东科隆特酶制剂有限公司;蔗糖、柠檬酸(均为食品级)广西珍露食品有限公司;乙酸戊酯 Adamas试剂有限公司;甲醇(色谱级)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;草酸、酒石酸、L-苹果酸、L-乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸(均为色谱级)成都德思特生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯 成都市科隆化学有限公司。

1.2 仪器与设备

ZHJH-C118C超净工作台、ZWYR-D2403恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司;ME20E/02电子天平、FE20K pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;WZS80持式糖量计 上海物光仪器有限公司;离心机 德国Eppendorf股份公司;BXM-75VD立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;LC-2030C 3D Plus HPLC仪 岛津企业管理(中国)有限公司;7890A/5975B GC-MS仪 美国Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头 美国Supelco公司;SPME装置 苏州安益谱精密仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苹果醋发酵实验

参考已有报道[12-13]并进行适当修改。将成熟的苹果去皮、去核,果肉与去离子水按质量比1∶1榨汁,加入20 mg/L果胶酶((37±2)℃,60 min)和56 mg/L K2S2O5,添加蔗糖调节果浆的总可溶性固形物含量为15 °Brix,再用柠檬酸调节pH 3.5,以70 ℃巴氏杀菌15 min对果浆进行杀菌。

实验组以各体积分数6%(106CFU/mL)的接种量同时接种S.cerevisiae和T.delbrueckiiS1于果浆中,在25 ℃条件下发酵至乙醇体积分数约6%,再以0.4 g/100 mL接种量接种醋酸菌,醋酸发酵阶段采用8 层纱布密封发酵瓶,发酵温度为31 ℃,摇床转速为180 r/min,发酵时间为24 d。对照组在酒精发酵阶段仅接种体积分数6%S.cerevisiae(106CFU/mL),醋酸发酵条件与实验组一致。所有样品均做3 份生物学重复。取样时间为酒精发酵结束以及醋酸发酵的3、6、8、10、12、14、16、18、20、22 d和24 d(对照组A和实验组H的1~11分别对应3~24 d)。

1.3.2 理化指标测定

总酸含量的测定:酸碱滴定法(以酒石酸计)[14];乙醇体积分数的测定:酒精计法[15]。每份生物学重复测定3 次。

1.3.3 苹果醋挥发性风味物质测定

采用HS-SPME-GC-MS法测定挥发性物质。将5.0 mL苹果醋加入15 mL顶空瓶中,添加2.0 g氯化钠,再添加6 μL乙酸戊酯作为内标。样品在50 ℃条件下密封平衡15 min,再采用DVB/CAR/PDMS萃取头于50 ℃条件下顶空吸附40 min,将萃取头插入GC进样口解吸2 min进行分析。每份生物学重复分析2 次。

色谱条件:色谱柱:DB-1MS熔断石英毛细管(60 m×0.25 mm,0.25 μm)分离;升温程序:45 ℃保持1 min,再以5 ℃/min升温至190 ℃,保持25 min,总运行时间为55 min;不分流;载气(He)流速为1.0 mL/min。质谱条件:离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,离子化方式为电子电离源,电子能量70 eV,质量扫描范围45~500 u。

定性:通过检测得到香气成分的保留时间和质谱数据,将这些数据与相关文献以及NIST 05质谱库进行匹配定性,仅报道Qual≥70的鉴定结果。定量:采用内标法进行定量,内标为乙酸戊酯。各挥发性成分含量计算公式如下:

1.3.4 苹果醋主要有机酸测定

采用HPLC法测定有机酸。配制质量浓度为300、200、100、50、25 m g/L 的琥珀酸标准品溶液;配制质量浓度为200、100、50、20、10、5 mg/L的L-苹果酸、L-乳酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、草酸标准品溶液。

取5 mL样品6000 r/min离心2 min,上清液稀释10 倍并用0.22 μm水相滤头过滤,样品通过ZORBAX SB-C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)进行分析,进样量为15 μL。流动相为甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾(pH 2.5)(5∶95,V/V),流速为0.4 mL/min。柱温为25 ℃,检测波长为210 nm。

1.4 统计分析

通过计算代谢物的倍数变化和P值进行两组之间的统计分析,如果相关的P<0.05,则认为结果的差异显著。使用Origin(2020版)绘制折线图,使用R软件(4.1.3版本)绘制热图和箱线图。由SIMCA 14.1建立正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)模型并计算投影变量重要性值(variable importance projection,VIP)。共现性网络的构建使用Gephi(0.9.2版本)。

2 结果与分析

2.1 苹果醋理化指标

如图1所示,随着发酵的进行,两组苹果醋的乙醇体积分数均呈不断下降的趋势,相反地,总酸含量则先迅速增加而后小辐波动,总酸含量趋于稳定标志着醋酸发酵结束。酒精发酵结束至醋酸发酵的第10天,两组苹果醋中乙醇体积分数的波动明显,这可能是酒精发酵和醋酸发酵同时进行导致;酒精发酵结束至醋酸发酵的第6天,两组苹果醋的总酸含量均大幅增加,这可能是因为醋酸菌促进了醇类物质转化为酸类。醋酸发酵结束时,实验组和对照组苹果醋的乙醇体积分数十分接近,实验组的总酸含量比对照组高。

图1 乙醇体积分数和总酸含量随发酵时间变化情况Fig.1 Changes in ethanol and total acid contents during apple vinegar fermentation

2.2 T. delbrueckii S1菌株对苹果醋挥发性风味物质合成的影响

以S.cerevisiae参与酒精发酵为对照组,T.delbrueckiiS1与S.cerevisiae混合发酵为实验组,再分别接种醋酸菌进行苹果醋醋酸发酵。通过HS-SPME-GC-MS法检测实验组和对照组苹果醋发酵过程中的挥发性风味物质,分别鉴定出46 种和50 种主要挥发性物质,包括17 种醇、17 种酯、5 种醛、1 种酮、5 种酸、4 种酚和6 种其他物质。风味Heatmap图可以直观反映苹果醋发酵过程中挥发性风味物质的变化和差异。如图2所示,苹果醋酒精发酵结束时,对照组中挥发性风味物质总量多于实验组。2,3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、乙酸、癸酸和月桂酸乙酯为对照组的独有物质;乙酸苯乙酯、正己醇、3-乙氧基丙醇、己酸和异丁酸乙酯则仅在实验组中检出。

图2 苹果醋酒精发酵结束挥发性风味物质聚类热图Fig.2 Clustering heatmap of volatile aroma components in apple vinegar at the end of alcoholic fermentation

分别对两组苹果醋醋酸发酵过程挥发性代谢物进行聚类,如图3所示,对照组和实验组均可分为两个阶段,但两者的阶段性差异不大。说明T.delbrueckiiS1对苹果醋挥发性风味物质合成的阶段性无明显影响。

随着苹果醋醋酸发酵的进行,两组苹果醋中挥发性风味物质的种类和含量总体上均逐渐增加。其中,2,3-丁二醇、乙醛、苯乙醇、异丁醇、3-羟基-2-丁酮等物质在醋酸发酵初期的含量较高,随着发酵的进行迅速减少再缓慢增加至发酵结束。这是由于醇类、醛类和酮类等物质常作为合成酸类、酯类和其他化合物的前体物质,例如苯乙醇含量的减少可能是在乙酸存在的条件下,苯乙醇与乙酸合成了乙酸苯乙酯[16]。醋酸发酵结束时,丙酸苯乙酯和N,N-二甲基丙酰胺仅在实验组中检出,辛酸、癸酸、辛酸乙酯和月桂酸乙酯等仅存在于对照组中。辛酸乙酯呈白兰地酒香味,月桂酸乙酯带有月桂油香气;丙酸苯乙酯呈似香甜红玫瑰香气并带有水果底香及似浓厚的甜的蜂蜜和草莓风味。结果表明,T.delbrueckiiS1菌株参与发酵对苹果醋水果样挥发性风味物质的合成具有重要作用。

2.3 T. delbrueckii S1强化对差异挥发性风味物质的影响

T.delbrueckiiS1菌株强化前后苹果醋中挥发性风味物质种类的差异见图4a。对照组与实验组共有挥发性风味物质为41 种,对照组的独有挥发性物质(9 种)多于实验组(5 种)。这说明实验组与对照组的挥发性风味物质种类具有明显差异,而差异代谢物主要集中在对照组。另外,两组苹果醋醋酸发酵阶段挥发性风味物质的组成差异见图4b。醋酸发酵开始时,两组样品聚集在一起;随着发酵的进行,两组样品呈明显的分离趋势,对照组和实验组样品分布分别趋向于第1象限和第2象限;至醋酸发酵第22天,两组样品彻底分开。这说明醋酸发酵前中期两组苹果醋的挥发性风味物质组成相似,随着醋酸发酵的进行,其挥发性物质组成逐渐呈现出明显的差异。通过排列检验对200 个排列的响应验证了OPLSDA模型的正确性,如图4c所示,所有R2和Q2值均低于原始值,蓝色回归线与垂直轴的交点小于零[17]。

图4 苹果醋醋酸发酵阶段挥发性风味物质Venn图(a)、OPLS-DA(b)、排列测试图(c)及基于OPLS-DA的VIP值(d)Fig.4 Venn diagram (a),OPLS-DA plot (b),permutation test plot (c) and VIP values from OPLS-DA model (d) of volatile flavor substances during the acetic acid fermentation stage of apple vinegar

通过计算基于OPLS-DA的VIP值,明确了两组苹果醋的21 种差异代谢物(VIP>1,P<0.05),如图4d所示。3-乙氧基丙醇、苯甲醇、癸酸、乙酸苯乙酯、正辛酸、苯甲醛、正丙醇、月桂酸乙酯、苯乙醇、2,3-丁二醇、己酸、正己酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、正丁醇、2,4-二叔丁基苯酚、辛酸乙酯、异丁醇、丙酸苯乙酯、2,6-二叔丁基对甲酚、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环和癸酸乙酯是两组苹果醋的差异挥发性风味物质。其中,3-乙氧基丙醇、乙酸苯乙酯、2,3-丁二醇、苯乙醇、丙酸苯乙酯、苯甲醇和苯甲醛在实验组中的含量更高,对实验组苹果醋的特征风味具有重要影响。乙酸苯乙酯带有似苹果样果香、玫瑰花香及蜂蜜样底香[18];苯甲醇赋予发酵产品花香和果香[19];苯甲醛具有苦杏仁、樱桃及坚果香[19]。苯乙醇是在厌氧过程中通过酵母的代谢反应由L-苯丙氨酸衍生而来[20],其带有柔和、愉快且持久的玫瑰香气及微苦后甜的桃子味[21]并有助于醋味的形成[22-23]。同时,造成对照组苹果醋风味区别于实验组的挥发性物质包括癸酸、正辛酸、正丙醇、己酸、正己酸乙酯、月桂酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、辛酸乙酯、异丁醇、正丁醇、癸酸乙酯及多种酚类物质。正丙醇具有令人愉悦的甜味[20],正己酸乙酯带水果香,癸酸乙酯具有似玫瑰香、微弱果香及明显的脂肪臭味[24]。可见T.delbrueckiiS1强化发酵有助于增强苹果醋的典型性苹果香和花香。

2.4 T. delbrueckii S1对苹果醋挥发性风味物质网络结构的影响

基于共现网络分别构建对照组和实验组挥发性物质网络以认识T.delbrueckiiS1对苹果醋挥发性风味物质伴生关系的影响,结果见图5。通过计算网络模型的拓扑系数发现,对照组共现网络共有30 个节点和130 条边,模块化为0.173;实验组共现性网络共有25 个节点和154 条边,模块化为0.033。实验组网络中的节点数目较对照组少,边数却明显比对照组多,这说明实验组挥发性物质之间的联系更强、更复杂。共现网络中的模块化是指网络中的节点构成内部联系较强,而与外部联系较弱的部分,模块化越低说明物质之间相互作用的传递性越强。实验组的模块化系数(0.033)低于对照组(0.173),这可能是由于内生菌T.delbrueckiiS1产生的代谢产物与S.cerevisiae及醋酸菌产生的物质间的相互作用导致。结果表明,T.delbrueckiiS1强化增加了挥发性代谢产物的复杂性。

为进一步研究共现网络中节点的作用及贡献,计算了网络中节点的拓扑性质,见表1。节点的中心性是指经过该节点的最短路径数量,介数中心性的提出为衡量节点中心性提供了标准[25]。正辛酸、苯酚、琥珀酸二乙酯、苯乙醇和苯乙酸乙酯等在对照组中的介数中心性较高,而正丁醇和乙醛在实验组中较高。节点的介数中心性越大,该节点在保持整个网络紧密连接中的作用越重要。可见,正辛酸、苯酚等物质在对照组挥发性物质相互作用的传递及网络的稳定性方面起重要作用。在实验组中,乙醛与乙酸苯乙酯、苯乙醇等属于一个模块,正丁醇与乙酸等属于同一模块,这说明乙醛和正丁醇对实验组特征挥发性风味物质的形成具有重要作用。实验组和对照组的重要节点明显不同,这可能也是两组苹果醋风味显著不同的原因。

2.5 T. delbrueckii S1强化对苹果醋有机酸合成的影响

采用HPLC法测定了7 种有机酸,分别为L-苹果酸、L-乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸和草酸。以色谱峰面积对各个标准有机酸标准溶液浓度进行线性回归分析,结果表明7 种有机酸标准曲线线性拟合系数均在0.9997~0.9999之间,说明该方法可以对有机酸进行准确的定量分析。两种苹果醋共检测出5 种有机酸,如图6所示,对照组中L-苹果酸含量随发酵进行先迅速减少然后趋于平稳,实验组中L-苹果酸则呈不断增加的趋势;发酵结束时实验组中L-苹果酸含量显著高于对照组。L-苹果酸是生物体代谢过程中的重要有机酸,其在线粒体产生能量物质ATP的过程中起重要作用。研究表明,L-苹果酸可以缩小心肌梗死面积,抑制炎性细胞因子的表达,从而部分保留动物心脏功能并增加心肌损伤后的抗氧化活性[26]。两组苹果醋中L-乳酸含量的变化与L-苹果酸相反;发酵结束时,实验组中L-乳酸的含量显著高于对照组。Kobayashi等[27]发现L-乳酸在糖尿病海马功能障碍中具有重要作用,即侧脑室注射L-乳酸可减轻糖尿病小鼠的认知功能障碍。在整个醋酸发酵过程中,对照组中的琥珀酸含量几乎均高于实验组;发酵结束时,对照组中琥珀酸的含量显著高于实验组。已有报道显示,与S.cerevisiae相比,非酿酒酵母产生琥珀酸的能力更弱[28];而Benito[29]通过研究也发现,T.delbrueckii比S.cerevisiae更利于产生琥珀酸,但这都是基于单一菌种发酵而言。当T.delbrueckiiS1菌株强化发酵时则可能因其与S.cerevisiae及醋酸菌的相互作用而降低产琥珀酸的能力;另一方面,琥珀酸是由丙酮酸通过苹果酸、富马酸和一些氨基酸的分解形成的代谢物,它很容易与其他分子反应形成酯[30]。特别地,实验组中乙酸含量显著高于对照组,乙酸是醋酸风味的主要来源,在一定范围内乙酸含量越高,醋的特性越明显;乙酸通过激活MAPK途径可诱导血糖降低[31-32]。在整个醋酸发酵过程中,两组苹果醋中L-苹果酸、L-乳酸、琥珀酸和乙酸的含量几乎均呈现出显著差异;而柠檬酸随着发酵的进行逐渐减少且未呈现出显著差异(P<0.05)。实验组中较多的L-苹果酸可调和乙酸的酸味和刺激性,提高苹果醋酸味的平和性[22]。

图6 苹果醋醋酸发酵阶段有机酸箱线图Fig.6 Box plot of organic acids during acetic acid fermentation of apple vinegar

3 结论

本研究采用HS-SPME-GC-MS及HPLC技术分别测定苹果醋挥发性风味物质和有机酸,分析苹果内生菌T.delbrueckiiS1对苹果醋风味品质的影响。结果表明,两组苹果醋的主要挥发性风味物质在种类和含量上均有差异,而苹果内生菌T.delbrueckiiS1对其合成的阶段性无明显影响。Venn图结果表明,对照组的独有挥发性物质比实验组多,即差异代谢物多集中在对照组。基于OPLSDA的VIP值(P<0.05,VIP>1)进一步筛选到苯甲醇、癸酸、乙酸苯乙酯、正辛酸、苯甲醛、月桂酸乙酯、苯乙醇、正丙醇、己酸、正己酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、辛酸乙酯、丙酸苯乙酯和癸酸乙酯等21种香气物质在两组苹果醋中的含量差异达到显著水平。通过比较发现,在实验组中更加突出的乙酸苯乙酯、苯乙醇、苯甲醛、苯甲醇等具有典型性苹果香等果香和花香;在对照组中较为突出的辛酸乙酯、己酸乙酯和月桂酸乙酯等具酒香、果香及精油香气。基于共现网络对两组苹果醋挥发性风味物质网络及挥发性物质之间的伴生关系和相互作用进行分析,发现T.delbrueckiiS1强化发酵会增加挥发性代谢产物之间的联系和复杂性,并且挥发性代谢物之间的相互作用导致其伴生关系发生变化。另外,箱线图表明实验组中L-苹果酸、L-乳酸和乙酸含量显著高于对照组。本研究探讨了苹果内生菌T.delbrueckiiS1对苹果醋风味物质合成的影响,T.delbrueckiiS1与S.cerevisiae之间的底物竞争、细胞接触机制及香气化合物间的协同作用对风味物质合成的影响机制还有待进一步研究。

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