高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物的含量

黄昌兴

摘 要：建立了高效液相色谱-荧光法测定水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的方法。样品经乙腈超声提取、硼氢化钾还原、离心、旋转蒸发及中性氧化铝柱净化后，经微孔滤膜过滤，滤液经液相色谱柱分离，熒光检测器检测，外标法定量。结果表明，孔雀石绿和隐色孔雀石绿在1.0～20.0 μg·mL-1均具有很好的线性关系，相关系数≥0.999 8，检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为1.5 μg·kg-1，加标回收率为88.1%～96.6%，RSD为0.9%～3.8%。

关键词：孔雀石绿；水产品；液相色谱；荧光法

Determination of Malachite Green and Its Metabolites in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography

HUANG Changxing

（Shantou Inspection and Testing Center， Shantou 515041， China）

Abstract： A method for the determination of malachite green and leucomalachite green in aquatic products by high performance liquid chromatography with fluorescence detection was established. After ultrasonic extraction with acetonitrile， reduction with potassium borohydride， centrifugation， rotary evaporation， purification with neutral aluminum oxide column， the sample is filtered by microporous membrane， and the filtrate is separated by liquid chromatography column， detected by fluorescence detector， and quantified by external standard method. The results showed that malachite green and leucomalachite green showed good linearity in the range of 1.0～20.0 μg·mL-1 with the correlation coefficients ≥0.999 8， the limits of detection of 0.5 μg·kg-1 and the limits of quantification of

1.5 μg·kg-1， and the recoveries of spiked standards ranged from 88.1% to 96.6% with the RSD of 0.9%～3.8%.

Keywords： malachite green; aquatic products; liquid chromatography; fluorimetry

孔雀石绿（Malachite Green，MG），别名孔雀绿、孔雀绿草酸盐、碱性绿、草酸孔雀石绿等，是人工合成的一种三苯甲烷类化学物，可杀真菌、细菌、寄生虫，因其对养殖水域中的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病和寄生虫病等具有良好的疗效，被作为杀菌剂在水产养殖业广泛使用[1-2]。孔雀石绿在鱼体内代谢为隐色孔雀石绿（Leucomalachite Green，LMG），其毒性强于母体孔雀石绿，有强烈的致畸胎、致突变、致癌作用。2002年原农业部颁布的《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》已明文规定孔雀石绿禁止用于所有食品动物。

水产品是汕头当地居民经常食用的食品，水产品养殖更是当地的传统海洋产业之一。因此强化水产品质量安全对于保障消费者生命健康、促进水产品养殖业繁荣发展均具有重要意义。目前，MG及其代谢物LMG的检测方法主要包括分光光度法、酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、液质联用法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometer，LC-MS）等[3-5]，其中HPLC因检测成本低、仪器普及率高而被基层检测机构广泛采用。本文建立了高效液相色谱-荧光法检测水产品中MG及其代谢物LMG的方法，以期简化样品前处理过程，提高基层检测机构的检测效率和准确度。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1200型液相色谱-荧光检测器：美国Agilent安捷伦公司；HX-4型均质器：山东欧莱博医疗器械有限公司；TG16G型离心机：常州市亿能实验仪器厂；VOKTEX型涡旋混匀器：海门市贝尔仪器制造有限公司；SN-RE-201D型旋转蒸发仪：上海尚仪仪器设备有限公司；固相萃取装置：德国CNW公司；PRS固相萃取柱：500 mg/3 mL；中性氧化铝固相萃取柱：1 g/3 mL。

孔雀石绿和隐色孔雀石绿，纯度≥98%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈：均为色谱纯；盐酸羟胺、乙酸、对甲苯磺酸、二甘醇和硼氢化钾，均为分析纯；实验用水为去离子水。

1.2 标准溶液的配制

准确称取适量的MG或LMG标准品，用适量甲醇溶解并定容，配制成浓度为100 mg·L-1的标准溶液，4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

水产品去鳞、去骨、去皮，沿着背脊取可食用部分，粉碎；准确称取样品5.0 g（精度0.1 mg）于

50 mL离心管内，依次加入0.1 mol·L-1乙酸铵缓冲液

5.0 mL、20%盐酸羟胺1.5 mL、1.0 mol·L-1对甲苯磺酸2.5 mL，用匀质机以10 000 r·min-1的速度均质30 s，加入10 mL乙腈涡旋振荡60 s；加入酸性氧化铝10 g，涡旋振荡30 s，6 000 r·min-1离心5 min；上清液中加入二甘醇10 mL、乙腈10 mL，涡旋振荡30 s，6 000 r·min-1离心5 min；上清液加入1 mL硼氢化钾、15 mL二氯甲烷，涡旋振荡30 s，6 000 r·min-1离心5 min，收集下层二氯甲烷溶液；残渣中加入10 mL二氯甲烷重复提取一次，合并二氯甲烷溶液；45 ℃水浴下氮吹浓缩至近干，用5 mL乙腈充分溶解残渣，待净化。

1.3.2 净化

将中性氧化铝固相萃取柱与PRS固相萃取柱连接，PRS固相萃取柱安装在固相萃取装置上，用

5 mL乙腈活化萃取柱后，将待净化样品溶液转移至中性氧化铝SPE小柱中净化，弃去流出液；依次加入2 mL初始流动相、1 mL盐酸羟胺甲醇溶液洗脱PRS柱，洗脱液经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：Silversil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-5 mmol·L-1乙酸铵溶液（82∶18）；进样量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；激发波长：265 nm；发射波长：360 nm。

2 结果与分析

2.1 实验条件优化

2.1.1 提取与净化

结合MG和LMG的理化性质，比较了乙酸钠缓冲溶液、乙腈、甲醇、二氯甲烷等有机溶剂对水产品中MG和LMG的萃取效率；比较了酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝对水产品中MG和LMG的净化效果。结果表明，乙腈对MG和LMG具有良好的萃取效率，加标回收率在93.4%～97.8%；碱性和酸性氧化铝会吸附目标化合物而降低萃取率，而中性氧化铝固相萃取柱净化，可有效去除提取液中酸性杂质，消除水产品中油脂和基体的干扰，净化效果好，基质干扰小，可有效保护色谱柱和检测器。

2.1.2 流动相的选择

比较了甲醇-乙酸铵溶液、乙腈-乙酸铵溶液、四丁基溴化钠-乙腈或甲醇等不同流动相种类或比例对MG及其代谢物LMG的色谱分离效果。结果显示，以乙腈-乙酸铵水溶液作为流动相时，MG和LMG可获得更好的分离效果，且响应信号强，这可能是由于MG及LMG易于在乙腈中溶解，且乙酸铵作为缓冲溶液可提供合适的pH，从而促进其生成正离子；当乙酸铵浓度为5 mmol·L-1时，MG及其代谢物LMG可有效分离，峰形尖锐且对称，出峰时间适中且相对稳定，基线稳定且基质干扰少，色谱图见图1。

2.2 线性关系及检出限

配制MG和LMG質量浓度为0 μg·mL-1、

1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1的混合标准溶液，按本文建立的HPLC法进行测定，以MG和LMG响应值为纵坐标，以MG和LMG质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果显示，在1.0～20.0 μg·mL-1浓度范围内，GM的线性关系方程为y=0.315 7x+0.032 25，相关系数r为0.999 8；LGM的线性关系方程为y=

0.421 3x+0.024 86，相关系数r为0.999 9，这表明MG和LMG均具有很好的线性关系。

在空白水产品样品中添加浓度为0.1 μg·kg-1、

0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、1.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1的系列标准溶液进行测定，以3倍信噪比（S/N）作为方法检出限，10倍信噪比为方法定量限。结果显示，该方法MG和LMG的检出限为

0.5 μg·kg-1，定量限为1.5 μg·kg-1。

2.3 方法回收率和精密度

分别对秋刀鱼、对虾和螃蟹空白样品进行MG和LMG低、中、高3个水平的加标回收实验，按本文建立的检测方法进行测定，回收率和精密度（RSD）见表1。结果显示，MG和LMG在3个加标水平下的平均回收率为88.1%～96.6%，RSD为0.9%～3.8%，表明本方法具有较好的准确度和精密度。

2.4 实际样品检测

采用本方法对市售的对虾、螃蟹、鲫鱼等10份水产品逐个进行MG和LMG含量检测，均未检出MG和LMG残留，说明所检10份水产品在养殖过程中均未使用孔雀石绿药物。

3 结论

本文建立了水产品中MG和LMG的高效液相色谱-荧光法测定方法。水产品经乙腈超声提取及中性氧化铝柱净化后，用液相色谱-荧光检测器检测。结果表明，MG和LMG在1.0～20.0 μg·mL-1浓度范围内，均具有很好的线性关系，相关系数≥0.999 8；检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为1.5 μg·kg-1；加标回收率为88.1%～96.6%，RSD为0.9%～3.8%。该方法具有较好的准确度和精密度，可满足水产品中MG和LMG含量测定。

参考文献

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