禽源耐碳青霉烯大肠杆菌耐药基因的鉴定及其耐药性分析

杜阳洋,王文静，文立华，杨俊，王红兵，王慧，杜丽飞，周望平※，刘俊琦※

（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131；2.湖南农业大学，湖南 长沙 410128）

抗生素的应用不仅是人类抵御病原微生物感染的常用手段，同时也在食品动物生产中为畜禽健康养殖及临床用药提供了重要保障。但是由于抗生素在动物临床治疗及畜禽养殖上的不规范及不合理使用，导致许多细菌的耐药性日益增强，特别是对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌，该耐药菌的出现会使碳青霉烯类抗生素失去药效，对公共卫生造成了严重威胁，已被世界卫生组织（WHO）列为极重要级别急需开发新型抗生素来应对的极为重要病原体之一[1-2]。

碳青霉烯类抗生素是临床上有效治疗多重革兰氏阴性菌感染的重要广谱抗生素之一[3]，但是2009年在印度新德里病人体内检测出了携带新德里金属β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase，NDM）的超级细菌[4-5]，编码该酶的基因blaNDM 已经在世界范围内广泛传播，国内外不少研究对其进行报道[6-8]。目前，替加环素和多黏菌素也是临床上针对碳青霉烯耐药菌感染的治疗药物[9-10]，然而，由于多黏菌素在临床上的用量增加，导致碳青霉烯和多黏菌素耐药菌株随之增多，这意味着一旦人体或动物机体出现该耐药菌感染，或将面临着无药可治的风险，超级细菌的出现对全球的健康发展构成了极大的障碍。尽管碳青霉烯类药物已经禁止在食品动物中应用，但是近年来仍在多个地区动物体内检测出含有碳青霉烯耐药肠杆菌（Carbapenems Resistance Enterobacteria，CRE）[11-12]。随着动物源CRE 的大量产生和高速传播，对人类公共卫生的健康发展构成了严重威胁。

目前NCBI 数据库已收录30 多种blaNDM 亚型，且具有向更强耐药性进化的趋势，主要流行blaNDM-1 和blaNDM-5 亚型[13-14]，且流行率呈上升趋势[15-18]，几乎突破了临床抗感染治疗的最后一道防线[19-20]。肠杆菌科细菌中的大肠杆菌被誉为“耐药基因的天然储存库”，拥有不断积累耐药基因的能力，因而具备传播耐药基因的可能性，使得临床治疗药物效果减弱。关于长沙地区禽源肠杆菌科细菌携带blaNDM 少有报道，本研究旨在通过调查分析长沙地区家禽屠宰场中大肠杆菌的耐药情况及耐药基因blaNDM-1 和blaNDM-5 的携带情况，为禽类耐药性调查和检测提供试验数据及依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

2023 年4 月随机采集湖南省长沙地区家禽屠宰场A 样本52 份和家禽屠宰场B 样本100 份。其中，用无菌棉棒从家禽屠宰场A 采集鸡粪便样本41 份，周围环境样本11 份；家禽屠宰场B 采集鸡粪便样本55 份，鸽粪便样本24 份及周围环境样本21 份。共计鸡粪便样本96 份、鸽粪便样本24 份及周围环境样本32 份。

1.2 主要试剂

Premix TapTM 购自宝日医生物技术（长沙）有限公司；Marker、琼脂糖均购自Biosharp，美罗培南购自麦克林；麦康凯琼脂购自杭州微生物试剂有限公司；琼脂粉、阿莫西林、噻孢霉素、替加环素、庆大霉素、氧氟沙星、头孢吡肟、氯霉素、林可霉素等药敏试验药物，均购自Solarbio。

1.3 细菌的培养与保存

将细菌接种于普通培养基，37 ℃下培养12～18 h，用含有30%甘油和液体培养基1∶1 混合存种，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.4 细菌的分离鉴定

将样本接种于含美罗培南1 μg/mL 的麦康凯琼脂培养基上，37 ℃孵化箱中培养18～24 h。挑选桃粉色或红色圆形的菌落，划线至普通培养基上进行富集培养后纯化。

1.5 耐药基因检测

对目的菌种采用PCR 扩增方法进行耐药基因检测，依据文献[24]设计并合成引物，引物序列见表1。PCR 反应体系为25 μL：Taq 酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，双蒸水8.5 μL；反应条件为：98 ℃10 s；55 ℃30 s、72 ℃1 min，30 循环。

表1 PCR 引物序列信息

表2 CRE 分离鉴定结果

表3 耐药基因检测结果

1.6 药敏试验

采用微量肉汤稀释法确定24 株大肠杆菌对8种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。所测试的抗菌药物包括：氧氟沙星（OFL）、头孢吡肟（FEP）、林可霉素（CD）、噻孢霉素（CF）、阿莫西林（AMX）、替加环素（TGC）、庆大霉素（GEN）、氯霉素（CPL）。耐药折点及相关操作遵循CLSI 指南，多重耐药（MDR）分离株被定义为对3 种以上抗生素具有耐药性。

2 结果

2.1 CRE 细菌的分离鉴定

采集的152 份样品中，一共分离到94 株CRE，包括禽源粪便样本78 份，环境样本16 份。屠宰场A 共21 份（检出率为40.4%），包括鸡粪便样本18份，环境样本3 份；屠宰场B 共73 份（检出率为73%），包括鸡粪便样本46 份，鸽粪便样本14 份，其他环境样本13 份。

2.2 CRE 中NDM 耐药基因检测结果

94 株CRE 中共检测出携带NDM 阳性基因的菌株24 株，blaNDM-1 为主要流行亚型，检出率为66.7%（n=16），其余8 株为携带blaNDM-5 基因。16株blaNDM-1 基因包括7 株鸡粪便样本（屠宰场A 2 株，屠宰场5 株）、3 株鸽粪样本和6 株环境样本（屠宰场A 1 株，屠宰场B 5 株），而8 株携带blaNDM-5 基因中有5 株来源于鸡粪便样本（屠宰场A 2 株，屠宰场B 3 株），其余3 株均来自于屠宰场B 环境样本中，未从鸽粪便及屠宰场A 周边环境样本中检测出blaNDM-5 基因。

2.3 药敏试验

药敏试验结果显示（图1），83.3%（n=20）的菌株对阿莫西林的耐药,对其他抗生素的耐药率分别为林可霉素（70.8%，n=17）、氯霉素（37.5%,n=9）、氧氟沙星（12.5%，n=3）、头孢吡肟（8.3%,n=2）、噻孢霉素（37.5%,n=9）、替加环素（4.2%,n=1）、庆大霉素（33.3%,n=8）。100%（n=24）的菌株至少对1 种抗生素耐药，79.2%（n=19）的菌株对至少2 种抗菌药物耐药，50%（n=12）的菌株对至少3 种抗菌药物耐药，表现为多重耐药（MDR），甚至出现3 株对6 种抗菌药物耐药，1 株对7 种抗菌药物耐药。

图1 禽源大肠杆菌对8 种抗菌药物的耐药率

3 讨论

自从抗生素应用于养殖业以来，对动物临床防治和健康养殖，乃至对我国农业发展的确是一大福音，但是由于多企业不规范使用、滥用抗生素导致细菌耐药性的产生和传播，造成多重耐药普遍化。对整个社会来说，这无疑是一大安全威胁，已成为全行业需要面对且较为棘手的问题。本试验对24株CRE 进行8 种抗菌药物的药敏试验，结果显示，试验菌株对阿莫西林的耐药率高达83.3%，8 种抗菌药物均出现耐药菌株，100%菌株出现多重耐药现象。替加环素作为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的特效药也出现了1 株耐药菌，表明长沙地区禽源大肠杆菌耐药很严重。而这些耐药基因的绝大部分宿主是被称为“耐药基因的天然储存库”的大肠杆菌，其具备不断累积耐药基因的能力，会加快耐药基因的传播，导致人用和兽用药物效果减弱甚至失效。

本试验对湖南长沙地区2 个家禽屠宰场随机采样，共收集样本152 份，包括禽粪便以及环境中的水源、食物、地面的样品采集，结果显示，CRE 检出率为61.8%（n=94），A 场、B 场的CRE 检出率分别为40.4%、73%，说明B 场的大肠杆菌耐碳青霉烯更为严重。这可能是由于屠宰场B 养殖管理不规范，较封闭的空间导致群体动物感染性疾病的流行，造成耐药基因传播导致。值得注意的是，在屠宰场A 和屠宰场B 中的禽源粪便及其周边环境中均检测出携带blaNDM 耐药基因的菌株，提示动物与环境之间存在相互传播，且有进一步传染到人体的可能性，对人类公共卫生产生严重影响。这与国内研究blaNDM 耐药基因的流行研究观点一致[21]。因此，各类屠宰场应该制定并完善管理条例并严格执行，设立病畜隔离间及急宰间，做好动物的健康监测，正确处理排放废水或污水，做好环境保障工作。

在鸽粪便样品中未检测出携带blaNDM-5 耐药基因，检测出的3 株阳性基因均为blaNDM-1耐药基因，说明CRE 在长沙地区部分鸽群中的传播较鸡群更为保守，暂未出现变异体。本试验中禽源CRE 中携带blaNDM 耐药基因主要以blaNDM-1（检出率为66.7%）为主，这与王警等人研究江苏某奶牛场中blaNDM 流行情况一致[21]，但与王可等人研究山东青岛地区鸡源blaNDM 流行情况有所不同[22]。可见不同地区、不同物种中同一种属细菌耐药基因流行情况也存在一定差异，这可能与不同地区禽类养殖的用药习惯、饲养管理的不同相关。

碳青霉烯类抗菌药物在人医临床治疗中广泛应用使耐药基因快速传播，即使该类药物已禁止用于动物养殖与临床治疗中，但是相关耐药基因仍可以通过苍蝇等环境媒介进入养殖场[23]，携带耐药基因的动物粪便也可相互传播，甚至污染水源、环境，通过食物链传播到人类中，导致其在动物和人类中流行传播。blaNDM 的出现与传播引起社会人医和兽医界的广泛关注，其所导致的使碳青霉烯类抗生素药效失效的结果可能会导致人类和动物出现相关疾病陷入无药可治的境地。耐药菌株的不断出现对公共卫生安全和养殖业的健康发展带来的恶性影响越来越严重，足以引起我们的重视。