古代经典名方保元汤的药效物质基础及其分子水平机制的研究

李淑慧，王 雅，田 军，郭雨轩，张淑涵，牟 越，翁小刚，孙 奕

古代经典名方保元汤的药效物质基础及其分子水平机制的研究

李淑慧1, 2，王 雅2，田 军3，郭雨轩1，张淑涵1，牟 越1，翁小刚1*，孙 奕1*

1. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700 2. 兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050 3. 江苏万邦生化医药集团有限责任公司，江苏 徐州 221001

阐释古代经典名方“保元汤”的药效物质基础并探讨其分子水平的作用机制，发掘保元汤更多潜在的临床应用优势。采用UPLC-QTOF-MS/MS技术，选用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，以0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）为流动相系统进行梯度洗脱，高分辨飞行时间质谱电喷雾电离源（ESI），正、负离子扫描模式，检测鉴定保元汤的化学成分组成，并分析保元汤大鼠多次多天ig给药后含药血浆中的原型化学成分及代谢产物，进一步运用网络药理学方法，利用TCMSP数据库和药物信息数据库等分析保元汤入血原型成分的靶向作用，并揭示其治疗潜能。根据精确相对分子质量数据和多级质谱碎片离子，结合对照品、数据库以及文献报道，共鉴定出保元汤中133个化学成分，并且确定大鼠ig保元汤后，35个成分能够经口吸收入血达到血浆稳态的药物浓度。保元汤入血原型成分“成分-靶点”网络图、核心靶基因基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析、疾病预测分析表明，保元汤可通过人参皂苷Rb1、丹皮酚、刺芒柄花素、刺甘草查耳酮、大豆异黄酮、甘草查耳酮A、6-姜辣素、水杨酸等8个关键成分作用于丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription）等核心靶点，通过糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end- products，RAGE）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、非受体酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）-信号转导子和转录激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）等信号通路等途径发挥药效作用，提示保元汤除治疗慢性心力衰竭外，还对阿尔茨海默症、再灌注损伤、绝经后骨质疏松症等具有潜在治疗优势。保元汤35个入血原型成分中含有多个同类成分的衍生物，且其中既有单一成分对接多个靶点、又有多个类似物对接同一靶点的情况，由此佐证了“中药（复方）多成分多靶点协同作用”和“中药多成分单靶点叠加作用”的理论。采用高分辨质谱分析技术和网络药理学及其数据库，可以为全面阐释中药（复方）药效物质基础及探讨其分子水平的作用机制提供可行的科学方法。明确了古代经典名方保元汤的入血化学成分，鉴定了其原型成分的代谢产物，并从分子水平阐释了基于这些入血原型成分的作用靶点，并揭示其潜在治疗优势，为扩大该方剂临床应用提供参考，发掘更多的临床治疗潜能。

保元汤；UPLC-QTOF-MS/MS；药效物质基础；分子水平机制；网络药理学；人参皂苷Rb1；丹皮酚；刺芒柄花素；刺甘草查耳酮；大豆异黄酮；甘草查耳酮A；6-姜辣素；水杨酸

保元汤是国家中医药管理局第一批公布的古代经典名方之一，源于明代《博爱心鉴》和《简明医彀》，由人参1钱、黄芪2钱、甘草5分，肉桂2分，生姜1片组成[1]，方中人参性禀中和，益元气而生精血，善补脾肺之气，为君药；黄芪味甘性温，固腠理而补元气，与人参相须为用，增强补气之功，为臣药；配伍少量肉桂，取其温通血脉、温肾补阳之功用；甘草味甘性平，可解毒又能补气中和，调和诸药，为佐使药。现代药理研究表明，保元汤具有调节免疫[2]、促进造血、调节凝血及纤溶平衡、抗氧化、抗应激[3]等作用[4]，在临床上常用于心衰、冠心病、缓慢性心律失常等心血管疾病的治疗[5]。2016年国家中医药管理局及国家药监局明确规定了生产符合国家规定条件且源于古代经典名方的中药复方制剂后，引起经典名方的研究热潮。作为临床常用经典名方保元汤，大多应用于心血管疾病的治疗上，临床应用相对较局限，保元汤的药效物质基础研究也较少[6]，本课题组从事保元汤的现代开发应用，已对保元汤进行了较为系统的研究探索，包括保元汤的处方组成、处方药材基原考证、各项工艺参数的优化、定量分析、指纹图谱的建立及量值传递等研究。国家中医药管理局遴选古代经典名方的原则是，体现“目前仍广泛应用、疗效确切、具有明显特色及优势”；古代中有较多记载及医案证据，现代文献中有较多临床及实验研究报道；得到中医临床进一步凝练、权威专家广泛认可；以及各类中医药教材中广为收录等。保元汤能够入选第一批名单，可见其具有广泛的应用和确切的临床疗效基础。为进一步阐明保元汤的药效物质基础及其作用机制，本研究采用UPLC-QTOF-MS/MS技术与网络药理学等方法，进行保元汤的化学分析及实验动物药动学研究，探讨保元汤的药效物质基础及其分子水平的作用机制，发掘该方剂的临床治疗潜能。

运用UPLC-QTOF-MS/MS技术，可以高效、准确地分析复方成分的相对分子质量、元素组成和裂解碎片等信息，可有效识别中药的各类复杂成分及其化学结构，为中药复方现代研究提供了进一步的技术支撑[7]。同时，采用网络药理学方法，并利用其日臻完善的数据库，通过构建“多成分-多靶点-多途径”多层次的网络用于中药药效物质的筛选及其作用机制分析，可为中药复方的深入研究提供有效的策略[8]。因此，本研究采用高分辨飞行时间质谱技术对保元汤水煎液以及ig给药大鼠的血浆成分进行分析鉴定，结合网络药理学等方法进行系统分析研究，为保元汤的药效物质基础研究和临床高效应用等提供必要的参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相系统和Vion QTOF型高分辨质谱仪、UNIFITM1.9.4数据处理软件（美国Waters公司）；Centrifuge 5424R型低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；VX-Ⅲ型多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）；HDZ20型智能煎药壶（容量2 L，额定功率500 W，稳定电压220 V，美味世家永达基电器厂）；LGJ-10E型冷冻真空干燥机 [四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司]。

1.2 药材与试剂

实验用对照品咖啡酸（批号120160505）、肉桂酸（批号20091329）、桂皮醛（批号21051103）、槲皮素（批号10081-9905）、6-姜辣素（批号20041903）、姜黄素（批号151022）、黄芪甲苷（批号21050701）、甘草苷（批号20091106）、甘草酸（批号20041302）、毛蕊异黄酮苷（批号21010901）、人参皂苷Rg1（批号20110810）、人参皂苷Rb1（批号21011625）、人参皂苷Rf（批号21071411）、人参皂苷Re（批号21012405）、人参皂苷F1（批号O0915AS）购自北京倍特仁康生物医药科技有限公司，对照品质量分数均＞98%。乙腈、甲醇、甲酸（美国Fisher公司）均为质谱纯；水为屈臣氏饮用水；其他试剂均为分析纯。

人参（批号RS220311）、黄芪（批号HQ220402）、甘草（批号GC220406）、肉桂（批号RG220315）、生姜（批号SJY501-21-10-004），购于江苏万邦生化医药公司，均来源于道地产区或主产区，经中国中医科学院中药研究所孙奕研究员鉴定，5味药材分别为五加科植物人参C. A. Mey. 的干燥根和根茎，豆科植物蒙古黄芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根，豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根茎，樟科植物肉桂Presl的干燥树皮，姜科植物姜Rosc.的新鲜根茎。

1.3 动物

SD大鼠，SPF级，雄性，体质量200～300 g，动物来源机构许可证号：SCXK（京）2021-0011或者SCXK（京）2021-0006；饲养于中国中医科学院中药研究所SPF级动物房，动物实验伦理审批单位为中国中医科学院中药研究所，批准文号2022B023。

2 方法

2.1 分析溶液的制备

2.1.1 保元汤水提液化学成分分析

（1）保元汤水提液制备：分别取3倍处方剂量药材饮片人参11.2 g、黄芪22.4 g、甘草5.6 g、肉桂2.3 g、生姜片约9.0 g，加水1200 mL，浸泡60 min，以武火煮沸后转文火继续煎煮至480 mL，多层纱布趁热滤过，取续滤液；药渣再加水900 mL，煎煮至420 mL，多层纱布趁热滤过，取续滤液，合并2次滤液，得提取液。将少量提取液经0.22 μm滤膜滤过，取2 μL液质分析。

（2）对照品溶液制备：精密称取各对照品约1.0 mg，精密称定，加入甲醇配制成1.0 mg/mL的单一对照品储备液。从上述各单一对照品储备液中精密量取储备液各100 μL，加入甲醇稀释，配制成质量浓度为0.05 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 保元汤入血成分分析

（1）保元汤ig液制备：称取保元汤水提液冻干粉末，加适量饮用水配制成0.14 g/mL的ig受试液。

（2）血浆样品采集与处理：经预试验，确定动物给药及采血方案：6只SD雄性大鼠，分为给药组与空白组，每组3只，给药前禁食12 h，自由饮水，保元汤2倍临床等效剂量ig给药（1.41 g/kg），给药容积1 mL/100 g，空白组给予同等体积的蒸馏水，每天给药2次，连续给药1周，1周后戊巴比妥钠麻醉，腹腔主动脉取血，肝素管抗凝，静置，4 ℃，3500 r/min，离心15 min，取上清液则为含药血浆[9]。

取含药血浆样品200 μL，加入甲醇800 μL沉淀蛋白，涡旋5 min，离心（转速13 000 r/min，15 min，取上清，氮气吹干，备用。固相萃取柱活化，取氮气吹干后样品加0.5 mL水溶解，涡旋2 min后上样，以5 mL水洗脱，收集洗脱液，再用5 mL的70%甲醇洗脱，收集2种洗脱液，将水洗脱液和甲醇洗脱液13 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，70%甲醇洗脱液经氮气吹干，100 μL 70%甲醇复溶，经0.22 μm滤膜滤过，得血浆样品进行分析。空白血浆处理方法同上。

2.2 UPLC-MS/MS条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS-T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～3 min，2%～19% B；3～8 min，19% B；8～8.1 min，19%～22% B；8.1～14 min，22%～29% B；14～16 min，29% B；16～32 min，29%～45% B，32～32.1 min，45%～90% B，32.1～35 min，90%～95% B，35～36 min，95% B，36～40 min，95%～2% B；体积流量0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量2 μL。

2.2.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），扫描方式为MSe模式，正、负离子模式下离子源工作参数为毛细管电压3.0 kV，锥孔电压30 V，锥孔反吹气流量（N2）50 L/h，脱溶剂气流量1000 L/h，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度450 ℃，扫描范围50～1500，数据分析采用UNIFITM1.9.4质谱分析软件进行数据采集分析。

2.3 化合物鉴别与结构分析

采用UNIFITM1.9.4质谱分析软件进行数据采集和分析，通过Chemspider数据库、chemical book数据库、本课题组化学成分实验数据库以及结合可参考文献数据，建立包含保元汤5味药材化学成分的质谱内部数据库，通过精确相对分子质量、离子碎片信息以及对照品比对鉴定化合物，并按照化合物结构类型进行总结归纳；入血成分的鉴定方法同上，给药后血浆与方剂提取液离子峰的保留时间、质荷比一致的化合物，则确认为保元汤中的入血成分，并对其中特征成分的代谢产物进行鉴别。

2.4 网络药理学分析

2.4.1 保元汤潜在作用靶点 将经UPLC-QTOF- MS/MS分析鉴定后的保元汤入血原型成分，通过TCMSP数据库和药物信息数据库Drug Bank（http://www.drugbank.ca/）找到与之对应的靶蛋白。

2.4.2 网络构建 在Uniprot数据库中查找靶点蛋白对应的基因名称和编号，将活性成分及相关靶点基因名导入网络可视化软件Cytoscape 3.8.2，运用Cytoscape软件构建保元汤入血活性成分-靶点网络。通过网络将活性入血成分与作用靶点相关联，实现从保元汤主要入血成分到作用靶点分析，通过String数据库对相应的靶点绘制蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图，通过节点度（degree）值与combined score值大小筛选核心靶点。

2.4.3 数据分析处理与疾病预测 构建的“成分-靶点”网络图，运用Cytoscape软件中的工具Network Analyzer来分析中介中心度（betweenness centrality）和节点度这2个重要的网络拓扑参数；利用Metascape数据库对获得的靶基因进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。Bonferroni法校正后＜0.01的项目被认为是显著富集，故根据＜0.01，进行筛选相关的生物过程（biology process，BP）、细胞组成（cellular componet，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及KEGG富集后的主要通路。最后，将KEGG信号通路经FDR筛选，输入CTD数据库进行疾病预测。

3 结果

3.1 保元汤水提液化学成分鉴定

通过文献综述等方法整理出人参、黄芪、甘草、肉桂、生姜5味中药化学成分，得到保元汤主要化学成分389种[10-11]，其中人参75种、黄芪109种、甘草162种、肉桂43种、生姜67种。通过Chemspider数据库和Chemical Book数据库下载保元汤主要化学成分mol格式文件，在UNIFITM1.9.4中建立了包含215种化学成分的内部数据库。对UPLC-QTOF- MS/MS的采集数据对库，结合本课题组内部数据库及文献中质谱裂解规律及对照品比对共鉴别出133个成分，保元汤水提液正、负离子模式下的总离子流图及成分归属见图1，保元汤水提液化学成分见表1，主要化学成分为皂苷和黄酮类。典型化合物质谱裂解规律如下，（1）皂苷类：化合物83（R＝22.85 min）在负离子模式下检测得到准分子离子峰为/1 153.60 [M＋HCOO]−, 1 107.598 4 [M－H]−，其二级质谱图（图2-B）上可看到碎片离子/945.544 5 [M－H－Glc]−, 783.491 7 [M－H－GlcGlc]−, 621.438 5 [M－H－GlcGlcGlc]−，经查阅文献，并与对照品比较，推断化合物83为人参皂苷Rb1。化合物53（R＝13.08 min）准分子离子峰为/799.486 0 [M－H]−, 845.491 9 [M＋HCOO]−, 637.433 1 [M－H－Glc]−, 475.379 7 [M－H－GlcGlc]−，经查阅文献，并与对照品比较，推断53为人参皂苷Rg1（图2-A）。通过以上规律可以得出皂苷的裂解以糖苷键的断裂为主，类似的化合物54被推断为Re，其余化合物类比鉴别。（2）黄酮类：化合物35（R＝7.34 min）准分子离子峰为/417.119 4 [M－H]−，其二级质谱图上可见碎片离子/255.066 7 [M－H－Glc]−, 135.008 6, 119.049 9，结合文献，糖苷键的断裂和RDA裂解是黄酮类化合物的主要质谱裂解规律，故推测135.008 6 [1, 3A]−, 119.049 9 [1, 3B]−，与对照品比对，推断35为甘草苷（图2-C），其余化合物依次类推得出。

A-保元汤负离子流图 B-保元汤正离子流图 C-混合对照品正离子流图 D-混合对照品负离子流图

表1 保元汤提取液化学成分信息

续表1

续表1

续表1

续表1

“*”表示有对照品；“−”表示该成分未查到确定碎片；表中来源用字母代表各药材（R-人参，H-黄芪，G-甘草，S-生姜，C-肉桂）

“*”represents having standards; “−”represents no fragment; R, H, G-, S-, C, respectively.

A-人参皂苷Rg1 B-人参皂苷Rb1 C-甘草苷

3.2 保元汤水提液主要入血化学成分鉴定

前项研究已得保元汤水提液化合物鉴定结果，由于水提液化合物鉴别方法的色谱条件、质谱条件等与大鼠含药血浆中入血成分鉴定方法一致，因此保元汤水提液化合物保留时间及特征离子与血浆中入血成分数据也高度一致，以保元汤水提液中化合物信息为基准，构建“保元汤入血成分数据库”，采用UNIFITM1.9.4进行数据匹配，对保元汤的入血成分进行识别（图3），共鉴定出35个入血成分（表2），其中包括9个皂苷类、14个黄酮类、4个有机酸，8个其他类成分，对其中代表性成分中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、甘草酸进行代谢产物鉴定，鉴定结果见表3。

A-血浆样品70%甲醇层正离子流图 B-血浆样品70%甲醇层负离子流图

3.3 基于网络药理学的功效物质及其靶点预测

通过TCMSP数据库和Drug bank数据库检索并与文献比对，保元汤35个入血原型成分中共有27个入血成分能得到对应的靶点，共有193个对应作用靶点。通过Uniprot进行基因名称的转化，利用Cytoscape构建出“成分-靶点”网络图（图4），betweenness centrality和degree均大于平均值的主要成分有人参皂苷Rb1、丹皮酚、大豆异黄酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水杨酸（表4）。利用String数据构建PPI网络图（图5），根据degree以及combined score筛选关键靶点，主要靶点分别为E1结合蛋白P300（E1A binding protein p300，EP300）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、肿瘤蛋白p53（tumor protein P53，TP53）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，AKT1）、信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、人磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基1（phosphatidylinositol-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）、环腺苷3′,5′-单磷酸反应元件结合蛋白1（cyclic adenosine 3,5-monophosphate responsive element binding protein 1，CREB1）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、周期素依赖性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）。

3.4 GO功能与KEGG通路富集分析

利用Metascape在线数据库对预测靶点进行GO和KEGG富集分析，筛选出＜0.01的GO条目346个，其中BP 199个，CC 56个及MF 91个。BP主要有对激素的反应（response to hormone）、对异生素刺激的反应（response to xenobioti stimulus）、对缺氧的反应（response to hypoxia）、凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）、对氧化应激反应（response to oxidative stress）等，CC主要涉及到膜筏（membrane raft）、胞膜小窝（caveola）、膜微区（membrane microdomain）、神经元细胞体（neuronal cell body）、突触后膜（postsynaptic membrane）等；MF主要有酶结合（enzyme binding）、蛋白质结合（protein binding）、蛋白质异二聚化活性（protein heterodimerization activity）等分子功能。各取前20位制作富集气泡图，见图6。

表2 保元汤入血化学成分信息

“−”表示该成分未查到确定碎片；“/”表示该成分未做网络药理学分析；“*”表示有对照品

“−”represents no MS/MS fragment; “/” represents without network pharmacological analysis; “*” represents with references.

通过KEGG富集分析得到信号通路，根据＜0.01筛选，共得到187条通路，其中主要涉及到糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）-糖基化终末产物受体信号（receptor for advanced glycation end products，RAGE）通路（AGE-RAGE signaling pathway）、脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、表皮生长因子-酪氨酸激酶抑制剂抵抗（epidermal growth factor receptor，EGFR-tyrosine kinase inhibitor resistance）、雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）、缺氧诱导因子信号通路（hypoxia inducible factor-1，HIF-1 signalingpathway）、松弛素信号通路（relaxin signaling pathway）、白介素-17信号通路（interleukin-17，IL-17 signaling pathway）、Janus激酶-信号转导子和转录激活子（Janus kinase，JAK；signal transducer and activator of transcription，STAT）（JAK-STAT signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、环鸟苷单磷酸蛋白激酶信号通路（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG signaling pathway）、血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）、环核苷酸信号通路（cAMP signaling pathway）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等信号通路。每条通路富集多个基因，体现了保元汤在治疗疾病过程中多靶点、多通路的作用特点。以基因富集数目多，值大小为选择依据，选取前20个通路制作富集气泡图见图7。

表3 代表性成分代谢产物信息

图4 入血成分“成分-靶点”网络图

表4 保元汤中8个成分的网络拓扑参数

3.5 疾病预测

将上述String数据库得到的KEGG信号通路再经FDR值小于0.001筛选后得到的前5条信号通路（hsa04933：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，hsa05200：pathways in cancer，hsa05215：prostate cancer，hsa05417：lipid and atherosclerosis，hsa05161：hepatitis B）输入到CTD数据库进行疾病预测，共得到284种疾病，从中筛选均涉及上述5个通路的疾病共有24种：心脏衰竭、心肌病、心肌炎、心肌梗死、心肌缺血、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、阿尔茨海默症、再灌注损伤、绝经后骨质疏松症、乙型肝炎、关节炎、类风湿、急性肾损伤、肺纤维化、哮喘、动脉粥样硬化、肝硬化、2型糖尿病、结直肠癌、高血压、脑缺血、黑色素瘤。

节点注释：圆从小到大，相应节点的颜色从深蓝色-浅蓝色-米色-黄色-棕色-红棕色代表节点degree值从小到大；边注释：线从细到粗，相应线的颜色从深蓝色-浅蓝色-米色-黄色-棕色-红棕色代表combined score值从小到大

4 讨论

课题组在前期的血浆前处理中，以检测到物质最多为标准，比较了乙腈、甲醇、异丙醇沉淀以及样品的处理方法，最终确定血浆样品前处理选择4倍量甲醇沉淀蛋白，再过固相萃取小柱富集、除杂，以70%甲醇复溶后液质进样分析为最佳方案。

综合各种可参考文献数据可知，保元汤原药材含有至少389个化学成分。运用高分辨质谱分析技术，从保元汤水提液中共鉴定得到133个化合物。本实验制备的保元汤水提液符合临床使用实际，故对保元汤进行药效物质基础分析时，基于实验所得133个化合物更有针对性。

图6 GO富集分析

图7 KEGG通路富集分析

经多次多天大鼠ig给药后，发现保元汤有35个原型成分可以被吸收入血在体循环中稳态分布，并且在大鼠含药血浆成分检测中，包含35种原型成分在内共鉴别了43个化合物，药物吸收入血后会代谢转化成代谢产物等物质，共鉴别14个代谢产物，其中有6个既是原型成分，也是代谢产物，分别为毛蕊异黄酮、大豆异黄酮、甘草素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、18β-甘草次酸；其余8个化合物为原型成分的代谢产物，因而推测其主要成分的代谢类型有葡萄糖基水解、葡萄糖醛酸水解、葡萄糖醛酸化、氢化、硫酸化、甲酯化等过程。本实验以入血的原型成分作为保元汤在体内的药效物质基础，故以鉴别出的35个原型成分为基准。

保元汤可通过人参皂苷Rb1、丹皮酚、大豆异黄酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水杨酸等8个关键成分作用于EP300、MAPK1、TP53、AKT1、RELA、STAT3、MAPK14、PIK3R1、TNF、CREB1、AR、CDKN1A等核心靶点，通过AGE-RAGE、EGFR、JAK-STAT、cGMP-PKG、cAMP、PI3K-Akt信号通路等多种途径发挥药效作用，推测保元汤除治疗慢性心力衰竭外，还对阿尔茨海默症、再灌注损伤、绝经后骨质疏松症等具有潜在治疗优势。更值得一提的是，本课题组在化合物靶点和通路等靶标分析时，发现多种化学成分中既有单一成分对接多个靶点、又有多个类似同类成分对接同一靶点的情况，由此可佐证“中药（复方）多成分多靶点协同作用”理论与“中药多成分单靶点叠加作用”假说。中药复方能从多途径、多靶点、多层次、多系统的对疾病进行干预，突显了中药复方治疗疾病的潜力和优势，即中药（复方）具备“多成分多靶点协同作用”特征。蔡少青等[26-27]提出中药“多成分单靶点叠加作用”假说，认为中药多成分多靶点协同作用网络中局部靶点可存在相似多成分的药效叠加作用。

保元汤药效物质关联治疗的潜能分析。保元汤作为临床上常用的经典名方，对心血管系统疾病，如慢性心力衰竭、扩张型心肌病[28]、心肌炎、心绞痛等具有良好的效果[29-30]。通过多通路靶点发挥治疗作用，慢性心力衰竭发病与VEGF、TNF-α、IL-6等炎症因子的表达[31]以及MAPK、JAK-STAT、NF-κB等信号通路[32]相关；扩张型心肌病的发病与MAPKs、PI3K-Akt、cGMP-PKG等通路密切相关。上述两种疾病涉及到的信号通路与文章通过GO和KEGG功能富集得到保元汤作用主要信号通路AGE-RAGE、EGFR、JAK-STAT、cGMP-PKG、cAMP、PI3K-Akt等信号通路均相对应，推测保元汤可能通过细胞质、细胞膜、内质网等细胞组分调节PI3K-Akt、MAPK、AGE-RAGE、TNF等通路发挥抑制炎症反应、抗氧化、抑制细胞凋亡等作用。

本实验所提示的保元汤潜在治疗优势病种除传统治疗心衰外，还有23种预测疾病。“化合物-靶点”网络分析结果显示，保元汤中人参皂苷Rb1、丹皮酚、大豆异黄酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水杨酸等8个成分的潜在作用靶点较多，推测它们在保元汤对疾病的治疗中发挥重要作用。有研究表明人参代表性成分人参皂苷Rb1能显著降低心肌梗死面积，可能是通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化、激活mTOR信号通路和调控线粒体功能实现；人参皂苷Rb1同时有治疗阿尔茨海默病症的潜力，人参皂苷Rb1通过改变β-淀粉样前体蛋白裂解途径，减少Aβ的生成，抑制Aβ诱导的神经毒性反应；通过抑制细胞凋亡因子Bax、Caspase-3表达，激活抗细胞凋亡因子Bcl-2，保护神经元细胞从而改善痴呆鼠的认知功能[33]，臣药黄芪中主要活性成分皂苷和黄酮类，已有临床研究证明[34]，黄芪能通过抑制氧化应激的激活与扩散，减轻心肌损伤，从而起到保护心肌的作用。黄芪中芒柄花素能通过抑制ERK1/2、p38及NF-κB磷酸化，诱导细胞凋亡；还可通过PGC-1α通路、NF-NRF-2/HO-1通路抑制高脂血症诱导的炎症，改善认知功能[35]。毛蕊异黄素可通过调节PI3K/Akt信号通路及Bcl-2、Bax，增加H9c2细胞的细胞活性，并通过抑制氧化应激及细胞凋亡改善阿霉素诱导的心脏毒性[36]。甘草中活性成分大豆苷元能通过活化ERα对MG-63细胞IL-6的表达起抑制作用[37]，IL-6是骨代谢过程中重要的调节因子，与雌激素缺乏导致的骨丢失密切相关，妇女绝经后骨质疏松症的发生，很可能是由于患者的雌激素下降致使IL-6分泌水平升高[38]。通过GO功能和KEGG富集结果显示雌激素信号通路也是保元汤作用主要信号通路之一。也有研究表明大豆苷元有防治阿尔茨海默症的作用及其抑制Aβ神经毒性发挥神经保护作用[39]。此外，甘草查耳酮A抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化并促进乳腺癌细胞自噬[40]；刺甘草查耳酮能通过抑制NLRP3炎症小体的异常活化从而治疗多种炎症性疾病[41]。研究发现[42]6-姜酚能够通过抑制细胞内PDE4蛋白表达而抑制环磷腺苷水解，升高细胞内cAMP含量，从而发挥其抗炎作用。

综上所述，结合疾病预测结果，发现保元汤除了对临床常规治疗疾病心脏衰竭、心肌病、心肌炎、心肌梗塞、心肌缺血等心血管疾病外，还对阿尔茨海默症、再灌注损伤、绝经后骨质疏松症、多种炎症疾病等具有治疗潜力。

因此，本研究基于UPLC-QTOF-MS/MS技术，明确鉴定了保元汤水提液中133个化合物，其中，皂苷类54个、黄酮33个、生物碱4个、有机酸17个、其他类25个；鉴定到入血成分35个，代谢产物8个，并结合网络药理学等方法对保元汤入血原型成分的主要作用靶点及分子水平作用机制进行探讨，预测了12个关键靶标基因，8个主要入血药效活性成分，发现保元汤药效分子机制主要涉及炎症相关通路、氧化应激等方面，对阿尔茨海默症、再灌注损伤、绝经后骨质疏松症、多种炎症疾病有治疗潜力，本次研究可为保元汤质量标准、质量标志物、扩大临床适应症等研究提供参考，进一步拓展保元汤的临床应用，也可以为古代经典名方的现代开发应用提供研究方法学借鉴。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Research on pharmacodynamic substances and molecular mechanism of ancient classical formula Baoyuan Decoction

LI Shu-hui1, 2, WANG Ya2, TIAN Jun3, GUO Yu-xuan1, ZHANG Shu-han1, MU Yue1, WENG Xiao-gang1, SUN Yi1

1. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2. School of Life Sciences and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China 3. JiangSu Wanbang Biopharmaceuticals, Xuzhou 221001, China

To elucidate the pharmacodynamic substances and the molecular mechanism of the ancient classical formula Baoyuan Decoction (BYT), in order to explore more potential clinical application advantages of BYT.The UPLC- QTOF-MS/MS technology was was used to perform gradient elution on a Waters ACQUITY UPLC-HSS T3column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) with 0.1% formic acid water (A)-acetonitrile (B) as mobile phase system. High resolution time-of-flight mass spectrometry electrospray ionization source (ESI) and positive and negative ion scanning modes were used to detect and identify the chemical components of BYT, and the prototype chemical components and metabolites in the drug-containing plasma of BYT rats after multiple and multi-day ig administration were analyzed. Furthermore, key targeting effects and the therapeutic potential of the absorbed prototype components of BYT into blood were predicted using network pharmacological methods through TCMSP database and drug information database.According to accurate relative molecular mass data and multistage mass spectrometry fragment ions, combined with reference products, databases and literature reports, a total of 133 chemical components in BYT were identified, and it was determined that 35 components could be absorbed into the blood through oral absorption to achieve stable plasma concentration after rats were given BYT by ig. The “component-target” network map of the absorbed prototype components of BYT into blood, core target gene gene ontology (GO) functional enrichment analysis, Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis, and disease prediction analysis indicated that BYT might act on mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), tumor protein p53 (TP53), signal transducer and activator of transcription and other core targets through eight key components, including ginsenoside Rb1, paeonol, formononetin, echinatin, daidzein, licochalcone A, 6-gingerol and salicylic acid, and exert medicinal effects through the signaling pathways of advanced glycation end products- receptor for advanced glycation end-products (AGE-RAGE), epidermal growth factor receptor (EGFR), janus kinase-signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT). It suggests that BYT has many potential therapeutic advantages on such as Alzheimer disease, reperfusion injury, postmenopausal osteoporosis, besides chronic heart failure. There were several derivatives of the same components in the 35 absorbed prototype components of BYT,, and one compound can dock with multiple targets, as well multiple analogues dock with the same target, which supporting the theoretical understanding of “multi-component, multi-target synergy of traditional Chinese medicine (formula)” and “multi-component, single-target superposition of traditional Chinese medicine”.Applying the UPLC-QTOF-MS/MS, network pharmacological and its database, which could provide a feasible scientific method for exploring the pharmacodynamic substances of traditional Chinese medicine (formula) and its molecular mechanism of action, as well clarifying the absorbed prototype components of BYT into blood and identifying some metabolites of some prototype components. And the target of action based on these prototype components was explained from the molecular level, and its potential therapeutic advantages were revealed, so as to provide reference for expanding the clinical application of this prescription and explore more clinical therapeutic potential.

Baoyuan Decoction; UPLC-QTOF-MS/MS; pharmacodynamic substances; molecular mechanism; network pharmacology;ginsenoside Rb1; paeonol; formononetin; echinatin; daidzein; licochalcone A; 6-gingerol; salicylic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2023)21 - 6971 - 17

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.006

2023-03-04

中国中医科学院科技创新工程（CI2021A04514）

李淑慧，在读硕士，从事中药质量控制与品质评价研究。Tel: (010)64021051 E-mail: 1744140302@qq.com

通信作者：孙 奕，研究员，从事中药化学与天然药物化学研究。Tel: (010)64020151 E-mail: ysun@icmm.ac.cn

翁小刚，研究员，主要从事中药复方配伍、药动学研究。E-mail: xgweng@icmm.ac.cn

[责任编辑 王文倩]