产香气化合物微生物的研究进展

李媚媛，刘安琪，唐道埔，刘 冰，张新国,*，张 继

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃省高校中藏药筛选评价及深加工重点实验室，甘肃 兰州 730050；2.西北师范大学新农村发展研究院，甘肃 兰州 730070）

香气化合物是自身具有香气的酯类、醛类、醇类、酮类、萜类、有机酸类等化合物的统称[1-3]，其具有抗氧化、抗菌等活性，在食品、化妆品、香料等行业应用广泛，部分香气化合物还可以作为燃料、溶剂、天然杀虫剂、信息素和药物前体[4-5]。目前香气化合物主要是通过化学合成以及从天然动植物中提取来获得。化学合成是当前获取香气化合物的主要方法之一，但存在环境污染、产物含有反应副产物等问题，应用于食品、化妆品中安全性难以保证。尽管利用传统方法从天然动植物中提取香精、香料可以满足安全性的需求，但受到资源的限制，且溶剂消耗量大、提取率低、提取成本高[6]，难以满足市场的需求。

随着我国经济发展和人民生活水平提高，人们对香气化合物的需求日益增加[7]，绿色香气化合物成为主流。研究显示，许多微生物不仅能利用酶对香气化合物进行从头合成，还可以通过生物转化作用产生香气化合物[8-13]，这些微生物除了原始菌株外，还有通过基因工程改造后的工程菌株。中、美两国均将酶法或微生物法所得的香料定义为天然香料[14-15]，推动了生物技术合成香料市场的发展[16-17]。本文就产香微生物来源、产香气化合物研究概况及利用微生物发酵提高香气化合物产量的探索与策略等方面进行综述，为通过微生物生产绿色香气化合物提供重要的理论依据。

1 产香微生物的来源与分离

1.1 土壤中的产香微生物及其分离

土壤是自然界最丰富的微生物库，已有不少的研究从土壤中筛选产香微生物用于食品发酵或香料等生产。Wang Xuzeng等[18]从8 个不同地区的葡萄园土壤中筛选出了3 株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和1 株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），通过顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术对菌株挥发性物质进行检测，得到45 种芳香物质，为获得香气浓郁的葡萄酒提供了重要参考。Muddapur等[19]从森林土壤中分离到一株黑青霉菌（Penicillium nigricans），该菌株能通过多种途径将具有松木香气的3-蒈烯[20]转化为二氢香芹酮、香芹酮、紫苏酸等香料物质或香料合成中间产物。Bao Yanrong等[21]从芒果园的芒果果皮及土壤中分离到一株库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），经HS-SPME和GC-MS对其挥发性物质进行检测，发现了乙酸乙酯、异戊醇（苹果味）、苯乙醇（蜂蜜和玫瑰味）以及β-紫罗兰酮（花香、果香和甜味）。Li Xuewei等[22]从甘薯根际土壤中分离鉴定出一株淡紫链霉菌SPS-33（Streptomyces lavendulaeSPS-33），发现其代谢产物含有3-甲基-1-丁醇/异戊醇、癸酸乙酯、苯乙醇等多种香味化合物。

一些大型土壤真菌往往能合成数十种香气物质。如松露作为定殖在松树根部土壤的一类蕈菌，因能产生醇类、酮类、醛类、芳香族和硫类化合物而拥有独特的香气[23]，研究发现，多种定殖于松露上的细菌、酵母菌和丝状真菌共同参与了松露的香气产生[24]。Zhang Huiying等[25]发现鲜牛肝菌（Boletus edulis）具有29 种香气物质，包括多种醛、醇类化合物。松露、牛肝菌及其他蕈菌也因其复杂的香气而深受人们喜爱。张炳火等[26]对从森林土壤中分离的产香真菌JXJ 01进行鉴定，显示该菌种与赤褐鹅膏菌（Amanita fulva）亲缘相近但子实体形态不同，可能是一种新型蕈菌，通过GC-MS对其香气成分进行分析，鉴定出20余种香气物质，其中反-桂酸甲酯、桂酸乙酯和芳樟醇含量占到总挥发性成分的31.71%。

土壤微生物基数大且种类繁杂，对分离方法和技术有更高的要求[27]，现有产香微生物的研究多采用富集培养法，以花园、果园等土壤为样本来源[18-21]。探索一些新方法是必要的，比如通过向培养基中加入特定生长介质，如待发酵物、转化底物、生长因子等，或者直接以某种底物为唯一碳源，为目标菌种创造出适宜的环境[28-30]，以实现目的菌种的富集[31-32]。

1.2 植物中的产香微生物及其分离

植物内生菌是生活于健康植物组织内部、不引发植物明显病症的微生物，部分植物内生菌能产生与宿主相同或相似活性的物质[33]，因此分离香料植物内生菌已成为当前研究的热点。

Monggoot等[34]从泰国采集的芳香木本植物Aquilaria subintegra中发现来自Arthrinium属、Colletotrichum属和Diaporthe属的4 株菌能产生苯甲酸乙酯、苯甲酸苄酯以及β-沉香呋喃等广谱挥发性化合物，这些化合物与宿主产生的沉香油组成成分非常相似，对于寻找沉香木主要香气化合物的替代资源具有重要意义。刘选明等[35]用4 种不同的分离培养基从成熟香茅草中分离筛选出一株具有明显清新、愉悦香味的菌株Pantoea ananatisCcSh-1，对其代谢产物进行分析发现，其中香气化合物橙花醛和香叶醛的含量都相对较高。Bier等[36]从Pinus taeda树皮中分离出一株拟茎点属（Phomopsissp.）内生真菌，其能产生松油烯-4-醇、薄荷醇和香叶醇等香气化合物。Molina等[37]从Dipteryx alataVog.果实中分离出3 株真菌，其能将α-蒎烯转化为具有樟脑和薄荷风味[38]的马鞭草烯醇，产量最高的菌株在发酵72 h后质量浓度达80 mg/L。从植物中寻找与宿主有相似代谢的内生菌发酵产香弥补了香料资源的短缺，也为香气化合物的发现的提供了重要的机会。

植物产香微生物的分离与植物内生菌相似。采用传统分离方法时应注意不同处理方法特别是消毒程序的选择，会导致微生物量有较大差别[39]，需针对不同微生物选择合适的培养基、适当延长培养时间从而兼顾环境中生长缓慢的微生物。此外，在分离过程中可以采用一些新技术，比如运用宏基因组学的技术[40]确定目标菌株、选择合适的培养基，对于产香微生物的分离具有重要指导意义。

1.3 水体中的产香微生物及其分离

地球上的水体约占地球表面积的71%，是地球上最大的生态系统，蕴藏着巨大的生物资源，其中不乏各种产香微生物。Hosoglu[41]对3 种海洋微藻（Crypthecodinium cohnii、Schizochytrium limacinum、Tetraselmis chuii）和2 种淡水微藻（Chlorella vulgaris、Chlorella protothecoides）的特征香气成分进行分析，共检测到29 种挥发性有机物，分属硫化物、醛、醇、酮、芳香烃和酯等六大类，在这5 种菌株发酵样品中都检测到二甲硫醚（卷心菜气味，嗅觉阈值低、气味活性强，易由香味过渡到异味[42-43]）、1-辛烯-3-醇（蘑菇香味）、(Z)-1,5-辛二烯-3-酮（天竺葵清香）、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪（豌豆清香）和(E,Z)-2，6-二十二烯（黄瓜清香）等。Sutani等[44]从日本海洋沉积物中分离出菌株MS1和MS2，并被鉴定为白地霉（Geotrichum candidum），其可以释放出类似甜瓜的香气，GC-MS分析结果表明与其相关的主要化学物质为顺式-3-己烯-1-醇、顺式-6-壬烯醛、3,6-壬二烯-1-醇等。梁龙元等[45]从深海海泥中取样，用含三丁酸甘油酯的培养基进行筛选得到一株产酯酵母。以乙醇和己酸为底物，酵母菌株的酯化能力为2.6976 U，经鉴定与近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）的同源性为99%。赵希景[46]从潮间带沉积物中分离获得8株可以将阿魏酸转化为香兰素的菌株，筛选获得了一株高产菌株B-32，在1 g/L阿魏酸的发酵液中能生成0.71 g/L的香兰素。Chen Wen等[47]对从印度洋分离的深海细菌Bacillus aryabhattaiMCCC 1K02966挥发性物质进行分析，结果显示该菌能产生具有强烈洋葱、大蒜和萝卜香气的硫代乙酸甲酯和具有花香和果香的1-丁醇[48]。

水体中产香微生物的取样，特别是海洋产香微生物，通常在海洋沉积物和其他特殊生态位中进行[49]，培养时应考虑其特殊条件，引入含有海水的培养基，兼顾水压、温度等。微藻作为水体中较为丰富的微生物，培养时应注意光照、温度和盐度[50]。此外，一些新分离方法比如通过选择性滤膜进行天然环境原位培养以分离难培养的产香微生物仍然值得期待[51]。

1.4 发酵环境中的产香微生物及其分离

除自然环境中存在的微生物，人类在发酵食品等过程中营造的人工环境也存在丰富的产香微生物，且由于特定的生长环境，这些菌种往往有更高的特异性。以中国的白酒为例，富志磊等[52]从衡水老白干酒曲中分离出一株高产β-苯乙醇的季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）F11601，在优化培养条件后β-苯乙醇产量可达1.66 g/L，除苯乙醇外，还能产生棕榈酸乙酯、肉豆蔻酸、月桂酸等白酒中的重要特征香味物质。Lai等[53]从高粱酒的黄水中分离出3 株酵母菌，经鉴定分别为Candida humilis、酿酒酵母和Kazachstania exigua，均具有较强的产酯能力，产物中2-苯乙醇、乙偶姻、异戊醇、乙酸乙酯的含量较高。Liu Chaolan等[54]从浓香型白酒窖泥中分离出一株新型梭状芽孢杆菌（Clostridium swellfunianumsp.nov.）S11-3-10T，其发酵产物含有丰富的乙醇、乙酸，以及微量的丁酸和异戊酸（奶酪味、酸味），这些化合物在白酒香气形成中起着重要的作用。曾婉俐等[55]从自然醇化的红大烟叶样品取样，用含烟叶浸提物的培养基进行分离纯化，得到一株甲基营养型芽孢杆菌属的产香细菌HD-40，从该菌的发酵液中检测出44 种香味物质，包括苯乙醇、2,3-丁二醇、丙酸乙酯等，其中乙偶姻占比达60.31%，这些化合物有可能增加烟叶风味。余翔等[56]从发酵用烟叶中筛选出一株产香菌株GXY35，其被鉴定为克雷伯氏杆菌（Klebsiellasp.），GC-MS分析结果显示该菌含量最高的特征香味物质为4-乙烯基愈创木酚。此外，葡萄酒[57]、酸奶[58]、酱油[59]和醋[60]的发酵都有丰富的产香微生物参与，赋予产品各种风味。

尽管鲜有研究对产香微生物多样性进行系统分析，但是现有研究关于产香微生物主要集中在真菌界的酵母菌属[61]、库德毕赤酵母[20]、青霉属[18]、曲霉属[34]、地霉属[44]、威克汉姆酵母属[62]、节菱孢属[33]、间座壳属[33]、刺盘孢属[33]、小球藻属[41]、拟茎点属[36]、假丝酵母属[45,53]、Schizochytrium属[41]、Crypthecodinium属[41]、Tetraselmis属[41]、Meyerozyma属[52]、Kazachstania属[53]、耶氏酵母属[63]、蕈菌[26]、担子菌[64]，细菌界的泛菌属[35]、克雷伯氏菌属[56]、链霉菌属[21]、芽孢杆菌属[47,55]、梭状芽孢杆菌属[54]、Chitinophaga属[65]、假单胞菌属[66]、肠杆菌属[67]共26 个产香属的微生物（部分无属分类），其中以酵母菌、霉菌以及芽孢杆菌的研究最多。多样性丰富的产香微生物不仅能直接用于生产，而且其代谢途径及相关基因可用于代谢工程以高效生产香气化合物，避免了毒性副产物的产生及大量污染物的排放[68-70]。

2 微生物产香气化合物的研究概况

目前，微生物发酵作为香气化合物的重要来源，资源广泛、环境友好而且产物具有天然属性，在食品行业有着巨大的应用潜力。

2.1 酯类香气化合物

作为水果和花卉中香味的主要来源，酯类香气化合物广泛应用于香精、香料、食品、化妆品等方面[71]。Zhang Zhongtian等[72]研究发现菌株Clostridium tyrobutyricumATCC 25755能产生具有水果香气的丁酸丁酯，在发酵过程中添加脂肪酶和丁醇可将丁酸丁酯产量提高60%。Kumar等[73]发现的一株芽孢杆菌Bacillus safensisDVL-43能产生耐有机溶剂的DVL-43脂肪酶，可产生具有特殊的果香的月桂酸乙酯。Gao Wenyuan等[74]用一种新型酯酶EST4构建了工程大肠杆菌EPI300™-T1R，以肉桂醇、香茅醇、香叶醇和异戊醇作为底物，获得了乙酸肉桂酯、醋酸香茅酯、乙酸香叶酯和乙酸异戊酯4 种香气化合物。邻氨基苯甲酸甲酯是一种有葡萄香味的酯类化合物，天然存在于葡萄、草莓、葡萄酒中。Luo Ziwei等[75]以葡萄糖作为唯一碳源，利用工程大肠杆菌ZWA4和工程谷氨酸棒杆菌YTM8分别产生4.47 g/L和5.74 g/L邻氨基苯甲酸甲酯，合成关键酶为邻氨基苯甲酸甲基转移酶1，该发现可以较大程度提高邻氨基苯甲酸甲酯产量，从而降低获得葡萄香味产品的成本。γ-十二内酯和γ-癸内酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，可以作为食品香料。Marella等[76]发现一种解脂耶氏酵母Y-63746（Yarrowia lipolyticaY-63746），其以非羟基化脂肪酸亚油酸为底物，利用脂肪酸水合酶合成了γ-十二内酯。Braga等[77]利用解脂耶氏酵母W29（Yarrowia lipolyticaW29）获得了γ-癸内酯，该过程与酰基辅酶A氧化酶密切相关。

2.2 醛类香气化合物

醛类香气化合物普遍存在于食物中并且对大多数香水的制作而言必不可少，常用作食品添加剂出现在酒类、软饮料及冰激凌中[78-80]。Chattopadhyay等[81]利用菌株Streptomyces sannanensis（MTCC 6637）将麦麸中的阿魏酸酯生物转化得到708 mg/L的香草醛。芳香醛作为香精、香料应用广泛，Kunjapur等[82]成功搭建了芳香醛生物合成的平台，利用醛酮还原酶、醇脱氢酶构建工程大肠杆菌K-12 MG1655产生芳香醛，该菌株合成的苯甲醛在24 h内向苯甲醇的转化率低于12%，大大提高了苯甲醛产量。Buchhaupt等[83]用大豆脂氧合酶和西瓜过氧化氢裂解酶基因构建了一种酿酒酵母工程菌BY.JG10-2B，其以亚麻酸为底物合成了大量3(Z)-己烯醛（60 mg/L）。香茅醛是香茅精油中重要的成分之一[84]，Zhang Baoyi等[85]利用基因工程改造获得了一株催化效率和立体选择性同时提高的酿酒酵母工程菌株——Y84V，其能将(E/Z)-柠檬醛完全转化为(R)-香茅醛。

2.3 醇类香气化合物

醇类香气化合物是一类常用的香料，通常具有花香、果香、叶香或木香特征。2-苯乙醇是一种芳香醇，具有蜂蜜和玫瑰香气，是玫瑰中最主要的花香化合物[86]。Braga等[87]将Yarrowia lipolyticapET-rrbdh菌株用于L-苯丙氨酸的生物转化生产2-苯乙醇，最终该菌株利用用4 g/LL-苯丙氨酸可生产2.2 g/L 2-苯乙醇。橙花醇（C10H18O）是一种无环单萜，是天然存在于植物精油中的一种香料成分。Zong Zhen等[88]在工程大肠杆菌LZ005中利用橙花醇合成酶对葡萄糖进行生物合成获得产量为1.564 mg/L的橙花醇。香叶醇是一种无环单萜醇，具有玫瑰花气息，可用于苹果、草莓等果香型、肉桂、生姜等香型的食用香精。Wang Xun等[89]利用香叶基二磷酸合酶和香叶醇合酶构建工程大肠杆菌TOP10，并利用该菌株获得了2.124 g/L的香叶醇。Chen Zhenya等[90]提出了一种利用工程大肠杆菌BW25113生产食品调味剂香草醇的人工途径。该途径从4-羟基苯甲酸开始，利用对羟基苯甲酸羟化酶、羧酸还原酶和咖啡酸盐O-甲基转移酶3 种异源酶对香草醇进行从头生物合成，使香草醇的产量变得可控。苯甲醇常见于茉莉和风信子的精油中。Pugh等[91]在工程大肠杆菌yqhD中设计非天然途径并利用多种内源性乙醇脱氢酶、醛酮还原酶探索了从葡萄糖生物合成苯甲醇，实现了高达114 mg/L的苯甲醇产量。

2.4 酮类香气化合物

酮类香气化合物在香料中的应用广泛，一般具有花香或果香，化学性质稳定，在香料工业中占有重要地位[92-93]。4-(4-羟基苯基)丁烷-2-酮，又称树莓酮，是树莓果实的主要香味成分，也可以作为食品添加剂。Yang Bo等[94]在工程大肠杆菌JM109中以4-羟基亚苄基丙酮为底物，表达树莓酮合成酶和葡萄糖脱氢酶获得转化率高达98%树莓酮。Nawrath等[65]发现菌株Bacterium ChitinophagaFx7914能合成食品级香料2-甲基四氢噻吩-3-酮。β-紫罗兰酮存在于许多花卉和水果中具有突出香味。López等[95]构建了可合成β-紫罗兰酮的酿酒酵母工程菌株JLS07，利用香叶基二磷酸合酶使β-紫罗兰酮浓度增加了8.5 倍。α-紫罗兰酮是覆盆子和黑莓中主要的香气化合物。Chen Xixian等[96]将突变的类胡萝卜素裂解双加氧酶1与番茄红素ε-环化酶进行融合表达，构建的工程大肠杆菌Bl21-Gold DE3可将α-紫罗兰酮的浓度提高2.5 倍以上。乙偶姻主要用于配制奶油、酸奶和草莓等香料，He Yuanzhi等[97]开发了一种含有3-丁二醇脱氢酶、NADH氧化酶和Vitreoscilla hemoglobin相关基因的工程大肠杆菌pET-rrbdh-nox-vg，在最佳条件下诱导催化2,3-丁二醇立体定向氧化获得质量浓度为72.38 g/L的(3S)-乙偶姻。

2.5 萜类香气化合物

萜类香气化合物是食品和化妆品工业不可缺少的天然香料[98]。柠檬烯是柑橘类精油中主要的单萜。Rolf等[99]将甘油作为柠檬烯合成的唯一碳源，利用含有甲戊酸途径和柠檬烯合成酶基因的工程大肠杆菌BL21（DE3）pJBEI-6410合成3.6 g/L柠檬烯。月桂烯是一种单萜类香料化合物，在云杉油、松节油、柠檬草油等中均存在，Kim等[100]以甘油作为碳源，通过引入异源甲戊酸途径、表达香叶二磷酸合酶及月桂烯合酶，利用工程大肠杆菌Ec-pM1/pGM(Qi)得到产量达58.19 mg/L的月桂烯。香桧烯是天然双环单萜，常被用作香料添加剂使用。Zhang Haibo等[101]利用甲基赤藓糖醇4-磷酸或异源甲羟戊酸构建生物合成途径，在工程大肠杆菌菌株BL21(DE3)中插入香桧烯合酶基因，经工艺优化使香桧烯的产量提高至82.18 mg/L。β-古巴烯是三环倍半萜烯，主要存在于烟草、茶叶及一些芳草中[102]，Mischko等[64]从担子菌Coniophora puteana中发现萜烯合酶被证明参与了倍半萜烯的合成并在工程大肠杆菌HMS174中表达，并得到215 mg/Lβ-古巴烯。

2.6 有机酸类香气化合物

部分有机酸类香气化合物可作为香料为食品带来清爽口感。对香豆酸常被用于制备香精香料[103]，Rodriguez等[104]开发了生产对香豆酸的工程酿酒酵母菌株CEN.PK102-5B，在该菌株中通过高效表达酪氨酸解氨酶、DAHP合成酶（ARO4K229L）、分支酸变位酶（ARO7G141S）和大肠杆菌莽草酸激酶II，最高可得到产量为1.937 g/L的对香豆酸。柠檬酸是一种弱有机酸，常作为酸化剂增强食品的风味和香气[105]。Yarrowia lipolyticaH222菌株是可以产柠檬酸的酵母菌，Abghari等[106]对该菌株进行基因改造，高表达乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A，发酵最高可产柠檬酸45 g/L。Mi Jia等[66]通过基因改造获得的重组工程菌Pseudomonas putidaDSM 12264在48 h内可产有机酸香料香叶酸193 mg/L。对羟基肉桂酸可用作调味剂,Vargas-Tah等[107]构建了含有编码分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因的工程大肠杆菌W3110，使对羟基肉桂酸的产量增加了8 倍。

2.7 其他香气化合物

吡嗪化合物在肉味香精、坚果香精及蔬菜香精中起着重要作用。2-乙基-3,5(3,6)-二甲基吡嗪（2-ethyl-3,5(6)-dimethylpyrazine，EDMP）具有烘焙可可或坚果的宜人香气，Zhang Huaizhi等[108]提出并证实了EDMP的生物合成途径，从白酒发酵中分离到一株产EDMP的枯草芽孢杆菌Nr.5（LAM 19024），研究表明该反应与L-苏氨酸脱氨酶、L-苏氨酸脱氢酶有关。当然，自然界丰富的微生物中是否存在其他结构新颖的香气化合物以及其安全性如何，仍然是一个值得深入研究的课题。

表1对微生物源香气化合物的研究进行了汇总。

表1 微生物产香气化合物研究概况Table 1 Overview of research on aroma compounds produced by microorganisms

3 利用微生物发酵提高香气化合物产量的探索与策略

产香气化合物的微生物普遍存在培养液中香气化合物含量低、缺乏适于发酵的工业菌株等问题。除了继续从自然界中筛选更好的原始菌株，对现有产生菌进行遗传改造及发酵工艺条件优化提高产量仍然是该方向研究的热点之一。

3.1 菌种改良

菌种改良主要是对微生物菌种进行基因改造以提高其应用潜力[109]。可通过增删编码基因或诱变等方式获得所需的独特菌株，将其用于香气化合物的生产。Wang Yuepeng等[110]将低双乙酰积累的Bacillussp.DL01-ΔalsD菌株与高温敏感穿梭质粒载体pKS1进行同源重组，删除了编码磷酸三酯酶的基因，使双乙酰产量增加了130%。Devanthi等[111]通过基因重组得到一种高耐盐性Z.rouxii突变体，其可在较短时间内大量合成乙酸乙酯。Binder等[112]将光诱导的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷应用于谷氨酸棒状杆菌的tac表达模块中，使瓦伦烯产量大幅度提升。此外，在诱变技术上，室温常压等离子体（atmospheric room temperature plasma，ARTP）介导的诱变技术已成为了菌种改良的新型诱变工具[113]，其可瞬间破坏DNA链，避免了对热敏微生物的潜在热损伤[114]。Li Yuncheng等[115]利用ARTP系统对产酯酵母进行诱变处理，最终使其总酯含量比野生型菌株高1.4 倍左右。此外，与香气化合物密切相关的阈值问题同样值得关注。例如，酸奶中的乙醛质量浓度低于8.0 mg/kg会使风味变弱，过高时又会产生涩味[116]。乙酸乙酯通常具有较低的气味阈值，有学者通过在酵母基因组中的相关代谢基因前后插入磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase，PGK1）基因启动子和终止子来修饰靶基因的表达强度，提升了乙酸乙酯滴度[117]。Darsonval等[118]将克隆的EstA2等相关基因在Oenococcus.oeni菌株中表达，使葡萄酒中合成的乙酸异丁酯低于阈值以达到较好风味。

原生质体融合也是菌种改良常见的手段，通过两个或两个以上不相容物种的快速组合，从而得到亲本菌株特征被改进后的新重组菌株以提高香气化合物的产量。Lin Lucheng等[119]将3 株酵母菌经两轮原生质体融合后得到融合菌株，发酵转化后得到的2-苯乙醇滴度高于亲本，达4.31 g/L。Xin Yi等[120]将菌株酵母菌株Et20和CTZ30通过原生质体融合产生酵母杂交种，其发酵产生的风味化合物总含量比原来高19.99%～26.55%。

针对传统方法突变随机和不定向性的缺点，近年来，使用现代基因工程技术对原生菌细胞进行定向改造的代谢工程渐成菌种改良的热点方向。通过增加前体供应、过度表达或提高瓶颈酶的效率、引入关键酶并优化表达、减少不需要的副产物或竞争途径的通量等手段提高产物滴定度或产量[121-122]。Chen Hefeng等[123]将瓦伦烯合酶引入酿酒酵母BJ5464，通过构建启动子-终止子对优化瓦伦烯合酶表达，提升了瓦伦烯的产量。异戊二烯是合成香料的重要中间体，有学者对工程异戊二烯生产菌株的关键酶IspG过表达，使异戊二烯产量增加30%，约为21 mg/L[124]。Lin Pocheng等[125]将香叶二磷酸合酶引入菌株SynechocystisPCC 6803，并对磷酸戊糖途径中5-磷酸核糖异构酶和核酮糖-5-磷酸3-二聚体酶基因过表达，最终将柠檬烯产量提高至6.7 mg/L。Furuya等[126]使用表达脱羧酶的大肠杆菌细胞将阿魏酸转化为4-乙烯基愈创木酚，再利用表达加氧酶的大肠杆菌细胞将其进一步转化为香兰素，滴度达到7.8 g/L。利用代谢工程进行合理菌株改良无疑是提高香气化合物产量的一个有前途的工具。

3.2 生产及发酵工艺的改进

发酵是通过微生物代谢获得各种初级、次级代谢产物的过程，具有成本低、能耗低、环境污染小等显著特点[127]。改进发酵工艺中条件参数、操作方式是生产高质量、高产量香气化合物的重要保障。Zhang Wenqing等[128]以酿酒谷物改进的Fuqu 培养基培养芽孢杆菌XJB-104，使得风味化合物四甲基吡嗪的前体乙炔产量提高至5.23 g/kg。Saeed等[67]在以石榴皮为底物的发酵中，使用Enterobacter属肠杆菌进行生物转化，对工艺参数进行优化后香兰素的产量达4.2 g/L。Nitta等[129]对菌株肠杆菌（Pantoea ananatis）IP04S/pBLAAaLINS-ispA采用“双阶段”补料分批发酵并优化条件，提高了(S)-芳樟醇的生产效率。Shi Wenke等[130]采用毕赤酵母F2-24与酿酒酵母顺序发酵，产生的葡萄酒酯类含量更高。Chen Li等[131]在反式二氢卡瓦酮的生产过程中，对发酵温度、搅拌速度、柠檬烯浓度等优化后，产量增加16 倍，达1 058 mg/L。Martínez等[132]以甘蔗渣为底物，接种菌株Kluyveromyces marxianu并提高还原糖的含量后香气化合物总量增加了70%。Czajka等[133]利用对甘油、缬氨酸和异亮氨酸进行优化后的酵母-氮碱培养基培养β-胡萝卜素菌株，最后生产的β-胡萝卜素（紫罗兰酮前体）滴度为1.26 g/L。Henke等[134]将十二烷改进的两相有机覆盖培养基用于广藿香醇生产的优化，将广霍香醇的滴度提高至60 mg/L。因此，除了获得最优良的菌株，通过发酵工艺的优化改进还可以控制生产成本、提质增效，是提升微生物产香气化合物最经济有效的方式。

4 结语

随着消费观念的改变和环保意识的增强，人们对于绿色香气化合物的需求不断增加。在可持续发展成为全球发展战略的今天，采用绿色技术从源头上消除或减轻污染，已经成为必然趋势。利用微生物细胞工厂生产香气化合物具有反应条件温和、产物可降解、香味纯正持久等明显优点，正在变成获取高质量、高附加值的香气化合物的重要途径，但由实验室层面转变为能产业化的生物技术存在着以下瓶颈[135-136]。1）寻找新的产香微生物仍然是未来需要关注的重点。微生物资源丰富，但目前进入生产研究的种类还较少，需要扩大筛选，挖掘更多的产香微生物。2）新微生物分离方法的应用。目前产香微生物多采用常规分离，新的微生物分离技术如原位培养等相关研究依然不足。3）寻找适宜产业化的菌株是当前阶段的重点问题。香气化合物作为次级代谢产物在野生菌株中浓度很低，如何充分利用基因工程、发酵工程等技术手段深入研究，加大与产业化对接仍然需要长期关注。4）微生物产香机制以及生物香气化合物在相关行业中的应用仍然需要持续探索。目前，用生物技术代替化学合成正在加速推进，相信更符合绿色化学时代潮流的微生物制备香气化合物将迎来美好的未来。