添加罗汉果甜苷对火龙果酒香气特征的影响

谢林君，成 果，韦 璐，连建华，王海军，何 洁，庞丽婷，张 劲*

（1.广西壮族自治区农业科学院 葡萄与葡萄酒研究所，广西 南宁 530007；2.广西农业职业技术大学 食品药品研究院，广西 南宁 530007；3.广西容富和农业发展有限公司，广西 南宁 530200；4.广西壮族自治区农业科学院 农产品质量安全与检测技术研究所，广西 南宁 530007）

火龙果（Hylocereus undatus）是热带和亚热带水果，在我国广西、海南、广东等地区广泛种植，因其奇特的外形、艳丽的颜色及独特的风味深受消费者喜爱。火龙果以鲜食为主，由于果实含水量高，且采后呼吸代谢旺盛，易萎蔫腐烂等，不耐贮运，常因集中采摘销售不佳导致大量腐烂变质[1-3]。果实可加工果酒、果醋、果汁、果脯等产品[4]，红肉火龙果加工而成的低度发酵果酒近年来在市场上大受欢迎。

发酵果酒多以甜型或甜味为主，生产中为了获得愉悦的甜味口感，常用蔗糖进行调配。随着人们对健康饮食意识的提升，除了注重果酒本身的口感外，人们也关注蔗糖的摄入对健康的影响。过量的蔗糖摄入会诱发如糖尿病、肥胖症等疾病，罗汉果甜苷作为天然代糖应用于食品的加工，具有含糖量少、热量低、健康等优点，易被各类人群尤其是糖尿病人所接受[5-6]。罗汉果甜苷（mogrosides）主要存在于罗汉果的果实中，属于三萜糖苷，纯品甜度约为蔗糖的300倍，热量仅为蔗糖的2%，是一种理想的天然代糖。在我国罗汉果甜苷已经在国标GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》被允许作为食品添加剂在各类食品中按生产需要使用，应用越来越广泛[7-8]。目前市场上已有罗汉果复配型酒[9]及罗汉果白酒调味液[10]等产品，同时罗汉果甜苷也广泛应用于饮料[11]及牛奶[12]、酸奶[13]等产品的加工中。

香气特征是果酒感官品质的重要评价指标之一，果酒香气来源为果香、发酵香和陈酿香，产品香气特征的形成是复杂的过程。殷俊伟等[14]定性了火龙果酒中34种挥发性物质，酯类、酸类及醇类物质相对含量较高。李凯等[15]对比了自制与市售红心火龙果酒中特征香气物质的差异，自制火龙果酒的果香较浓郁。刘枭雄[13]研究发现，罗汉果甜苷酸奶的挥发性风味物质种类总数比蔗糖酸奶多，两者在酸类物质上差异较大，表明罗汉果甜苷添加能影响香气的变化。天然代糖罗汉果甜苷应用于果酒调配对产品香气特征产生的影响鲜见研究报道，其为天然产物，不产生热量，对人体健康有益，且罗汉果甜苷不是微生物的碳源来源，作为代糖替代蔗糖应用于果酒中，产品可以不用灭菌，减少生产工序，能更大程度保持产品风味。本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）和电子鼻分析代糖罗汉果甜苷和蔗糖调配的2种发酵火龙果酒中挥发性成分，结合香气活性值（odor activity value，OAV）及香气轮廓法，鉴定火龙果酒关键香气物质及特征香气物质，为代糖应用于果酒生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红肉火龙果：广西佳年农业有限公司；蔗糖：南宁糖业公司明阳糖厂；罗汉果甜苷（5倍甜度）：桂林实力科技有限公司；DELTA酵母、混合下胶剂POLYMUST PRESS（主要有效成分为交联聚乙烯吡咯烷酮、膨润土、植物蛋白）：法国Laffort公司；2-甲基-3-庚酮（色谱纯）：美国Aldrich公司；正构烷烃混标（C6～C26）（均为色谱纯）：美国Supelco公司。

1.2 仪器与设备

PAL-1手持折光仪：日本Atago公司；PHS-3C型pH计：上海雷磁仪器厂；固相微萃取手柄、75 μm CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司；SCION SQ 456GC-MS气相色谱-质谱联用仪：美国Bruker公司；DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司；PEN3.5电子鼻：德国Airsense公司。

1.3 试验方法

1.3.1 火龙果酒酿造工艺

操作要点：

火龙果去皮破碎：选择成熟、无病虫害的新鲜火龙果，去皮破碎后入发酵罐，测定果浆理化指标，重复3次。

酶解：按火龙果果浆质量5 g/100 kg添加果胶酶。

发酵：按200 mg/L接入法国酵母DELTA，按115 g/L的量进行补糖，启动酒精发酵，温度控制在20～22 ℃。每隔5 d测定发酵酒液pH及可滴定酸，重复3次。同时每天测定发酵酒液比重和残留还原糖，直到残糖＜4 g/L，发酵结束。酒精发酵结束后进行倒罐，除去底部酒泥，进入后发酵阶段（20 ℃，1个月），进行一次倒罐，得到火龙果酒基酒。

火龙果酒调配：分别添加罗汉果甜苷（10 g/L）、蔗糖（50 g/L）进行火龙果酒甜味调配，得到2种甜味发酵型火龙果酒（编号分别为MOG、SUC），其中，SUC为对照。

冷处理：调配结束入冷冻罐中进行冷处理（2～5 ℃，15 d），同时添加40 mg/L混合下胶剂进行下胶处理。

灌装：MOG直接装瓶密封进入瓶储阶段；SUC装瓶后进行巴氏灭菌（70 ℃，20 min）后密封进入瓶储阶段。

瓶储：于20 ℃瓶储6个月，即得火龙果酒。

1.3.2 理化指标测定

可溶性固形物含量：采用PAL-1型手持折光仪测定；还原糖含量：采用斐林滴定法测定；pH值：采用pH计测定；可滴定酸含量：采用碱溶液滴定法测定（以柠檬酸计）。火龙果酒酒精度：按GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》的方法测定，果酒其他理化指标参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》规定的方法测定。

1.3.3 挥发性香气成分测定

顶空固相微萃取：取10 mL酒样置于20 mL顶空瓶中，加入20 μL 320 μg/mL的2-甲基-3-庚酮作内标，将老化后的75 μm CAR/PDMS萃取头插入样品瓶顶空部分，于45 ℃恒温吸附30 min，随后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。

GC-MS分析条件：DB-WAX色谱柱，载气为氦气（He），流速0.8 mL/min，不分流进样，进样口温度为250 ℃。升温程序为：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持7 min。电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，扫描范围30～500 amu。

定性定量方法：结合质谱和保留指数（retention index，RI）对挥发性成分进行定性分析，其中质谱分析结果与工作站美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）和Wiley数据库进行比对定性。使用C6～C26正构烷烃混标，以相同条件进行GC-MS分析，利用其保留时间按照线性方程计算各挥发性成分的保留指数RI，具体计算方法参考文献[16]，利用内标法对挥发性成分物质进行半定量。

1.3.4 电子鼻检测

准确吸取稀释5倍后的酒样10 mL于40 mL顶空瓶中，于45 ℃孵化30 min后进行测定。测样条件：测量间隔时间1 s、传感器自清洗时间60 s、自动调零时间5 s、样品准备时间5 s、进样流量400 mL/min、检测时间80 s，选取73～77 s的数据进行计算分析。各传感器对应的响应类型为W1C（芳香成分，苯类灵敏）、W5S（氮氧化合物灵敏）、W3C（氨水，芳香成分灵敏）、W6S（对氢气有选择性）、W5C（短链烷烃、芳香成分灵敏）、W1S（甲基类灵敏）、W1W（无机硫化物、萜烯类灵敏）、W2S（醇类、醛酮类灵敏）、W2W（芳香成分、有机硫化物灵敏）、W3S（长链烷烃灵敏）。

1.3.5 活性和特征香气成分分析

挥发性成分的OAV计算方法参考文献[16]。对OAV≥1的挥发性成分进行统计，鉴定作为关键香气成分，具有较高OAV的成分被鉴定作为特征香气成分。

1.3.6 香气轮廓分析

参考文献[17-18]，将目标香气轮廓确定为果香、焦糖味、脂肪味、花香、化学味、植物味、香料味7个系列；根据活性香气成分的香气描述赋予对应的一个或多个系列，对应多个系列时，每个系列都获得该OAV，结合7个气味系列与OAV累计值绘制雷达图来表示样本间整体香气轮廓及其差异。

1.3.7 数据分析

理化指标与电子鼻数据分析：采用Microsoft Excel 2010进行数据处理，使用Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 火龙果果浆理化指标分析

火龙果果浆理化指标测定结果显示，火龙果果浆的可溶性固形物为10.4%，还原糖含量为65.82 g/L，可滴定酸含量为1.18 g/L，pH值为5.06，对于鲜食用水果，具备较高的糖酸比，甜酸风味较好，但用于发酵果酒，含糖量偏低，可发酵的酒精度较低，发酵过程可适度进行外源性调糖，果酸偏低，果酒生产中应适当发酵产酸或调配增酸。

2.2 火龙果酒发酵过程中pH和可滴定酸的变化

果酒发酵过程伴随植物乳杆菌发酵导致酸度上升，所以后期调整产品甜酸比的工艺对产品风味至关重要，对火龙果酒基酒发酵过程pH和可滴定酸含量进行测定，结果见图1。

图1 火龙果酒发酵过程中pH（A）及可滴定酸含量（B）的变化Fig.1 Changes of pH (A) and titrable acid contents (B) during pitaya wine fermentation

由图1A可知，火龙果酒基酒pH呈先快速后缓慢的下降趋势，在酸性pH值范围有利于火龙果酒紫色调的稳定[19]，通过发酵过程一定程度提升果酒酸度，有利于保持果酒的色泽和风味。图1B可知，火龙果酒基酒可滴定酸含量呈不断上升的趋势，前期研究表明，酒精发酵的同时伴随着乳酸发酵，虽对维持酒体稳定有益处，但为保持果酒产品的口感适宜，有时需要进行发酵中止和后期调整糖酸比，以获得最佳的滋味口感，所以后期需要对火龙果酒进行甜味调配。

2.3 火龙果酒理化指标分析

对火龙果基酒、加入罗汉果甜苷以及蔗糖调配的火龙果甜酒理化指标进行测定，结果见表1。

表1 火龙果酒理化指标测定结果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of pitaya wine

由表1可知，火龙果酒的酒精度为9.0%vol，随着人们对健康生活的追求，健康养身的低度果酒深受消费者喜爱[20]。调配后pH与可滴定酸含量显著高于基酒（P＜0.05），MOG和基酒的还原糖含量显著低于SUC（P＜0.05），MOG可增加甜感，并不会引起含糖量的增加，更符合人们低糖摄入的健康需求。基酒干浸出物高达48.5 g/L，远高于QB/T 5476—2020《果酒通用技术要求》规定的≥10.0 g/L要求。

2.4 火龙果酒挥发性成分分析

火龙果甜酒挥发性成分定性定量结果见表2。

表2 火龙果酒挥发性成分定性定量结果Table 2 Qualitative and quantitative results of volatile components in pitaya wine

由表2可知，火龙果酒挥发性风味成分包括醇、酯、醛、酸及其他五类。2种火龙果酒中醇类及酯类物质含量较高，醛类物质含量最低。MOG中醇类、酯类、醛类及挥发性成分总量高于SUC，酸类及其他类挥发性成分含量较低，2种火龙果酒挥发性成分种类及相对含量的差异性可能导致香气特征的差异。

2种火龙果酒中共鉴定出50种挥发性成分，其中醇类7种、酯类28种、醛类2种、酸类8种和其他类5种。MOG中含有42种挥发性成分，SUC中含有43种，2种火龙果酒中共有的挥发性成分为35种，总体上差异性不大。

醇类物质主要产生于火龙果发酵过程中，通过氨基酸转化以及亚麻酸降解物的氧化形成[21]。火龙果酒中醇类化合物的含量对香气有很大的影响，形成火龙果酒特有的香气特征，尤其是一些高级醇，它们来源于酵母代谢，当高级醇的质量浓度＜300 mg/L时，形成果酒典型的香气和复杂的风味[22]。在火龙果酒中，MOG与SUC的醇类物质含量分别为1 493.1 μg/L、1 440.8 μg/L，MOG中醇类物质含量较高，主要是异丁醇与异戊醇的含量较高，使MOG火龙果酒醇香更浓郁。醇类物质含量最高的是异戊醇，MOG中含量是949.4 μg/L，SUC中是839.3 μg/L，分别占醇类物质的63.6%、58.3%，具有蕉香、醇香的香气特征[16]。含量较高的是苯乙醇，分别为407.2 μg/L、412.9 μg/L，具有玫瑰花香及蔷薇香气[16]。（E）-9-十六碳烯-1-醇是SUC中独有的醇类物质，其他醇类物质均为2种火龙果酒所共有。

酯类物质是火龙果酒中含量最高的一类物质，也是挥发性物质种类最多的一类物质。果酒中的酯类物质大多赋予愉悦的花香和果香味[23]，对果酒的香气有着积极的影响，香气来源上可为一类或二类香气物质。MOG中有25种酯类，SUC中有23种，其中20种酯类物质为2种火龙果酒所共有。MOG中酯类物质种类更多、含量更高，使其具有更浓郁果香特征。酯类物质含量最高的是辛酸乙酯，MOG与SUC中含量分别为5 834.9 μg/L、3 221.3 μg/L，占酯类物质的54.8%、46.7%，具有果香、茴香味、甜味[24]。乙酸乙酯及己酸乙酯的含量较高，具有青苹果、草莓等果香，茴香味及脂香[24]。部分酯类物质虽含量较低，但由于可能具有更低水平的香味阈值，可对火龙果酒产生更为丰富的果香。

醛类物质的含量及种类均较少，MOG中仅含有癸醛，SUC中含有癸醛及苯甲醛。癸醛带有轻微的甜味，类似于甜橙油和玫瑰油的味道，达到阈值时会散发出新鲜柑橘皮的清香[13]，由于醛类往往具有较低的阈值，在较低浓度含量时可表现出显著的香气特征。火龙果酒中酸类物质含量较高，在SUC中表现更加突出，对火龙果酒的口感平衡会产生一定的影响。酸类物质通常具有不好的风味，如乙酸具有醋味；癸酸具有不愉快的脂肪味；辛酸具有腐败味；己酸具有猫尿味、汗臭味等[24]。但是它们可以抑制一些芳香酯的水解，对于酒类香气化合物的平衡至关重要，但也可能带来不愉悦的香气表现[16]。酸类物质阈值通常较高[24]对火龙果酒风味特征贡献度较低。其他类物质在MOG中含有3种，包括十三烷、橙花醚与2,4-二叔丁基苯酚。SUC中其他类物质含量较高，主要有4种，其中十三烷、长叶烯含量较高。十三烷与橙花醚是2种火龙果酒所共有的物质。苯乙烯仅在SUC中检出，其一定浓度下具有玫瑰的花香香气，但SUC中低含量达不到香气阈值，对香气特征没有贡献，可能来源于苯乙醇。

结合以上分析可知，醇类与酯类是火龙果酒主要的挥发性成分，异戊醇与辛酸乙酯分别是醇类、酯类中含量最高的物质。MOG较SUC在这2大主要挥发性成分上含量更高，异戊醇、辛酸乙酯在MOG中含量更高。MOG中醛类、酸类与其他类这3类物质含量低于SUC，SUC中酸类含量明显高于MOG。相比SUC，MOG具有更浓郁的醇香、花香、果香，酒香更饱满、柔和。

2.5 活性和特征香气成分分析

根据表3中火龙果酒挥发性成分定性定量结果，结合挥发性成分阈值计算各成分的香气活性值（OAV），结果见表3。

由表3可知，火龙果酒共鉴定出10种具有贡献作用（OAV≥1）的关键挥发性香气成分，均是2种火龙果酒共有的挥发性成分，包括醇类3种，酯类6种，醛类1种，表明醇类和酯类是构成火龙果酒主体香气特征的重要类别。乙酸乙酯、己酸乙酯是2种火龙果酒中OAV位于前2位的物质，其OAV之和分别占OAV总和的84.5%（MOG）及83.4%（SUC），是特征香气成分。与李凯等[15]研究结果中己酸乙酯和乙酸异戊酯对红心火龙果酒的香气贡献最大有差别，这可能是由于原料品种、产品工艺差异所致。辛酸乙酯、癸酸乙酯虽具有较高的含量，但其阈值较高（250 μg/L、200 μg/L），OAV不突出。其次还有戊酸异丙酯、乙酸异戊酯，共同赋予火龙果酒青苹果、草莓及椰子等丰富的果香；苯乙醇、异戊醇、香茅醇具有玫瑰、蔷薇及丁香等丰富的花香；癸醛具有甜香、柑橘香、花香；这些物质共同构成了火龙果酒的特征香气物质。OAV排名前3的乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯均在MOG中更高，同时癸醛的OAV也比SUC高4.3。SUC比MOG中OAV高的活性香气成分，其差异为0.1～0.2。MOG中特征香气物质OAV明显高于SUC，表明MOG中果香、脂香、香料味及花香更浓郁。

2.6 香气轮廓分析

根据表3中各单体香气物质的气味描述及对应的OAV，计算得出火龙果酒中各香气描述总OAV，绘制总体香气轮廓图，结果见图2。

图2 香气轮廓分析结果Fig.2 Analysis results of aroma profiles of pitaya wine

由图2可知，2种火龙果酒的总体香气轮廓较相似，果香、脂肪味、香料味与焦糖味的香气强度值较大，为火龙果酒的主要特征香气，花香、化学味、植物味的香气强度值较小。MOG中果香、香料味强度值明显高于SUC，蔗糖味、脂肪味略高于SUC。2种火龙果酒基酒相同，在总体风味轮廓上趋一致，由于罗汉果甜苷较蔗糖香气更浓郁丰富，并对果酒的果香具有增益和协同效应，调配的火龙果酒香气强度更高。

2.7 电子鼻雷达图分析

应用电子鼻检测2种火龙果酒，将获得的传感器响应值进行分析并绘制雷达图，结果见图3。

图3 电子鼻传感器响应值雷达图Fig.3 Radar map of response value of electronic nose sensor

由图3可知，2种火龙果酒的挥发性成分雷达图谱相近，主要集中在W5S、W1S、W1W、W2S及W2W传感器，表明对芳香成分、硫化物、氮氧化合物、甲基类、醇醛酮类等敏感；其余传感器的响应值较小。其中影响最大的是W1W传感器，该传感器除对硫化物敏感以外，还对多种萜烯类物质敏感，MOG中挥发性成分的该传感器响应值略高于SUC。电子鼻结果表明，在甜味果酒生产中使用天然代糖罗汉果甜苷替代蔗糖，可达到增香效果。

3 结论

本研究采用HS-SPME-GC-MS对蔗糖和代糖罗汉果甜苷调配的2种甜味发酵火龙果酒挥发性成分进行定性定量分析。结果表明，共鉴定出50种挥发性成分，MOG较SUC中醇类、酯类、醛类及挥发性成分总量较高；酸类及其他类挥发性成分含量较低。利用OAV对其活性和特征香气成分进行分析，2种火龙果酒的关键香气成分一致，共有10种，分别为乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇、癸酸乙酯、癸醛、异戊醇、戊酸异丙酯、香茅醇、乙酸异戊酯，醇类和酯类是构成火龙果酒主体香气特征的重要类别，其中乙酸乙酯、己酸乙酯为主要的特征香气物质。2种火龙果酒具有相似的香气轮廓，均具有较高的果香、脂肪味、香料味及焦糖味强度值，MOG中各香气强度值高于SUC，香气更突出。电子鼻分析表明，2种火龙果酒的挥发性成分雷达图谱相近，MOG中感应器响应的强度略高于SUC。应用天然代糖罗汉果甜苷调配甜味火龙果酒，在整体香气特征上能与甜型果酒保持一致，由于代糖添加减少热灭菌工艺等因素影响，罗汉果甜苷用于调配火龙果酒一定程度上达到增香的效果，天然产物代糖在果酒生产中具有一定的应用前景。