高效液相色谱法同时测定酱油中7种防腐剂

黄程 王婷婷

摘 要：以酱油为原料，建立了一种可以同时测定酱油中7种常见防腐剂的高效液相色谱分析方法。样品经甲醇超声提取，离心过滤后采用Acclaim120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱分离，乙腈

-0.02 mol·L-1乙酸铵梯度洗脱，高效液相色谱定量分析。结果表明，7种防腐剂在0.2～100.0 μg·mL-1线性关系良好，相关系数R2＞0.998，检出限、定量限分别为0.063～2.000 mg·kg-1、0.209～6.667 mg·kg-1，加标回收率为96.05%～114.17%，相对标准偏差为0.02% ～ 4.02%（n=6）。本方法操作简便、灵敏可靠，适用于酱油中多种防腐剂的检测。

关键词：高效液相色谱；酱油；防腐剂；检测

Simultaneous Determination of Seven Preservatives in Soy Sauce by the High Performance Liquid Chromatography

HUANG Cheng， WANG Tingting

（College of Food Science and Technology， Wuhan Business University， Wuhan 430056， China）

Abstract： A method for simultaneous determination of 7 preservatives by high performance liquid chromatography in soy sauce was established. The samples were ultrasonically extracted by methanol. And after being centrifuged and filtered， the filtrate was subsequently separated by Acclaim120 C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm） column. Gradient elution was performed on acetonitrile-0.02 mol·L-1 ammonium acetate solution， and quantitative analysis was performed by high performance liquid chromatography. The results showed that the seven preservatives had good linear correlation in the range of 0.2～100.0 μg·mL-1， which correlation coefficient R2＞0.998. The limits of detection of the seven preservatives were 0.063～2.000 mg·kg-1， while the limits of quantitation were 0.209～

6.667 mg·kg-1. The average recoveries of this method were 96.05%～114.17%， and the relative standard deviations were 0.02% ～ 4.02% （n=6）. This method is simple， sensitive and reliable， and its suitable for the determination of several preservatives in soy sauce.

Keywords： high performance liquid chromatography; soy sauce; preservatives; determination

防腐劑能抑制微生物活动，防止食品腐败变质，是一类十分重要的食品添加剂[1]。苯甲酸因其价格低廉，在我国食品生产中使用较为普遍[2]。山梨酸由于防腐效果稳定，且与一般食品中的成分不发生作用，不会对食品风味产生不良影响，所以在食品工业中应用较为广泛[3]。纳他霉素能抑制酵母和霉菌生长，对于容易被霉菌污染的食品具有良好的防霉效果[4]。对羟基苯甲酸酯类防腐剂主要用于食品、动物饲料以及化妆品中杀菌防腐，具有优良的生物降解性能[5]。

防腐剂可以延长食品的保质期，但长时间过量使用可能会对人体健康产生不良影响。研究发现，苯甲酸钠多次给药对大鼠肝肾有一定的损害[6-8]；人体过量摄入苯甲酸、山梨酸等食品添加剂，可能对人体外周血淋巴细胞产生细胞毒性和遗传毒性[9]；对羟基苯甲酸酯类具有雌激素活性，可能会对消费者的健康产生一定的影响[10-11]，我国已禁止在食品中使用羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯。因此，加强食品防腐剂的监测对保证食品安全具有重要意义。

目前，检测食品中防腐剂的方法有液相色谱法[12-13]、液相色谱-质谱联用法[14-16]、气相色谱法[17-18]和气相色谱-质谱联用法[19-21]等。相较于气相色谱或气质联用方法，液相色谱方法的适用性更为广泛，前处理更为简单，大多不需要经过复杂的萃取、衍生化等步骤，是目前较为常用的检测方法。根据我国现行有效的检测方法，苯甲酸、山梨酸、纳他霉素主要采用液相色谱法[22-23]，对羟基苯甲酸酯类则采用气相色谱法检测[24]。对同一样品，同时测定这7种防腐剂，需要分开进行，检测效率低，且食品生产过程中涉及的原料、基质复杂多变，添加的防腐剂种类也较多，因此建立一种同时测定多种防腐剂的方法对其质量控制和保障食品安全具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苯甲酸（99.66%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）、山梨酸（99.18%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）、纳他霉素（1 000 mg·L-1，上海安谱璀世标准技术服务有限公司）、4种对羟基苯甲酸酯类（1 000 mg·L-1，上海安谱璀世标准技术服务有限公司）。甲醇（色谱级，德国默克股份两合公司）、乙腈（色谱级，德国默克股份两合公司）、乙酸铵（优级纯，天津市大茂化学试剂厂）、氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、亚铁氰化钾（分析纯，天津市百世化工有限公司）、乙酸锌（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、乙酸（分析纯，上海沃凯生物技术有限公司）、蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。酱油购于本地超市。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪：美国Waters公司；TGL-205离心机：湖南平凡科技有限公司；QL-861涡旋振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；KQ-250B型超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；FA204电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液制备

分别称取适量的苯甲酸、山梨酸用甲醇溶解，配制成浓度为2.0 mg·mL-1的苯甲酸、山梨酸标准储备液。取配制好的苯甲酸、山梨酸标准储备液与纳他霉素、4种对羟基苯甲酸酯类标准溶液适量，用甲醇逐级稀释成浓度为0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、

1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1系列混合标准溶液。

1.3.2 样品前处理

准确称取2 g酱油样品于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇，涡旋混合均匀，超声提取15 min后，10 000 r·min-1离心5 min，上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，待用。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Acclaim 120 C18色谱柱（4.6 mm×

250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）+0.02 mol·L-1乙酸铵溶液（B）；梯度洗脱：0～10 min，12%A；11～20 min，20%A；21～35 min，35%A；36～45 min，40%A；46～55 min，45%A；56～65 min，12%A；流速：1 mL·min-1；柱温：35.0 ℃；进样量：10 μL；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：230 nm。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

本文分别比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-

0.02 mol·L-1乙酸铵和乙腈-0.02 mol·L-1乙酸铵4种不同流动相体系对7种目标化合物的分离度及峰型的影响，并调整有机相与水相的比例以达到最佳分离效果。结果显示，以甲醇-水、乙腈-水进行洗脱时，羟基苯甲酸酯类无法完全分离，分离度较差。以甲醇-0.02 mol·L-1乙酸铵为流动相洗脱时，由于流动相中含有盐类物质，甲醇比例升高到一定程度后会导致色谱柱压力过高，无法进行后续的实验。综合考虑，本实验最终选择了乙腈-0.02 mol·L-1乙酸铵溶液作为流动相进行梯度洗脱。在该条件下，7种防腐剂可完全分离，色谱图见图1。

2.2 提取溶剂的选择

为了减少样品中蛋白质等杂质的影响，根据文献报道[12，14，25-26]及国标方法[23]，本实验分别考察甲醇、乙腈、饱和氯化钠-乙腈3种不同提取溶剂对7种防腐剂的提取效果。准确称取9份空白酱油样品，每份2 g，置于50 mL的离心管中，分成3组，每组3个平行。向空白样品中添加100 μg 7种防腐剂混合标准溶液，按照1.3.2方法进行处理。其中，饱和氯化钠-乙腈作为提取溶剂时，先加入5 mL饱和氯化钠溶液，涡旋混匀后，再加入20 mL乙腈超声提取。结果显示，甲醇和乙腈作为提取溶剂时，均有不溶性沉淀产生；饱和氯化钠-乙腈作为提取溶剂时，样品中大部分物质溶解在饱和氯化钠溶液中，乙腈层较为清澈；3种提取方式均可在一定程度上达到去除杂质的效果。比较3种提取溶剂的回收率可知（表1），3种提取溶剂对4种對羟基苯甲酸酯类的提取效果均较好，回收率可达101.8%～114.7%。但乙腈、饱和氯化钠-乙腈作为提取溶剂时，苯甲酸、山梨酸平均回收率较低，提取效果较差，这可能与苯甲酸、山梨酸微溶于水，导致部分滞留在水相中有关；且两种提取方式中，杂质峰对苯甲酸均存在干扰，无法完全分离。饱和氯化钠-乙腈作为提取溶剂时，苯甲酸几乎被杂质峰完全掩盖，无法获取峰面积信号。而甲醇作为提提溶剂时，色谱图中杂质峰相对较少，7种目标物质均不受杂质峰的干扰，且都有较高的回收率，平均回收率在104.9%～114.5%。故选定甲醇作为提取溶剂。

2.3 线性范围及检出限

取1.3.1配制好的防腐剂的系列混合标准溶液，按1.3.3色谱条件进行分析。以峰面积为纵坐标，质量浓度（μg·mL-1）为横坐标，绘制7种防腐剂的标准曲线。根据信噪比（S/N）=3计算检出限，信噪比（S/N）=10计算定量限[27]。结果表明，7种防腐剂在0.2～100.0 μg·mL-1线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.998。检出限为0.063～2.000 mg·kg-1，定量限为0.209～6.667 mg·kg-1，详见表2。

2.4 加标回收率及精密度

准确称取18份空白酱油样品，每份约2 g，分别添加（20 μg）、中（40 μg）、高（100 μg）3个水平的7种防腐剂混合标准溶液，按照1.3.2的处理方法进行加标回收试验，每个水平进行6次平行实验，各组分的回收率和相对标准偏差结果见表3。由表3可知，7种目标化合物的平均回收率为96.05%～114.17%，RSD为0.02%～4.02%，方法的回收率和精密度良好，可作为酱油中7种防腐剂的检测方法。

2.5 实际样品测定

采用本实验方法分别对5批酱油样品进行处理，测定7种防腐剂的含量，结果如表4所示。5批次样品中苯甲酸含量为0.471～0.856 g·kg-1，山梨酸含量为0.199～0.645 g·kg-1，均符合《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定。

3 结论

本文建立了一种高效液相色谱同时测定酱油中7种防腐剂的分析方法。该方法操作方便、简单易行、准确度和精密度较高，能够满足酱油中多种防腐剂的检测需要，可为防腐剂的检测和使用监管提供参考。

参考文献

[1]余春平，许春芳.食品防腐剂的应用及发展建议[J].江苏调味副食品，2022（4）：7-9.

[2]王思文，巩江，高昂，等.防腐剂苯甲酸钠的药理及毒理学研究[J].安徽农业科学，2010，38（30）：16724.

[3]丁文慧，陆利霞，熊晓辉.提高山梨酸及钾盐防腐效果的研究进展[J].食品工业科技，2012，33（3）：410-412.

[4]陈方圆，戴久竣，徐家延，等.纳他霉素抑菌机制及在食品保鲜中的应用研究进展[J].食品科技，2021，46（9）：47-51.

[5]张靖.高效液相色谱法检测食品中对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯的方法优化[D].广州：仲恺农业工程学院，2017.

[6]李锦玉，李荣欣，李京路，等.苯甲酸钠多次给药对大鼠肝肾功能的影响[J].郑州大学学报（医学版），2015，50（1）：134-138.

[7]朱沁玲，余蓓，蒲玟静，等.食品防腐剂苯甲酸钠多次给药对雌性大鼠肝脏、肾脏及卵巢毒性的研究[J].广东医学，2018，39（3）：355-358.

[8]李姝.常用防腐剂对大鼠肝脏脂质过氧化的影响[J].现代预防医学，2010，37（4）：718-721.

[9]BOGAR F，TUYLU B A.Determination of genotoxic effects of some food additives with the help of CBMN technique[J].Fresenius Environmental Bulletin，2019，28（9）：6601-6611.

[10]JANJUA N R，MORTENSEN G K，ANDERSSON A M，et al.Systemic uptake of diethyl phthalate，dibutyl phthalate，and butyl paraben following whole-body topical application and reproductive and thyroid hormone levels in humans[J].Environmental Science & Technology，2007，41（15）：5564-5570.

[11]葛均輝，常兵.对羟基苯甲酸酯类物质的雌激素活性[J].卫生研究，2006（5）：650-652.

[12]凌云，储晓刚，张峰，等.超高效液相色谱法测定食品中的多种防腐剂[J].中国卫生检验杂志，2012，22（2）：198-200.

[13]马晓年，陈俊秀，农蕊瑜，等.高效液相色谱法测定牛奶中3种防腐剂[J].中国乳品工业，2022，50（3）：58-61.

[14]魏宇涛，温泉，唐维英，等.UPLC-MS/MS法同时测定蛋白饮料和液体调味品中36种防腐剂[J/OL].食品与发酵工业：1-12[2023-08-12].https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034884.

[15]汤丽昌，陈高健，梁国华.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食醋、酱油及料酒中的13种甜味剂和防腐剂[J].食品安全质量检测学报，2021，12（6）：2181-2188.

[16]赵灵芝，黄笑晨，花中霞，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定酒中6种对羟基苯甲酸酯类防腐剂[J].食品研究与开发，2019，40（15）：147-151.

[17]刘家阳.固相萃取净化-气相色谱法测定酱腌菜中4种对羟基苯甲酸酯类防腐剂[J].中国卫生检验杂志，2018，28（15）：1825-1826.

[18]侯瑞霞，吴青.气相色谱法同时测定食品中11种防腐剂[J].中国卫生检验杂志，2011，21（4）：865-867.

[19]刘志鹏，黄敏兴，林继钦，等.分散固相萃取-气相色谱-三重四极杆串联质谱法同时测定沙拉酱中3种防腐剂[J].中国酿造，2022，41（11）：245-249.

[20]钟丽君，王蕊，刘莉，等.固相支持液液萃取-气相色谱质谱法测定酱油和醋中对羟基苯甲酸酯类防腐剂[J].食品科技，2022，47（5）：304-308.

[21]郝鹏飞，徐琴，牟志春，等.气相色谱-质谱法同时测定葡萄酒中13种防腐剂[J].分析试验室，2013，32（7）：

108-112.

[22]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定：GB 5009.28—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[23]国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中纳他霉素的测定：GB 5009.286—2022[S].北京：中国标准出版社，2022.

[24]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定：

GB 5009.31—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[25]汪隽.高效液相色谱-质谱联用分析食品及化妆品中的防腐剂[D].成都：成都理工大学，2008.

[26]张小芳，付大友.高效液相色谱法同时测定食醋和酱油中的6种防腐剂和甜味剂[J].中国调味品，2018，43（9）：147-150.

[27]TIGHRINE A，AMIR Y，ALFARO P，et al.Simultaneous extraction and analysis of preservatives and artificial sweeteners in juices by saltin-g out liquid-liquid extraction method prior to ultra-high performance liquid chromatography[J].Food Chemistry，2019，277：586-594.