2022年天津地区鱼源气单胞菌耐药性分析

赵良炜,张振国,徐赟霞,王 禹,张 丽

(天津市动物疫病预防控制中心,天津 300402)

随着水产养殖业的发展,水产养殖病害成为制约水产养殖业发展的一个重要问题,2019年和2020年我国水产养殖因疾病造成的经济损失分别为408亿元和589亿元,而细菌性疾病所占比例最高[1-2]。2020年天津地区淡水养殖面积22 731 hm2,淡水养殖总产量23.7万吨,总产值54.0亿元,其中草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫等大宗淡水鱼养殖产量18.6万吨,占淡水养殖产量的78.5%[3]。根据2019年、2020年水产养殖动物病情测报监测结果,池塘养殖鱼类细菌性疾病发病率分别占病害发病总数的50.0%和53.3%[1-2]。2022年农业农村部《关于做好2022年水产绿色健康养殖技术推广“五大行动”工作的通知》中要求继续做好水产养殖用药减量行动,而对水生动物病原菌耐药性监测是用药减量行动的重要环节。

通过流行病学调查显示,气单胞菌属(Aeromonas)细菌是鲤、鲫、草鱼等大宗淡水鱼细菌性疾病的主要致病源。气单胞菌属细菌广泛分布于水环境中,是一种条件致病菌,可以引起水产动物多种疾病,如细菌性败血症、细菌性烂鳃、肠炎等,对我国水产养殖业造成巨大损失。抗生素治疗是针对此类疾病的首选方法,当前水产养殖用药及用药指导是以国家渔药标准为基础,缺乏对水产养殖动物致病菌的耐药性监测及致病菌耐药性变化的数据,再加上药物的滥用、误用等不合理用药情况普遍存在,致使细菌耐药性日益严重。因此,针对气单胞菌病进行病原菌耐药性监测,对水产养殖业的健康发展具有重要意义:可以针对水产病原菌耐药性及其变化的规律,在养殖过程中科学选择和使用药物;可以避免滥用药物,为水产品的质量安全奠定了基础;可以控制细菌耐药性的产生及传递,降低将耐药性传播给人类致病菌的潜在风险,维护公共卫生安全。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 2020—2022年4—10月,每月采集发病样品,样品包括草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫等大宗淡水鱼,取样部位为肝、脾、肾、腹水。

1.1.2 生化试剂 营养琼脂、脑心浸液琼脂(BHI)购自英国Oxoid公司,革兰氏染液试剂盒、氧化酶试纸以及生化鉴定管均购自北京陆桥技术有限责任公司,梅里埃生化鉴定试剂卡GN及配套试剂购自法国梅里埃公司,药敏预制板购自南京菲恩生物科技有限公司,DL2000 DNA marker、核酸染料、琼脂糖购自Takara,PCR引物27F:(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R:(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)苏州金唯智合成。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的生化鉴定 细菌生化鉴定采用梅里埃VITEK Compact2 进行,并补充革兰氏染色、氧化发酵试验、氧化酶试验、硫化氢、葡萄糖产气、V-P试验等。

1.2.2 细菌的分子鉴定 细菌16S rRNA分子生物学鉴定按照曹青等[4]的方法进行。

1.2.3 细菌最小抑菌浓度(MIC)测定 细菌最小抑菌浓度测定采用微量稀释法进行,操作方案按照南京菲恩药物预制板说明书进行,质控菌株使用大肠杆菌(ATCC29522),测定药物均为允许使用的国标渔药。

1.3 数据分析

根据药敏试验结果, 采用 SPSS 计算各抗菌药物对分离菌株的 MIC50和 MIC90( 分别指抑制50% 和90%分离菌株生长所需要的MIC)。

2 结果

2.1 气单胞菌分离鉴定结果

气单胞菌属细菌在BHI琼脂平板上菌落呈淡黄色,圆形,表面光滑、微凸,革兰氏染色为阴性,氧化发酵阳性,氧化酶阳性,部分菌株生化鉴定结果见表1。分子鉴定通过对分离菌株进行16s rRNA扩增,将条带大小与目的条带一致的菌株经测序、BIAST比对确定到种属。2022年从宝坻、宁河区等地区人工养殖鲤、鲫、鲢、鳙、草鱼等发病鱼体内共分离获得气单胞菌属细菌60株,其中嗜水气单胞菌32株,温和气单胞菌18株,维氏气单胞菌8株、豚鼠气单胞菌2株(分类占比见图1)。

表1 部分菌株部分生化试验结果

图1 2022年气单胞菌分离情况

2.2 气单胞菌属细菌耐药性总体情况

2022年分离的60株气单胞菌对抗菌药物的感受性分布情况见表2、表3所示。分离菌株对恩诺沙星的感受性最低,其MIC50为0.12 μg/mL,MIC90为1.58 μg/mL;其次为盐酸多西环素,其MIC50为0.27 μg/mL,MIC90为2.92 μg/mL;甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹的MIC50虽然不高,分别为3.60、2.25、0.4 μg/mL,但MIC90却很高,分别为117.50、29.76、10.23 μg/mL。磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶对分离菌株的MIC50和MIC90均较高。

表2 60株病原菌对抗菌药物的感受性分布

表3 60株病原菌对磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的感受性分布

从抗菌药物MIC分布情况来看,每种药物都有相对集中的MIC分布。恩诺沙星的MIC主要分布在0.008～0.5 μg/mL之间,硫酸新霉素的MIC主要分布在0.25～4 μg/mL之间,甲砜霉素的MIC主要分布在1～4 μg/mL之间,氟苯尼考的MIC主要分布在1～2 μg/mL之间,盐酸多西环素的MIC主要分布在0.06～4 μg/mL之间,氟甲喹的MIC主要分布在0.125～4 μg/mL之间,磺胺间甲氧嘧啶的MIC主要分布在128～1 024 μg/mL之间,磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的MIC主要分布在76/4～608/32 μg/mL之间。

2.3 不同种类气单胞菌对水产用抗菌药物的感受性

2.3.1 嗜水气单胞菌对水产用抗菌药物的感受性

32株嗜水气单胞菌对抗菌药物感受性分布情况见表4、表5。恩诺沙星、硫酸新霉素、氟甲喹、盐酸多西环素对分离菌株的MIC50较低,分别为0.08、0.76、0.20、0.23 μg/mL;恩诺沙星和盐酸多西环素的MIC90较低,分别为0.65、0.87 μg/mL。磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶对分离菌株的MIC50和MIC90均较高。

表4 嗜水气单胞菌对抗菌药物的感受性分布

表5 嗜水气单胞菌对磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的感受性分布

2.3.2 温和气单胞菌对水产用抗菌药物的感受性 18株温和气单胞菌对抗菌药物感受性分布情况见表6、表7。恩诺沙星、氟甲喹、盐酸多西环素对分离菌株的MIC50较低,分别为0.15、0.54、0.18 μg/mL,盐酸多西环素的MIC90最低,为2.35 μg/mL。恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹的MIC50虽然不高,但MIC90却很高,分别为6.23、11.39、314.01、55.33、11.00 μg/mL。磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶对分离菌株的MIC50和MIC90均较高。

表6 温和气单胞菌对抗菌药物的感受性分布

表7 温和气单胞菌对磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的感受性分布

2.3.3 维氏气单胞菌对水产用抗菌药物的感受性 8株维氏气单胞菌对抗菌药物的感受性分布情况见表8、表9。恩诺沙星、盐酸多西环素对分离菌株的MIC50较低,分别为0.19、0.49 μg/mL,恩诺沙星、盐酸多西环素的MIC90较低,分别为1.3、3.68 μg/mL。甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹的MIC50虽然不高,但MIC90却很高,分别为41.31、15.02、22.63 μg/mL。磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶对分离菌株的MIC50和MIC90均较高。

表8 维氏气单胞菌对抗菌药物的感受性分布

表9 维氏气单胞菌对磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的感受性分布

2.3.4 豚鼠气单胞菌对水产用抗菌药物的感受性 豚鼠气单胞菌由于分离数量较少,不进行MIC50和MIC90统计分析,其药敏试验结果见表10。结果显示除恩诺沙星的MIC较低外,豚鼠气单胞菌对其它7种药物均呈现不同程度的耐受。

表10 豚鼠气单胞菌对抗菌药物感受性

2.4 不同种类气单胞菌对水产用抗菌药物感受性比较

嗜水气单胞菌、温和气单胞据、维氏气单胞菌对抗菌药物感受性结果进行Kruskal-Wallis 检验分析,结果如表11所示。3种气单胞菌对硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶感受性存在差异,经Bonferroni法校正显著性水平的事后两两比较发现(表12),嗜水气单胞菌与温和气单胞菌、嗜水气单胞菌与维氏气单胞菌对硫酸新霉素、氟苯尼考感受性存在差异,嗜水气单胞菌与温和气单胞菌对甲砜霉素感受性存在差异,3种气单胞菌对氟甲喹和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶感受性经Bonferroni法校正显著性水平的事后两两比较后,差异不显著。

表11 3种气单胞菌之间对抗拒药物感受性Kruskal-Wallis检验

表12 3种气单胞菌对抗菌药物感受性两两比较结果

3 讨论

气单胞菌属细菌是大宗淡水鱼类细菌性败血症的主要病原,其中嗜水气单胞菌为最为常见的致病菌,2022年分离菌株中,嗜水气单胞菌占总数的53.34%,吴亚锋等[5]2017—2018年从江苏分离气单胞菌1 364株,分离菌株中以嗜水气单胞菌最多,占67.23%,与本研究分离情况较为相似。而王一娟[6],张德锋等[7],邓玉婷等[8]从鱼类分离获得的病原菌以维氏气单胞菌为主,说明不同地区,气单胞菌的组成存在一定差异。

气单胞菌对抗菌药物的感受性总体情况表明,恩诺沙星、硫酸新霉素、盐酸多西环素对分离菌株的抑菌效果较好,而磺胺类的两种药物、甲砜霉素的抑菌效果较差,与梁倩蓉等[9]2019年在浙江地区淡水养殖品种中分离的病原菌对抗菌药物感受性结果较为相似。同为酰氨醇类药物,氟苯尼考相对于甲砜霉素则呈现出不同程度的抑菌效果,这可能与氟苯尼考的分子结构有关,从而表现出对甲砜霉素耐药细菌仍敏感[10]。比较不同种属的气单胞菌对抗菌药物感受性,结果显示不同种属气单胞菌对抗菌药物感受性存在一定差异,与吴亚锋等[5]、邓玉婷等[8]报道一致。

在CLSI中,敏感是指使用常规剂量时的平均血药浓度超过MIC 4倍以上,用常规剂量通常有效,耐药是指药物对细菌的MIC高于应用常规剂量时的血药浓度,应用常规剂量治疗通常无效。由于药物在鱼和人体内的药代动力学数据不同,而判断细菌是否敏感必须考虑药物在体内的动力学特性,因此使用医学上敏感、耐药标准进行结果判定是不合理的[11]。故本文未采用医学上的标准进行结果判定。通过研究发现,同一种药物在不同的水产动物体内,其药代动力学也不完全相同,张国栋等[12]研究发现恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰体内的峰浓度分别为 4.66 μg/mL 和 3.95 μg/mL,朱晓漫等[13]研究发现恩诺沙星在罗非鱼血浆峰浓度为 4.38 mg/L。因此在药物使用中需根据养殖品种,结合药敏试验结果和药代动力学相关数据确定药物使用剂量和周期,避免耐药菌的产生并保障水产品质量安全。