八种花卉水提液美白和抗氧化效果的研究

何芊芊,宋绍娇,陈霞,梁欢弋,张琳,范琴琴,李婷,赵秋月

(绵阳师范学院 生命科学与技术学院,四川 绵阳 621000)

化妆品的美白效果和抗氧化活性研究一直是化妆品行业及医美行业关注的热点问题。市面上美白材料分子的作用机制多数为通过减少黑色素的产生而改善肤色问题。其中通过抑制酪氨酸酶活性来减少黑色素产生是最常用到的方法,但一些传统有效的抑制酪氨酸酶活性的美白原材料如曲酸和对苯二酚长期使用会引起皮肤敏感和癌变等副作用[1];同时合成抗氧化剂对健康也会造成潜在的危害,如二丁基羟基茴香醚(BHA)在通过动物试验后证明其具有一定的致癌作用[2],所以从天然的植物材料中寻找高效、经济、安全的天然抗氧化剂与美白成分成为目前医美行业发展的一个必然趋势。本试验选取春季常见花卉为试验材料,提取花卉水提液,系统测定其抑制酪氨酸酶活性的作用效果及清除自由基的能力,从而研究花卉水提液的美白和抗氧化效果,以期为天然植物化妆品的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 试验材料

试验材料见表1。

表1 试验材料

1.1.2 主要试验仪器

主要试验仪器见表2。

表2 主要试验仪器

1.2 试验方法

1.2.1 试剂

参考崔彬淯方法配置磷酸缓冲液(PBS,pH值=6.8)、L-酪氨酸溶液、10%饱和度硫酸铵溶液、DPPH溶液[3]。

PBS缓冲液:按表3配置A、B两种溶液,取A溶液250 mL和B溶液118 mL,混合并加蒸馏水至1 000 mL,摇匀即可得pH值6.8的磷酸缓冲溶液,配置好的缓冲液放于4 ℃进行冷藏储存。

表3 PBS缓冲液A、B溶液的配置

L-酪氨酸溶液:准确称取L-酪氨酸粉末22.5 mg,置于50 mL容量瓶中,加入PBS缓冲液进行溶解,超声加速溶解至溶液澄清后定容,配置成质量浓度为0.45 mg/mL的L-酪氨酸溶液。

10%饱和硫酸铵溶液:称取11.2 g 硫酸铵粉末,置于200 mL容量瓶中,用蒸馏水溶解并定容,25 ℃储存。后续60%饱和硫酸铵溶液配置参照硫酸铵饱和度常用表,即在25 ℃下,硫酸铵溶液由初浓度10%调到终浓度60%时,每1 L溶液加入326 g固体硫酸铵。

DPPH溶液:准确称取4 mg的DPPH固体粉末,置于100 mL容量瓶中,用无水乙醇溶解并定容,DPPH溶液宜临用现配,避光保存。

1.2.2 双孢蘑菇酪氨酸酶提取

酪氨酸酶提取参考文献[4]方法并作调整,如图1所示。

离心条件均为5 000 r/min冷冻离心15 min。

1.2.3 花卉水提液制备

水提液的制备参考文献[5]方法并做一定的调整,如图2所示。

再次以上述方法得到花卉水提液质量浓度为10 mg/mL(以干花的质量进行计算)。

1.2.4 酪氨酸酶活性测定

按照表4向试管中依次加入pH值6.8的磷酸缓冲液,花卉水提液和酪氨酸酶液,充分混合,于37 ℃水浴10 min后,加入L-酪氨酸溶液1 mL混匀,立即开始计时。体系反应10 min后,以pH值6.8的磷酸缓冲液为空白对照,测定475 nm处的吸光度值。总反应体系为5 mL[6]。

表4 反应液的组成

按照公式(1)计算水提液对酪氨酸酶的抑制率:

(1)

其中:OD1为不含水提液但含酪氨酸酶;OD2为不含水提液和不含酪氨酸酶;OD3为含水提液和酪氨酸酶;OD4为含水提液但不含酪氨酸酶。

1.2.5 清除DPPH自由基的测定

参照崔彬淯、闵玉涛的方法[3,6],取2 mL一定浓度的花卉水提液加入2 mL的DPPH无水乙醇溶液中,混合均匀,在室温下避光静置30 min后,迅速用分光光度计测定517 nm波长处的吸光度值,测定时以无水乙醇作为空白对照,按公式(2)计算花卉水提液对羟基自由基的清除率:

(2)

式中:Ai为2 mL花卉水提液和2 mL DPPH溶液的吸光度值;Aj为2 mL花卉水提液和2 mL无水乙醇的吸光度值;Ac为2 mL无水乙醇和2 mL DPPH溶液的吸光度值。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次,数据以平均值表示,采用SPSS 20统计软件,利用ANOVA检验进行统计学处理,P>0.05即表示不具有显著性差异。

2 结果分析与讨论

2.1 酪氨酸酶活性测定结果

酪氨酸酶会催化L-酪氨酸形成L-多巴,L-多巴会继续被催化生成多巴醌。多巴醌为有色物质,在475 nm波长下有吸收,所以通过紫外吸收观察475 nm下吸光度的值就可以判断酪氨酸酶催化酪氨酸的活性[7]。

按照1.2.4试验方法,提取反应体系为PBS缓冲液,反应温度37 ℃,反应时间30 min。由图3可见,加入酶液的体系颜色变化明显,溶液颜色随加热时间逐渐变深,而加入PBS 溶液的体系无颜色变化。在475 nm波长处测得的吸光度值见表5,不同体系吸光度差异较大,表5的数据表明提取的双孢蘑菇酪氨酸酶液可以较好地将酪氨酸催化形成多巴醌,测定吸光度值较高,所以双孢蘑菇提取液可以作为下一步试验中的材料。

图3 酪氨酸体系中加入不同溶液的颜色对比

表5 酪氨酸溶液加入不同物质后的吸光度

2.2 花卉水提液对酪氨酸酶活性的抑制率测定结果

按照1.2.5的试验方法,以L-酪氨酸为底物,通过酪氨酸酶催化反应,测定八种花卉水提液的酪氨酸酶活性抑制率,结果见表6。

表6 八种花卉水提液酪氨酸酶活性抑制率结果

由表6可知八种花卉水提液的酪氨酸酶活性均有抑制效果,抑制率最低的西府海棠为2.41%,最高的紫荆花达到59.89%,抑制率最高是最低的24.85倍。其余六种花卉水提液对双孢蘑菇酪氨酸酶活性位于两者之间。八种花卉水提液对双孢蘑菇酪氨酸酶活性抑制率只有紫荆花达到50%以上。宋芳芳、任雪峰等[4,8]研究报道白玉兰的水提液抑制率达到了99%,其他花卉水提液的抑制率与本试验中相差不大,研究结果不一致的原因可能有以下两点:1)采摘白玉兰的时间不太好,白玉兰已经处于大部分掉落的状态,并且采摘后变色;2)参照文献中的花为从药店购买的干花,且本试验的干燥步骤、干燥方法及干燥时间可能不是最佳的。桃花水提液的抑制率与文献[9]中桃花精油的抑制率(28.33%)基本一致甚至略高,说明利用花卉水提液类化妆品美白效果较好。

2.3 水提液清除DPPH自由基的测定结果

采用清除DPPH+自由基法检测八种花卉水提液的抗氧化性能[10]。其羟自由基清除率见表7。数据结果表明八种花卉均有抗氧化作用,但清除效果不同。八种花卉水提液的DPPH自由基清除率山茶花最高,是清除率最低的西府海棠的1.3倍,其余六种花卉的DPPH自由基清除率位于二者之间,DPPH自由基清除率也都在88%之上,清除效果较好。邹家丽等[11]研究山茶花的清除率为90.22%较该法低8.76%,李凤英等[12]测定樱花(44.13%)、迎春花(29.49%)、西府海棠清除率(33.67%)均低于本试验。本试验采用的方法提取到花卉抗氧化活性成分较多,更适用于实际生产。

表7 八种花卉水提液清除DPPH自由基的测定结果

3 结论

利用双孢蘑菇中提取的酪氨酸酶,测定八种花卉水提液对酪氨酸酶活性抑制率,并研究抗氧化效果。数据表明八种花卉水提液对酪氨酸酶活性抑制率由小到大依次为西府海棠、樱花、山茶花、碧桃、桃花、白玉兰、迎春花、紫荆花。而八种花卉水提液对DPPH自由基清除率由小到大依次为紫荆花、西府海棠、迎春花、白玉兰、桃花、碧桃、樱花、紫荆花、山茶花。酪氨酸酶抑制率和抗氧化效果并不完全一致。

从研究结果可知,八种花卉对蘑菇酪氨酸酶活性抑制率具有较大差异,紫荆花、迎春花卉水提液的抑制率显著高于其他六者,因此在美白效果上,紫荆花、迎春花提取物更具有优势,可对其进行更深入更宽泛的研究,开发出以其为原料的具有美白和抗衰老等功效的化妆品;而在DPPH自由基清除效果来看,八种花卉的提取物在DPPH自由基清除都达到了70%以上,均具有显著清除效果,在抗氧化效果上表现出较高的应用价值。综合分析表明对山茶花、紫荆花、樱花、碧桃、桃花、白玉兰提取物可进行抗氧化类化妆品的开发;紫荆花、迎春花、白玉兰提取物可用于美白类化妆品的开发;紫荆花、白玉兰可作为美白抗氧化化妆品的开发研究。对于花卉提取物的抑菌等效果有待进一步探索研究。