虫草素调节MAPK/AP-1信号通路对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织损伤的影响

陈才伟 陈家亮 李华娟 方芳 文方玲

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是由多种原因引起的慢性肺部炎症性疾病,它的特征是不可逆的气流受限,与肺部吸入香烟烟雾等颗粒物质有关[1]。研究发现肺部及全身性炎症反应、氧化应激、气道重塑是引起COPD的主要诱因[2]。因此抑制炎症,改善氧化应激是治疗COPD的关键着力点。虫草素(Cordycepin,Cor)是天然药材冬虫夏草的主要生物活性成分,具有广泛的生物活性,如抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗肿瘤等[3]。有研究发现,Cor可以通过抑制nuclear factor kappa-B(NF-κB p65)炎症通路来改善脓毒症小鼠肺损伤,还可以改善肾脏组织因ROS过量产生的氧化应激损伤[4-5]。目前临床上对于Cor治疗COPD的机制尚不明确,因此本研究基于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinase,MAPK)/激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)信号通路,探讨Cor对于COPD可能的治疗机制,为COPD治疗寻找新的治疗靶点。

资料与方法

一、材料

1 实验动物 SD大鼠60只,6～8周龄,体质量200-220g,购买自广州锐格生物科技有限公司,许可证号:SCXK(粤)2021-0059。所有大鼠均饲养于本院动物实验中心,适应性喂养一周,观察无异常后,用于后续实验。

2 试剂与仪器 Cor标准品(HPLC≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司;N-乙酰半胱氨酸(NAC)片(国药准字H20080326)购自中国海南海邦药业有限公司;LTB4、TNF-α、IL-6的ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司;HE染色试剂盒、MDA、SOD、GSH-Px微量法试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;抗体p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38、C-jun、C-fos、GAPDH均购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

仪器:多功能酶标仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;光学显微镜购自日本奥林巴斯。

二、方法

1 造模及分组 利用烟熏联合脂多糖滴入气管的方法造模[6]:将大鼠置于烟熏箱中,使用香烟烟熏5 w,每天早晚各1 h,烟熏时间间隔12 h。在烟熏的第1天和第15天在大鼠气管内滴入0.2 mL脂多糖,造模结束后,以肺组织出现明显病理损伤及肺功能下降为造模成功标准。将造模大鼠随机分为模型组(COPD)、虫草素低、中、高剂量组(Cor-L、M、H,10、20、50mg/kg,用0.5%的羧甲基纤维素钠制备成相应浓度的混悬液)[7]、阳性对照组(NAC,0.5g/kg,用0.5%的羧甲基纤维素钠制备成混悬液)[8],另设置正常培养的大鼠为对照组(NC)。造模后,Cor-L、M、H组、NAC组分别按照对应剂量灌胃Cor和NAC的0.5%的羧甲基纤维素钠混悬液,COPD组和NC组给予0.5%的羧甲基纤维素钠灌胃,一天一次,连续给药2周。

2 肺功能检测 末次给药24 h后,麻醉大鼠,固定于手术台,利用大鼠肺功能仪,检测肺功能指标,包含呼气峰流速(peak expiratory flow,PEF)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)。

3 样本采集 肺泡灌洗液:肺功能检测完毕后,麻醉大鼠,手术暴露气管,结扎右侧气管,使用注射器向左肺中注入PBS缓冲液,反复灌洗3次,合并灌洗液,离心分别收集上清和细胞沉淀备用。

肺组织:收集肺泡灌洗液完毕后,处死大鼠,手术暴露肺部,无菌完整剥离肺组织,用于肺部病理学变化检测、氧化应激、蛋白检测。

4 大鼠肺组织病理学变化检测 取方法3中保留的右肺中叶,PBS冲洗干净后,使用4%多聚甲醛固定后,脱水、浸蜡、包埋、切片后,使用HE染色试剂盒进行染色,光学显微镜下观察拍照,并进行病理学评分,评分标准[9](见表1)。

表1 肺组织病理评分标准

5 大鼠肺泡灌洗液白细胞种类观察 取方法3中保存的肺泡灌洗液中的细胞沉淀,加入PBS混匀后,取适量细胞悬液在显微镜下观察细胞数目。再取细胞悬液制备细胞涂片,染色后对巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞进行分类计数。

6 大鼠肺泡灌洗液炎性因子水平 取方法3中保存的肺泡灌洗液上清,根据ELISA试剂盒检测上清中TNF-α、IL-6和LTB4水平。

7 大鼠肺组织氧化应激指标检测 取方法3中保留的右肺上叶,液氮研磨后,匀浆离心,收集上清,根据微量法试剂盒检测肺组织中MDA、SOD、GSH-Px水平。

8 Western Blot检测蛋白表达 取方法3中保留的右肺下叶,剪碎,加入蛋白裂解液,超声破碎后,离心收集上清,BCA法测定蛋白浓度后,取适量蛋白上样、电泳、转膜、封闭,完成上述步骤后,洗膜,加入一抗p-ERK(1 ∶1 000)、ERK(1 ∶1 000)、p-JNK(1 ∶1 000)、JNK(1 ∶1 000)、p-p38(1 ∶1 000)、p38(1 ∶1 000)、C-jun(1 ∶1 000)、C-fos(1 ∶1 000),内参GAPDH(1 ∶1 000),4℃过夜后,洗膜加入二抗(1 ∶1 000),室温孵育1 h后,化学发光法显影,目的蛋白与内参的条带灰度值之比表示为蛋白相对表达量。

三、统计学分析

采用SPSS 26.0进行数据分析,计量资料用平均值±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两间比较采用SNK-q检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Cor对大鼠肺功能的影响

如(表2)所示,与NC组比较,COPD组大鼠肺功能指标PEF、FVC值均显著下降(P<0.05);与COPD组比较,Cor各剂量组、NAC组大鼠肺功能指标PEF、FVC值均显著上升(P<0.05);NAC组与Cor-H组比较,上述指标无显著差异(P>0.05)。

表2 各组大鼠肺功能指标比较

二、Cor对大鼠肺组织病理学变化的影响

如(图1)所示,NC组大鼠肺组织结构完整,肺泡轮廓清晰,未见炎性细胞浸润,肺泡间隔正常,大小正常;与NC组比较,COPD组大鼠肺组织结构破坏,肺泡间隔增厚,肺泡肿大,炎性细胞浸润明显,病理学评分显著升高[(0.26±0.04)分vs(5.45±0.63)分,P<0.05];Cor各剂量组随着药物浓度增大,肺泡肿大、炎性细胞浸润等病理现象逐渐减轻;NAC组呈现出与Cor-H组相当程度的病理损伤好转现象;与COPD组比较,Cor各剂量组、NAC组大鼠肺组织病理学评分显著降低[(5.45±0.63)分vs(4.69±0.55)分、(3.82±0.45)分、(2.71±0.39)分、(2.75±0.42)分,P均<0.05]。

图1 HE染色观察大鼠肺组织病理学变化(HE×200)

三、Cor对大鼠肺泡灌洗液白细胞数目的影响

如(表3)所示,与NC组比较,COPD组大鼠肺泡灌洗液中白细胞数目、中性粒细胞比率显著上升,巨噬细胞比率、淋巴细胞比率显著下降(P<0.05);与COPD组比较,Cor各剂量组、NAC组大鼠肺泡灌洗液中白细胞数目、中性粒细胞比率显著下降,巨噬细胞比率、淋巴细胞比率显著上升(P<0.05);NAC组与Cor-H组比较,肺泡灌洗液白细胞数目无显著差异(P>0.05)。

表3 各组大鼠肺泡灌洗液白细胞数目比较

四、Cor对大鼠肺泡灌洗液炎性因子水平的影响

如(表4)所示,与NC组比较,COPD组大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和LTB4水平均显著上升(P<0.05);与COPD组比较,Cor各剂量组、NAC组大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和LTB4水平均显著下降(P<0.05);NAC组与Cor-H组比较,肺泡灌洗液炎性因子水平无显著差异(P>0.05)。

表4 各组大鼠肺泡灌洗液炎性因子水平比较

五、Cor对大鼠肺组织氧化应激的影响

如(表5)所示,与NC组比较,COPD组大鼠肺组织中MDA含量显著上升,SOD、GSH-Px活性显著下降(P<0.05);与COPD组比较,Cor各剂量组、NAC组大鼠肺组织中MDA含量显著下降,SOD、GSH-Px活性显著上升(P<0.05);NAC组与Cor-H组比较,肺组织MDA、SOD、GSH-Px水平无显著差异(P>0.05)。

表5 各组大鼠氧化应激水平比较

六、Cor对大鼠肺组织中蛋白表达的影响

为了确定Cor对于是否通过MAPK信号来影响AP-1表达,检测了MAPK相关蛋白ERK、JNK、p38MAPK(p38)及其磷酸化水平,以及AP-1相关蛋白C-jun、C-fos蛋白表达。(如图2、表6)所示,与NC组比较,COPD组大鼠肺组织中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38、C-jun、C-fos蛋白表达显著上升(P<0.05);与COPD组比较,Cor各剂量组、NAC组大鼠肺组织p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38、C-jun、C-fos蛋白表达显著下降(P<0.05);NAC组与Cor-H组比较,肺组织MAPK、AP-1相关蛋白表达无显著差异(P>0.05)。

图2 大鼠肺组织中MAPK/AP-1信号通路蛋白条带

表6 各组大鼠肺组织中蛋白表达水平比较

讨 论

既往研究表明氧化应激,炎症反应,蛋白酶/抗蛋白酶失衡是COPD发病过程中的重要参与者,ROS过量会导致肺组织发生氧化应激,导致肺损伤的发生,促进肺组织炎症反应,使炎性细胞浸润肺部,释放大量炎症因子,肺功能也随之下降[10]。在本研究结果中,COPD大鼠肺组织出现肺泡肿大变形和炎性细胞浸润等病理学变化,并且肺功能下降,提示造模成功。

COPD的特征是气道慢性炎症,导致肺实质(肺气肿)破坏和肺功能下降,而活性氧过量会帮助COPD扩大炎症反应,长期炎症刺激又会导致炎症细胞(例如中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)浸润,然后释放多种炎性细胞因子如IL-6、TNF-α等加剧肺部炎症反应[11-12]。COPD通常与吸烟有关,香烟烟雾在COPD发生发展过程中,作为外源性的活性氧,使患者气道免疫失调,产生炎症[13]。ROS过量会导致COPD患者体内MDA大量产生,抗氧化物质如SOD、GSH耗尽,导致抗氧化系统失衡[14]。在本研究中,COPD组大鼠出现高氧化应激状态,MDA含量上升,SOD、GSH-Px活性下降;并且肺泡灌洗液中中性粒细胞水平显著上升,炎性因子TNF-α、IL-6和LTB4水平也显著上升,表现在HE染色中的结果是肺组织炎性细胞浸润明显,说明香烟和LPS联合使COPD大鼠产生了氧化应激,并且因此导致了炎性反应的加剧。Cor具有抗炎和抗氧化活性,研究发现它可以减轻棕榈酸(PA)诱导的细胞毒性,抑制活性氧ROS的产生和炎症反应[15]。在本研究中,经过不同剂量Cor处理后,大鼠肺功能上升,氧化应激状态得到改善,炎性细胞因子水平下降,中性粒细胞浸润减少,且高剂量Cor对COPD大鼠肺功能的保护作用显著优于低、中剂量Cor,说明Cor以剂量依赖性方式抑制了氧化应激和炎症反应,改善了COPD大鼠肺功能。

研究发现ROS介导细胞炎症通路如MAPK/AP-1通路激活参与炎性疾病的发展,在LPS诱导的小鼠急性肺损伤中,抑制MAPK/AP-1通路表达可以改善小鼠的肺部炎症[16]。MAPK的激活可以诱导炎症转录因子NF-κB、AP-1易位到细胞核中并增加TNF-α和IL-6的释放,MAPK包含多个成员,如细胞外调节激酶(ERK1/2)、C-Jun N末端激酶(JNK)、p38,AP-1包括C-Fos和C-Jun异二聚体,是介导多种生物过程的转录因子[17-18]。紫外线辐射产生的活性氧ROS是导致光损伤的主要因素,通过药物活性成分抑制MAPK/AP-1蛋白磷酸化水平,可以抑制炎性细胞因子的释放,改善紫外线辐射的皮肤光损伤[19]。NAC是一种在临床上用于治疗COPD的黏液溶解剂,可通过提高机体的抗氧化能力,减轻患者的痰黏液症状,改善肺功能,且NAC具有显著的抗炎活性[20-21]。研究显示,NAC能够通过阻断NF-κB信号通路抑制COPD大鼠肺组织炎症反应[22]。白学敏[23]等人发现,NAC能通过降低p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-ERK/ERK表达抑制MAPK信号通路,抑制气道黏液高分泌状态,改善COPD大鼠肺功能。在本研究中,给予NAC干预后,COPD大鼠肺损伤明显改善,这与以往的研究[22-23]结果一致;经过Cor处理后,各组大鼠肺组织MAPK/AP-1蛋白磷酸化水平下降,改善了香烟和LPS联合产生氧化应激,抑制了炎症反应,改善了COPD大鼠的肺损伤;且Cor对COPD大鼠肺损伤的保护作用与NAC相似,说明Cor具有治疗COPD的潜力。

综上所述,Cor可以抑制MAPK/AP-1信号通路,减轻炎症反应和氧化应激,改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织病理损伤。关于上游激活MAPK/AP-1信号通路以及该通路对下游炎性转录因子的调节机制,有待进一步研究。