热休克蛋白90在HBV复制中的作用

花胤， 方海丽， 刘守胜， 辛永宁， 张梅， 宣世英

1 南京医科大学附属青岛临床医学院， 青岛市市立医院 a. 感染性疾病科， b. 临床研究中心， 山东 青岛 266011； 2 青岛市第八人民医院感染性疾病科， 山东 青岛 266000

HBV的复制可以概括为松弛环状DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）转化为共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），以cccDNA为模板合成RNA中间体，再从RNA中间体逆转录回rcDNA的过程。cccDNA在HBV复制过程中高度稳定，由此导致HBV的长期慢性感染和较低治愈率［1］。近年来，研究发现HBV复制过程中肝脏内存在不同程度的热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）90表达，并且其表达水平与乙型肝炎的诊断和分型有密切的关联。随着对Hsp90在HBV复制过程中的作用的研究不断开展，提示Hsp90有可能作为抗HBV的潜在靶点，但目前尚未对此有系统的归纳总结。本文对Hsp90在HBV复制过程中的作用进行综述，以期为Hsp90作为抗HBV的新靶点提供理论依据。

1 Hsp90的生理功能

1.1 分子伴侣 分子伴侣是一类参与蛋白质的折叠与组装，但其本身并不进行折叠的蛋白质［2］。多项研究已经证明Hsp90的分子伴侣功能。酶、类固醇受体、转录因子蛋白质的一级序列中存在疏水性基团，Hsp90可以协助这些疏水性基团折叠到其球形蛋白的内部，以防止疏水性基团自发地聚集而失去正常的结构和功能［3］。Hsp90经常与Hsp70和Hsp40合作发挥分子伴侣功能［4］，纯化的Hsp90可以稳定热变性的蛋白质，包括柠檬酸合成酶、硫氰酸酶、蛋白激酶2［5-6］。Hsp90的目标蛋白常在信号通路中发挥作用，典型的目标蛋白有类固醇受体和v-Src蛋白激酶。

1.2 细胞骨架 在非应激情况下，Hsp90占哺乳动物细胞内总蛋白的1%～2%，而在应激条件下会增加到4%～6%，由于其庞大的数量和分子伴侣的性质，Hsp90在细胞浆内常参与细胞骨架的形成。体外实验［7］发现Hsp90与肌动蛋白丝交联，其分解产物Hsp90cl会导致肌动蛋白的氧化累积增强，而防止Hsp90降解可以减少肌动蛋白氧化的积累。另有研究［8］表明乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X，HBx）可以与钙调蛋白相互作用，从而使Hsp90与钙调蛋白脱离，并增强Hsp90的活性，启动下游的Hsp90/LIMK1/cofilin通路实现肌动蛋白的重组。此外Hsp90可以与微管蛋白发生作用并保护其受热变性［9］，且Hsp90与动植物细胞中的微管都存在相互作用［10］。

1.3 核内功能 细胞核中Hsp90在正常情况下占核内总蛋白的5%～10%，而在应激条件下，Hsp90的核内占比有所增加。在核内Hsp90可以与DNA、RNA以及组蛋白结合。Hsp90可以和细胞分裂周期蛋白37共同参与细胞周期相关蛋白激酶的折叠，如细胞周期蛋白依赖性激酶4/6［11］、细胞周期依赖性激酶11p110［12］以及细胞周期依赖性激酶调节蛋白Wee1等［13］。

2 Hsp90参与HBV的复制过程

2.1 Hsp90促进HBV核衣壳的形成 HBV的部分双链环状DNA在机体内可以表达4种蛋白质，即表面蛋白（HBs）、核心蛋白（HBc）、DNA聚合酶/逆转录酶（polymerase-reverse transcriptase，Pol/RT）和HBx（图1）。HBc在HBV的复制周期中起到重要作用，它可以分为氨基端和羧基端，羧基端能够调节病毒复制而氨基端参与HBc的组装［14］。在HBV复制的起始阶段，HBc会形成一个同源二聚体，而后90个或120个二聚体自我组装成二十面体的核衣壳，该衣壳可以将Pol/RT、pgRNA以及其他对病毒复制起重要作用的因子如Hsp、蛋白激酶等共同封装在其内部从而保护病毒DNA不受外界干扰。最终的病毒是由HBc与病毒基因组及其他蛋白组装产生，因此HBc对病毒的成熟至关重要［15］。Shim等［16］的研究证实Hsp90可以与HBc二聚体结合以促进核衣壳形成，并且核衣壳的形成过程依赖其反应温度，Hsp90可以降低不同温度条件下核衣壳的分解。该研究还在HepG2.2.15细胞中发现，当Hsp90表达下调或其活性受到抑制后，HBV的复制将受到抑制。此外有实验［17］证实了Hsp90表达下调或活性受到抑制并不影响HBc的表达，而是通过影响HBc的组装来抑制HBV的复制。Zhao等［18］研究首次表明HBc二聚体在封装pgRNA前是高度磷酸化状态，而封装之后则发生去磷酸化，在这一过程中Hsp90抑制剂可以通过抑制pgRNA的封装来干扰HBc的去磷酸化，该研究结果表明了Hsp90对HBc的潜在增强机制。Makokha等［19］研究显示Hsp90可以与TAR DNA结合蛋白（transactive response DNA-binding protein，TARDBP）相互作用，后者作为一种多功能蛋白可以调节HBV的复制，沉默或敲除TARDBP均会严重破坏病毒的复制过程。除Hsp90以外，TARDBP还可与许多其他支持HBV生命周期的蛋白如核仁磷酸蛋白1、多聚ADP核糖转移酶1、脯氨酸和谷氨酰胺剪接因子等蛋白相结合。

图1 HBV复制过程示意图Figure 1 Diagram of HBV replication process

2.2 Hsp90促进pgRNA的逆转录 HBV的基因组虽然是一组双链DNA，但其复制是由pgRNA经过逆转录形成的。此外，pgRNA逆转录过程的关键酶是pgRNA自身表达所生成。在逆转录的起始阶段，逆转录酶识别pgRNA 5'端的ε结构，以其内部凸起（5'-UUC-3'）为模板，并由自身的第63个酪氨酸充当引物［20-21］，形成逆转录酶-dGAA复合体，然后逆转录酶再转运至pgRNA 3'端的直接重复序列1来完成DNA负链的合成。在HBV的生命周期中，逆转录酶与pgRNA的结合启动了HBV复制早期的两个关键事件，即逆转录和核衣壳封装。前者实现了pgRNA的逆转录，后者导致逆转录酶和pgRNA被HBc选择性的封装［13］。Hu等［22］实验证实在逆转录酶与pgRNA的结合过程中Hsp90不可或缺，抑制Hsp90的表达将导致封装进核衣壳的pgRNA数量下降，并且此过程依赖于ATP的水解。尽管Hsp70或Hsp40也可以促进逆转录酶与pgRNA的结合，但只有在Hsp90共同参与的情况下，Hsp70或Hsp40才能最大程度地促进逆转录酶与pgRNA的结合［23］。Gyoo Park等［24］研究表明Hsp90通过与逆转录酶的结合影响pgRNA逆转录的起始，加入Hsp90抗体（3G3）将降低逆转录酶的逆转录活性，从而表明Hsp90对逆转录酶在逆转录过程中发挥正常功能十分重要。

3 Hsp90与其他分子相互作用参与HBV的复制过程

3.1 Hsp90与Hsp70相互作用 Hsp70也是细胞内分子伴侣网络中的组成成分，并且与Hsp90常常组成蛋白复合体共同发挥作用［25］。在HBV相关肝细胞癌的进展中，Hsp70与Hsp90的表达上调，并通过逆转录酶-Hsp复合体的形式影响核衣壳封装与病毒DNA的合成［26］。Seo等［27］研究证实，Hsp70可以与Hsp90协同增加病毒衣壳的形成，随着Hsp70水平的提高，核衣壳形成的速率也会增加，并且这种协同效应来自于HBc六聚体的形成。此外，核仁磷蛋白同样具有促进核衣壳形成的效应，但不具备与Hsp90的协同作用。

3.2 Hsp90与ROS相互作用 HBV在感染过程中会影响线粒体功能从而产生ROS，ROS又可以通过改变细胞的氧化还原状态和激活类似核因子-κB的转录因子从而提高病毒的复制水平。不断积累的ROS会导致细胞增殖异常和染色体突变，从而促进肝细胞癌的发展，而Hsp90和谷胱甘肽可以作为抗氧化成分发挥抗氧化防御作用［28］。Kim等［25］研究发现当Hsp90存在时，ROS可以促进HBV的核衣壳形成，而Hsp90不存在时ROS则会抑制HBV的核衣壳形成。此外，谷胱甘肽可以通过抑制Hsp90的功能来减慢核衣壳形成。ROS和谷胱甘肽都会引起Hsp90与p23、ATP复合体的构象改变，前者会引起a-螺旋的轻度降低，而后者会导致a-螺旋升高。

3.3 Hsp90与A3G相互作用 A3G是在细胞内广泛表达的RNA编辑酶，具有胞苷脱氨酶活性，可诱导胞嘧啶突变为尿嘧啶。A3G不仅在癌变过程中经常表达上调，而且能够抑制包括HBV在内的多种逆转录病毒，常参与宿主对抗病毒的免疫过程。Turelli等［29］发现A3G具有抑制DNA复制的作用，并进一步推测该机制与A3G阻断HBV前基因组pgRNA封装至衣壳的过程有关。Nguyen等［30］研究发现A3G进入核衣壳发挥效应的同时需要HBV逆转录酶和pgRNA片段ε以及自身氨基末端的完整性。Chen等［31］在HepG2细胞实验中发现Hsp90可以刺激A3G的脱氨酶活性，进一步的测序分析显示Hsp90增加了A3G介导的HBV基因的胞嘧啶突变效率和总HBV基因突变频率，并且能够改变A3G对HBV基因的胞嘧啶区域选择性，而Hsp90抑制剂呈剂量依赖性地抑制HBV的A3G突变活性，从而表明Hsp90在固有免疫抗病毒的过程中有一定的潜在作用，而Hsp90是否能通过影响A3G的脱氨酶活性对HBV复制产生影响有待进一步探究。

4 Hsp90抑制剂对HBV复制的作用

由于Hsp90参与pol-ε复合体的形成，并且可以和HBc相互作用稳定核衣壳，因此Hsp90小分子抑制剂均具有抑制HBV复制的潜力［32］。目前Hsp90的抑制机理主要围绕氨基端的ATP竞争抑制。格尔德霉素（Geldanamycin，GM）是天然的小分子Hsp90抑制剂，其可以在Hsp90氨基端的口袋结构模拟核苷酸结构达到抑制效果，但是存在严重的肝毒性和溶解性差的问题。为了克服GM系列物的副作用，Brough等开发出基于间苯二酚的抑制剂Luminespib（NVPAUY922）［33］，后续同类型的抑制剂还有AT13387，其作用方式与GM类似，此外还有基于嘌呤环结构的衍生物Zelavespib（PU-H71）、Icapamespib（PU-AD）、BIIB021等［3］。另有研究［34］显示KNK437能够通过抑制Hsp90的活性来抑制HBV的复制和转录。此外Hsp90抑制剂对肿瘤细胞的敏感性高于正常细胞，新型Hsp90抑制剂SNX-2112可加强肝癌细胞凋亡［35］，Hsp90抑制剂Ganetespib（STA-9090）能够抑制c-Myc依赖性食管鳞状肿瘤生长［36］。

综上所述，本文对Hsp90的生理功能进行了简介，并重点归纳总结了Hsp90在HBV复制过程中的作用，即参与促进核衣壳的形成，并对HBV逆转录酶的活性有重要调节作用，能够直接影响HBV的复制效率，以及与胞内其他分子相互作用来促进HBV的复制。这些研究充分证明了Hsp90在HBV复制过程中的关键作用，表明Hsp90可作为潜在的生物靶点来开展抗HBV的药物研发，为慢性乙型肝炎的防治提供新的理论指导和方向。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：花胤负责撰写和修改论文；方海丽、刘守胜负责参与文献的收集和整理；宣世英、张梅、辛永宁负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。